1. Einleitung............................................................................................ 1

1.1 Wie Krebs entsteht.................................................................................. 1

1.1.1 Onkogene.................................................................................................................. 4

1.1.2 Tumor-Suppressor-Gene........................................................................................... 6

1.1.3 Andere an der Tumorentstehung beteiligte Faktoren................................................ 9

1.2 Das Retinoblastom-Gen (RB 1)............................................................................... 11

1.2.1 Funktion des RB 1-Gens............................................................................................ 12

1.2.2 Möglichkeiten der RB 1-Gen-Inaktivierung.............................................................. 15

1.3 Das Osteosarkom..................................................................................................... 16

1.3.1 Klinik und Diagnose................................................................................................. 16

1.3.2 Pathogenese.............................................................................................................. 18

1.3.3 Histologische Klassifikation..................................................................................... 19

1.3.4 Therapie und Prognose............................................................................................. 21

1.4. DNA-Methylierung und Tumorentstehung.......................................................... 24

1.4.1 Normaler DNA-Methylierungsstatus........................................................................ 24

1.4.2 Hypomethylierung und Tumorentstehung................................................................ 25

1.4.3 Hypermethylierung und Tumorentstehung............................................................... 26

1.4.4 DNA-Methylierung als therapeutischer Angriffspunkt............................................. 30

1.5 Hypermethylierung des RB-Gens.......................................................................... 31

2. Ziel und Fragestellung.............................................................................. 33

3. Material und Methoden............................................................................ 37

3.1 Material.................................................................................................................... 37

3.1.1 Patientenmaterial....................................................................................................... 37

3.1.2 Zellinien.................................................................................................................... 38

3.1.3 Gensonde p123 und Positivkontrolle......................................................................... 38

3.1.4 Verbrauchsmaterial................................................................................................... 38

3.1.5 Geräte........................................................................................................................ 40

3.2 Methoden................................................................................................................. 41

3.2.1 Amplifizierung p123................................................................................................. 41

3.2.2 DNA-Extraktion aus Tumorgewebe......................................................................... 43

3.2.3 Quantifizierung der extrahierten DNA-Menge......................................................... 44

3.2.4 Erste Restriktion der genomischen DNA................................................................. 45

3.2.5 Probegel geschnittener DNA.................................................................................... 46

3.2.6 Zweiter Restriktionsschnitt der DNA....................................................................... 47

3.2.7 DNA-Gelelektrophorese........................................................................................... 47

3.2.8 Southern Blot............................................................................................................ 48

3.2.9 Radioaktive Markierung von DNA nach der „Random Prime Labeling"-Methode.. 49

3.2.10 Hybridisierung und Autoradiographie...................................................................... 51

3.2.11 Dehybridisierung der Membran................................................................................ 52

4. Ergebnisse................................................................................................. 55

4.1 Amplifizierung der p123-Genprobe durch „Polymerasen-Ketten-Reaktion"... 55

4.2 Methylierungssensitive Restriktion der Placenta-DNA....................................... 56

4.3 Methylierungssensitive Restriktion der Osteosarkom-Zellinien-DNA............... 58

4.4 Methylierungssensitive Restriktion der Osteosarkom-DNA............................... 59

4.5 Methylierungssensitive Restriktion der Retinoblastom-DNA............................ 64

5. Diskussion.................................................................................................. 65

5.1 Amplifizierung der p123-Gensonde....................................................................... 65

5.2 Methylierungssensitive Restriktion der Placenta-DNA....................................... 66

5.3 Methylierungsstatus der Osteosarkom-DNA........................................................ 67

6. Zusammmenfassung................................................................................. 73

7. Literaturverzeichnis................................................................. 74

8. Abkürzungen............................................................................................ 86