4.1 Amplifikation der Gensonde p123 durch „Polymerasen-Ketten-Reaktion"
Um die Southern Blots durchführen zu können, mußte zunächst die Genprobe p123 amplifiziert werden, die den zu untersuchenden Promoter-Bereich sowie Exon 1 des RB-Gens erkennt. Dies geschah mit Hilfe der Primer Oli ( 5`-GCG AAT TCC CAA AAG GCC AGC AAG TGT CTA AC) und 1re ( 5`-GCG AAT TCG GCC CCT GGC GAG GAC GGG TC ) in der unter 3.2.1 beschriebenen Vorgehensweise.
Die Sonde p123 ist 923 bp lang. Um die Größe des PCR-Produktes bestimmen zu können, wurde ein j X-Marker mit aufgetragen, dessen Fragmente definierte Größen in der Gelelektrophorese aufweisen, nämlich:
1350 bp
1078 bp
872 bp
603 bp
310 bp
234 bp
194 bp
118 bp
Die amplifizierte Gensonde p123 muß also zwischen der 2. und 3. Bande des j X-Markers laufen. Dies ist in Abb. 11 zu sehen.
Abb.11 Amplifiziertes p123
1 j X-Marker
2 PCR-Produkt p123
Die amplifizierte p123-Probe wurde wie unter 3.2.1 beschrieben aus dem Agarosegel extrahiert und anschließend die Konzentration bestimmt (s.3.2.3). Nun stand p123 für die Hybridisierung zur Verfügung.
4.2 Methylierungssensitive Restriktion der Placenta-DNA
Die Vorversuche mit der Placenta-DNA wurden aus zwei Gründen durchgeführt. Der Gebrauch der empfindlichen methylierungssensitiven Restriktionsenzyme sollte etabliert werden, und zum anderen sollte die Placenta-DNA als Negativkontrolle dienen.
Die Placenta-DNA wurde dabei ebenso wie später die Tumor-DNA zunächst mit dem Restriktionsenzym SacI (Erkennungssequenz: GAGCTC) inkubiert, das aus dem ca. 180 kb und 27 Exon langen RB1-Gen ein 6,1 kb Fragment herausschneidet (Greger et al.1994).
Anschließend wurde diese DNA jeweils einmal mit den methylierungssensitiven Restriktionsenzymen SacII (Erkennungssequenz CCGCGG), SmaI (Erkennungssequenz CCCGGG) oder BssHII (Erkennungssequenz GCGCGC) verdaut. Dabei entstanden aus dem SacI-Fragment, wenn die Schnittstellen nicht methyliert waren, folgende kleinere Fragmente:
SacI: 6,1 kb
SacI und SacII 4.1 kb und 1,7 kb und 3 Fragmente <
200 bp (im Southern Blot nicht zu sehen)
SacI und SmaI 4,0 kb und 1,7 kb
SacI und BssHII 4,3 kb und 1,8 kb
Abb. 12 zeigt nun die geschnittene Placenta-DNA mit den o.g. Fragmentgrößen.
Abb.12: Methylierungssensitive Restriktion der Placenta-DNA
1 SacI und SmaI 5 nur Sac I
2 SacI und SacII 6 Sac I und SmaI
3 SacI und BssHII 7 SacI und SacII
4 nurSacI 8 SacI und BssHII
Der Verdau der Placenta-DNA wurde mit den gleichen Restriktionsenzymen unter verschiedenen Versuchsbedingungen getestet, daher liegen die Ergebnisse doppelt vor.
Diese Versuche zeigten also, wie unmethylierte DNA von den benutzten Restriktionsenzymen geschnitten wird. Die so ermittelten Fragmentgrößen dienten als Grundlage zur Beurteilung der Tumorproben.
4.3 Methylierungssensitive Restriktion der Osteosarkomzellinien-DNA
Vor der Untersuchung der eigentlichen Tumorproben sollten zunächst drei Zellinien in Bezug auf ihren Methylierungsstatus geprüft werden. Es handelte sich hierbei um die Zellinien TE 85, U2OS und KHOS.
Auch diese Zellinien wurden zuerst mit dem Restriktionsenzym SacI inkubiert und danach jeweils mit SacII, SmaI und BssHII geschnitten.
Abb.13 zeigt die Ergebnisse für die Zellinien-DNA:
Abb.13 Methylierungssensitive Restriktion von Zellinien-DNA
1-3 U2OS-DNA 1= BssHII, 2= SmaI, 3= SacII
4-6 TE 85-DNA 4= BssHII, 5= SmaI, 6= SacII
7-9 KHOS-DNA 7= BssHII, 8= SmaI, 9= SacII
10-12 Placenta-DNA 10= BssHII, 11= SmaI, 12= SacII
Zu sehen ist, daß sowohl bei der Placenta-DNA als auch bei der Zellinien-DNA das SacI-Fragment durch die methylierungssensitiven Restriktionsenzyme SacII, SmaI und BssHII in die o.g. kleineren Fragmente zerteilt wird. Dabei entstehen in allen Fällen jeweils gleiche Fragmentgrößen, was an der „Treppenbildung" im Southern Blot zu erkennen ist. Da die methylierungssensitiven Restriktionsenzyme geschnitten haben, sind die Erkennungssequenzen für diese Enzyme in der Promoteregion und Exon 1 in den untersuchten drei Zellinien nicht hypermethyliert.
4.4 Methylierungssensitive Restriktion der Osteosarkom-DNA
Der Gebrauch der methylierungssensitiven Restriktionsenzyme SacII, SmaI und BssHII wurde in Vorversuchen mit Placenta-DNA etabliert. Diese wurde unter den benutzten Bedingungen in klar definierte Fragmente geschnitten (s.4.2). Da die zur Verfügung stehende Menge an Patienten-DNA begrenzt war und das Restriktionsenzym BssHII nur eine Schnittstelle innerhalb der von p123 erfaßten Sequenz hat, wurde auf dieses Enzym bei der Untersuchung der Tumor-DNA verzichtet.
Beim Restriktionsverdau der Patienten-Tumor-DNA zeigten sich allerdings zunächst Restbanden des 6,1 kb-SacI-Fragments, obwohl gleiche Versuchsbedingungen herrschten, also gleiche DNA- und Enzymmenge, gleiche Temperaturen und Inkubationszeiten, etc. (s.Abb.14 und 15).
Die Ergebnisse sollen zunächst exemplarisch bei vier Patienten
gezeigt werden.
Abb.14 Unvollständige Restriktion der Patienten-DNA
mit SacII
1 Patient 13 2 Patient 20 3 Patient 5
4 Patient 16 5 Placenta-DNA, nur SacI
Abb.15 Unvollständige Restriktion der Patienten-DNA
mit SmaI
1 Patient 13 2 Patient 20 3 Patient 5
4 Patient 16 5 Placenta-DNA, nur SacI
Eine mögliche Interpretation dieser Ergebnisse wäre eine vorhandene Hypermethylierung in der Mehrzahl der untersuchten Tumoren.
Da dies angesichts der bisher publizierten Ergebnisse in Bezug auf den Methylierungsstatus des RB1-Gens sehr unwahrscheinlich war (Greger et al.1989, 1994, Sakai et al.1991, Ohtani-Fujita et al.1997), wurden die Versuche wiederholt. Es wurde die DNA-Menge von 5 m g auf 4 m g reduziert, die Enzymmenge von 50 U auf 60 U gesteigert und die Inkubationszeiten von SacII bzw. SmaI von 3 h auf 6 h erhöht. Die Ergebnisse nach Veränderung der Versuchsbedingungen sind in Abb. 16 und 17 gezeigt. Es handelt sich um die gleichen Patienten wie in Abb.14 und 15.
Die mit rDNA bezeichnete Bande entsteht durch den hohen Guanin- und Cytosinanteil der p123-Sonde, wodurch es zu einer Cross-Hybridisierung mit dem 28S rRNA-Gen kommt (Greger et al.1994).
Abb.16 Vollständige Restriktion der Patienten-DNA
mit SacII
1 Patient 13 2 Patient 20 3 Patient 5
4 Patient 16 5 Placenta-DNA, SacI und SacII 6 Placenta-DNA,
nur SacI
Abb.17 Vollständige Restriktion der Patienten-DNA
mit SmaI
1 Patient 13 2 Patient 20 3 Patient 5
4 Patient 16 5 Placenta-DNA, SacI und SacII 6 Placenta-DNA,
nur SacI
Es ist klar zu erkennen, daß das 6,1 kb-SacI-Fragment verschwunden ist, da die methylierungssensitiven Restriktionsenzyme an ihren Erkennungssequenzen schneiden konnten. Nach Verdau mit SacII läuft das kleinere Fragment wie nach den Vorversuchen mit Placenta-DNA zu erwarten (s.Abb.16), ebenso wie das SmaI-Fragment in Abb.17 (vgl.4.2).
Die untersuchten Tumoren, von denen hier vier exemplarisch dargestellt sind, zeigten somit keine Hypermethylierung in der untersuchten Promoter- und Exon 1-Region.
Nachdem das methodische Problem des unvollständigen Restriktionsverdaus beseitigt war, wurden weitere Tumorproben in Bezug auf ihren Methylierungsstatus untersucht. Die Ergebnisse mit SacII sind in Abb. 18, diejenigen mit SmaI in Abb. 19 gezeigt.
Abb.18 Vollständige Restriktion der Patienten-DNA
mit SacII
1 Placenta-DNA, nur SacI 2 Placenta-DNA, SacI und
SacII 3 Patient 1
4 Patient 7 5 Patient 11 6 Patient 12
7 Patient 22 8 Patient 25 9 Patient 26
Abb.19 Vollständige Restriktion der Patienten-DNA
mit SmaI
1 Placenta-DNA, nur SacI 2 Placenta-DNA, SacI und
SacII 3 Patient 1
4 Patient 7 5 Patient 11 6 Patient 12
7 Patient 22 8 Patient 25 9 Patient 26
10 Patient 27
Auch bei diesen Versuchen ist zu erkennen, daß im Vergleich zur Negativkontrolle, also zur Placenta-DNA, die nur mit SacI inkubiert wurde, das SacI-Fragment der Tumorproben durch SacII (Abb.18) bzw. SmaI (Abb.19) in weitere kleinere Fragmente geschnitten wird. Auch hier sind somit die Erkennungssequenzen dieser Enzyme nicht methyliert.
4.5 Methylierungssensitive Restriktion der Retinoblastom-DNA
Als Positivkontrolle diente ein hypermethyliertes RB1-Gen aus einem Retinoblastom. Auf der Abbildung 20 ist zu erkennen, daß jeweils bei der hypermethylierten Probe (Spur 1 und 3) die 6.1 kb SacI-Bande erhalten bleibt, obwohl mit den jeweils methylierungssensitiven Enzymen SacII und Sma1 inkubiert wurde. Dies zeigt, daß die entsprechenden Schnittstellen methyliert sind und die Enzyme dementsprechend nicht schneiden können. Die kleineren Fragmente in Spur 3 sind auf die von Greger et al. beschriebene inhomogene Methylierung in Bezug auf die SmaI-Schnittstellen zurückzuführen. Die zusätzliche 2.0 kb-Bande entsteht, wenn die 5`-SmaI-Schnittstelle im Gegensatz zu den beiden anderen SmaI-Schnittstellen nicht methyliert ist (s. Abb 8)
Auf der anderen Seite wird jeweils die aus einem Osteosarkom stammende Tumor-DNA (Spur 2 und 4) in kleinere Fragmente weitergeschnittten, so daß keine Methylierung der entsprechenden Schnittstellen vorliegt.
Abb.20 Positivkontrolle: Methylierungssensitive Restriktion
der Retinoblastom-DNA
1 Methyliertes RB1-Gen, SacI und SacII 2 Unmethyliertes
RB1-Gen, SacI und SacII
3 Methyliertes RB1-Gen, SacI und SmaI 4 Unmethyliertes
RB1-Gen, SacI und SmaI