3.1 Material
3.1.1 Patientenmaterial
Es wurden unbehandelte Primärtumoren, Tumoren nach Chemotherapie, Lokalrezidive und Metastasen von 27 Patienten untersucht, die in der COSS-Studie gemeldet sind.
Tabelle 1 zeigt eine Übersicht über die Patienten und über verschiedene Parameter ihrer Erkrankung.
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Geschl., Alter |
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Hirnmetastase |
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3.1.2 Zellinien
Es wurden folgende drei Zellinien untersucht:
-KHOS
-TE 85
-U2OS
3.1.3 Gensonde p123 und Positivkontrolle
Die Gensonde p123, die Primer Oli und 1re sowie die methylierte Retinoblastom-DNA, die als Positivkontrolle diente, wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt vom Labor Prof. Horsthemke, Universitätsklinik Essen.
Für die Amplifizierung der Probe mittels „Polymerase chain reaction" (PCR) wurden benutzt:
-Template p123 ( Prof. Horsthemke, Essen )
-Primer Oli und 1re ( Tib Molbiol, Berlin )
-PCR-Kit (Oncor, Gaithersburg )
3.1.4 Verbrauchsmaterial
a) Einwegmaterialien, Plastikartikel und Sterilfilter
-Becton-Dickinson (USA)
-Falcon-Laborartikel (Lübeck)
-Greiner Labortechnik GmbH (Frickenhausen)
-Kontron Instruments (Echingen)
-Nunc Delta Intermed (Wiesbaden)
-Schleicher & Schuell (Dassel)
-Treff Lab AG (Schweiz)
b) Chemikalien, Puffer, sterile Lösungen, Zellkulturmedien und Zusätze
-Bio Rad (München)
-Gibco/BRL (Eggenstein)
-Merck & Co. (Darmstadt)
-Pharmacia (Uppsala)
-Seromed/Biochrom (Berlin)
-Sigma Chemie GmbH (München)
Die Chemikalien hatten pro Analyse (p.Q.)-Qualität. Substanzen für die Arbeit mit Nukleinsäuren hatten den größtmöglichen Reinheitsgrad.
c) Nukleinsäuren
-Bakteriophagen-l -DNA (Pharmacia GmbH, Freiburg)
-Heringsperm-DNA (Pharmacia GmbH, Freiburg)
-Placenta-DNA (Oncor, Gaithersburg)
d) Restriktionsenzyme und Puffer
-Hind III (USB/Amersham Buchler GmbH & CoKG, Braunschweig)
-SacI (Boehringer, Mannheim)
-SacII (Boehringer, Mannheim)
-SmaI (Boehringer, Mannheim)
-BssHII (Boehringer, Mannheim)
e) Membranmaterial
-Gene Screen Plus Hybridization Transfer Membran (DuPont/NEN, Boston)
-3MM Blotting Papier (Whatman, Maidstone)
f) Kits
-Random Primers Labeling System (Gibco/BRL, Eggenstein)
-QIAEX-Kit (Quiagen)
g) Radioaktives Material
a -(32P)-dCTP (Amersham Buchler GmbH & CoKG, Braunschweig)
h) Filme und Verstärkerfolie
-X-Ray RX 100 (Fuji, Tokio)
-Polaroid Typ 665 (Polaroid Corp.,Cambridge)
-Verstärkerfolie X-Omatic (Kodak, New York)
3.1.5 Geräte
-Analysenwaage (Sartorius AG, Göttingen)
-Backofen (Omnilab)
-Beta-Counter „Betamatic" (Kontron Instruments, Echingen)
-Elektrophoresekammern (Bio Rad, München):
-„Mini-Sub-DNA-Cell"
-„Wide-Mini-Sub-DNA-Cell"
-„DNA-Sub-Cell"
-Elektrophorese-Netzgeräte (Desaga, Heidelberg)
-Handmonitor I (Wellhöfer Dosimetrie, Schwarzenbruch)
-Handmonitor II (Laboratorium Prof.Dr.Berthold, Wildbach)
-Heizblock „Eppendorf Thermostat 5320" (Eppendorf Gerätebau,Hamburg)
-Hybridisierungsofen I (Backofer, Reutlingen)
-Hybridisierungsofen II (Techne Hybridisiere HB1, Cambridge)
-Mikrowellengerät (Panasonic LTD, Osaka)
-Polaroidkamera (Polaroid Corp., Cambridge)
-Schüttler (Adolf Kühner AG, Basel)
-Schwenker (Edmund Bühler Laborgerätebau, Tübingen)
-Sterile Werkbank (Germfree Laboratories, Miami)
-UV-Lampe „Rad-Free" (Schleicher & Schuell, Dassel)
-Wasserbad (Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel)
-Zentrifugen (Eppendorf Gerätebau, Hamburg)
3.2.1 Amplifizierung p123
Für die Amplifizierung dieser Sonde mittels „Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR)" (Mullis et al. 1986) wurden die Primer Oli (5`- GCG AAT TCC CAA AAG GCC AGC AAG TGT CTA AC) und 1re ( 5`- GCG AAT TCG GCC CCT GGC GAG GAC GGG TC ) benutzt.
Die PCR wurde mit einem Gesamtvolumen von 20m l durchgeführt, das sich aus folgenden Bestandteilen zusammensetzte:
-1m l (100 pg) Insert DNA p123
-2m l 10xPCR-Puffer
-jeweils 0.4 m l (200 m M) dNTPs
-1m l (5 pmol) Primer Oli
-1m l (5 pmol) Primer 1re
-0,5m l (2,5%) DMSO
-0,25 m l (1.25 U) Taq-Polymerase
-12,65 m l steriles Wasser
Die Cycle-Bedingungen für die PCR waren dabei wie folgt:
Anlagerung 15 Sek. 52° C 35x
Synthese 30 Sek. 72° C
5 Min. 72° C 1x
Anschließend wurde das amplifizierte p123-Stück in einem 2% Infinity Enhancer-Agarose- Gel elektrophoretisch von den anderen Reaktionsbestandteilen getrennt. Dabei wurden 2,25 g Infinity Enhancer, 0,75 g Agarose und maximal 3ml Ethanol in 150 ml 1xBreindl-Puffer unter Zugabe von o,5m g/ml Ethidiumbromid gelöst. Zusätzlich wurde DNA aus einem Restriktionsverdau von Bakteriophagen-l -DNA mit der Restriktionsendonuklease j X als Kontrolle und Längenstandard aufgetragen.
Die Elektrophorese wurde bei 30 Volt über mehrere Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Anschließend wurde das Gel auf einem UV-Transilluminator betrachtet und mit einem Polaroid-Photo dokumentiert. DNA im Gel führt durch Komplexbildung mit Ethidiumbromid zu Fluoreszenz unter UV-Licht und kann daher beurteilt werden. Bei korrekter Elektrophorese waren die Fragmente der Bakteriophagen-l -DNA als deutliche Banden in definierten Abständen zueinander zu erkennen, so daß die Größe des PCR-Produkts zu ermitteln war.
Die p123-Bande wurde aus dem Gel herausgeschnitten und nach Anleitung des QIAEX-Kits extrahiert. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte wie unter 3.2.3. beschrieben.
3.2.2 DNA-Extraktion aus Tumorgewebe
Die mit DEP-H2O ausgekochten Zentrifugalröhrchen wurden mit einem 2,8 ml CsCl-Kissen gefüllt. Die Röhrchenwand darf dabei nicht mit CsCL benetzt werden, da sich sonst das CsCl mit der GTC-Lösung vermischt, in der die Zellen lysiert sind und sich somit kein Gradient bilden würde. Anschließend wurden die in GTC lysierten Zellen vorsichtig mit einer Pasteurpipette auf das CsCl gegeben.
Die Ultrazentrifugation erfolgte für mindestens 18 Stunden bei 22° C und mit 33000 Upm (Ultrazentrifuge TGA 50; Rotor TST 41.14).
An der CsCl-GTC-Phasengrenze bildet sich nach der Zentrifugation ein DNA-Ring. Zum Abernten der DNA wurde zunächst die GTC-Schicht mit den in ihr enthaltenen Proteinen und Fetten mit einer Pasteurpipette abgehoben und verworfen. Die DNA im Interphasering an der CsCl-Lösungsgrenze wurde abgehoben und in ein phenol- und etherbeständiges 10 ml Zenrifugenröhrchen überführt. Das Volumen wurde mit TE-Puffer auf 5 ml aufgefüllt. Dann wurde zweimal volumengleich mit einem PCI-Gemisch extrahiert und anschließend bei 20° C mit 1000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert (Heraeus Megafuge 1.0R, Rotor 3360). Hierdurch sollte versucht werden, Proteinreste und Salze von der DNA zu trennen.
Nun wurde jeweils die untere phenolische Phase abpipettiert und verworfen. Um verbliebene Phenolreste aus der wässrigen DNA-Phase zu extrahieren, wurde dreimal volumengleich mit CI ausgeschüttelt und bei 20° C mit 1000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. Auch hier wurde jeweils die untere Phase abgehoben und verworfen, während die obere wässrige DNA-haltige Phase mit einer Pasteurpipette in ein 50ml Zentrifugalröhrchen überführt wurde.
Durch Zufügen von einem Zehntel Volumen 3M Natriumacetat pH 6,0 und 2,5 fachen Volumen eiskalten absolutem Ethanol erfolgte die Fällung der DNA bei -20° C über Nacht. Anschließend wurde bei -10° C mit 3600 Upm 1 Stunde lang zentrifugiert. Das Sediment wurde zweimal mit 80%igem eiskalten Ethanol gewaschen und durch 10 minütige Zentrifugation mit 3600 Upm bei -10° C wieder sedimentiert. Danach wurde der Überstand verworfen, das DNA-Pellet in 400 m l sterilem Wasser gelöst und in ein Eppendorfhütchen überführt. Es schloß sich eine zweite Ethanolfällung wie oben beschrieben an.
Nach der zweiten Fällung wurde die DNA in der Eppendorf-Zentrifuge im Kühlraum bei 4° C mit 14000 Upm 30 Minuten lang sedimentiert, während der Überstand abgehoben und verworfen wurde. Nun wurde die DNA wiederum zweimal mit 80%igem eiskalten Ethanol für jeweils 10 Minuten gewaschen. Anschließend wurde das Ethanol abpipettiert und der Restalkohol auf dem Heizblock bei 56° C verdampft. Die DNA wurde je nach Pelletgröße in 50 bis 100m l TE-Puffer gegeben, für maximal 30 Minuten bei 56° C auf den Heizblock gestellt und über Nacht auf dem Roller im Kühlraum bei 4° C gelöst.
Die Quantifizierung der DNA erfolgte durch spektrophotometrische Bestimmung der optischen Dichte wie unter 3.2.3 beschrieben.
3.2.3 Quantifizierung der extrahierten DNA-Menge
Nach der Extraktion der genomischen DNA aus dem Tumorgewebe bzw. des amplifizierten PCR-Produkts p123 aus dem Gel wurde eine Mengenbestimmung über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm mit einem Photometer durchgeführt. Dies ermöglicht eine Konzentrationsbestimmung für Nukleinsäuren (Sambrook et al.1989).
Dazu wurde eine Verdünnung der DNA in Aqua bidest. von 1:300 hergestellt. Die Extinktion (E) der Verdünnung wurde in einem Photometer bei Wellenlängen von 260 nm (Nukleinsäuren) und 280 nm (Proteine) in einer Quarzküvette gegen Wasser gemessen.
Für DNA gilt: 1 OD260 = 50m g/ml DNA
daraus folgt: E260 x 50[m g/ml] x Verdünnung = DNA-Konzentration [m g/ml]
Über diese Konzentrationsbestimmung war dann die Berechnung der gewonnenen DNA-Menge möglich.
Die Reinheit der Probe wurde über den Quotienten E260/E280 ermittelt. Bei reinen DNA-Proben lag ein Quotient von 1,8 und größer vor, während ein Quotient < 1,7 auf Verunreinigungen mit Proteinen oder anderen Strahlen absorbierenden Substanzen hinwies.
3.2.4 Erste Restriktion der genomischen DNA
Zunächst wurde ein Restriktionsansatz mit der Endonuklease SacI angesetzt, dessen Gesamtvolumen 50m l betrug und der sich folgendermaßen zusammensetzte:
5m g DNA
10 mM Spermidin
50 U SacI
10 Vol% Puffer A oder L
Aqua bidest. ad 50m l
Dieser Restriktionsansatz wurde bei 37° C über Nacht inkubiert. Als Positivkontrolle wurden 5m g Placenta-DNA mitgeschnitten und um einen Längenstandard zu erhalten, wurden 5m g Bakteriophagen-l -DNA mit der Restriktionsendonuklease HindIII geschnitten, wobei DNA-Fragmente definierter Größe entstanden:
23130 bp
9420 bp
6557 bp
4361 bp
2322 bp
2027 bp
564 bp
125 bp
Von jeder Patienten-DNA wurden zwei Ansätze inkubiert, da nach dem SacI-Schnitt ein weiterer Restriktionsverdau sowohl mit SacII als auch mit SmaI erfolgen sollte.
3.2.5 Probegel geschnittener DNA
Nach dem Restriktionsverdau wurde mit Hilfe eines Probegels die Vollständigkeit der Reaktion überprüft. Dazu wurde aus jedem Ansatz ein Zehntel Volumen, also 5m l, entnommen und mit 5m l Breindl-Puffer und 1 m l Bromphenolblau versetzt. Dieser Ansatz wurde auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen, das mit 0,5m g/ml Ethidiumbromid versetzt war und bei 70 Volt wurden die DNA-Fragmente über 1 h getrennt. Gleichzeitig lief die l -DNA/HindIII geschnitten mit. Die Elektrophorese wurde gestoppt, wenn die Bromphenolblau-Bande etwa 4-5 cm gelaufen war. Es folgte die Beurteilung des Gels unter dem UV-Transilluminator und Dokumentation mit einem Polaroid-Photo.
Auf dem Probegel war nach erfolgter Elektrophorese vollständig
geschnittene DNA als gleichmäßig verteilte Spur zu erkennen,
während nicht oder nicht vollständig geschnittene DNA als deutliche
Bande in der Spur imponierte. Die Fragmente der Bakteriophagen-l
-DNA waren als deutliche Banden in definierten Abständen zueinander
zu erkennen (s.Abb.10).
Abb.10 Probegel geschnittener DNA
1-4 Patienten-DNA
5 Bakteriophagen-l -DNA,
geschnitten mit der Restriktionsendonuklease HIND III
3.2.6 Zweite Restriktion der DNA
Ergab das Probegel einen vollständigen SacI-Schnitt, so wurde ein Ansatz des jeweiligen Patienten mit SacII inkubiert, der andere Ansatz des gleichen Patienten mit SmaI.
Dabei wurde in die Ansätze mit Puffer L 50 U SacII pipettiert und der Ansatz bei 37° C 4 h inkubiert. SmaI wurde in die Tubes mit Puffer A gegeben, die bei 25° C ebenfalls 4 h inkubierten.
Anschließend wurde die genomische Elektrophorese durchgeführt wie unten beschrieben.
3.2.7 DNA-Gelelektrophorese
Die Elektrophorese genomischer DNA aus dem Restriktionsverdau als Vorbereitung zum Southern-Blot wurde als horizontale Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt (Sealey and Southern 1982).
Sie erfolgte in einem 0,8%igen Agarosegel, das mit 0,5m g/ml Ethidiumbromid versetzt wurde. In jeden Restriktionsansatz wurde ein Zehntel Volumen Bromphenolblau gegeben und anschließend wurde dieses Gemisch 10 min bei 68° C im Wasserbad inkubiert, um Einzelsträngigkeit der DNA zu erreichen. Nur in diesem Zustand ist die spätere Hybridisierung möglich.
Um die so erhaltenen DNA-Einzelstränge vor Reassoziation zu schützen, wurden die Ansätze sofort auf Eis gestellt und dann in die Taschen des mit Breindl-Puffer überschichteten Gels gegeben. Es folgte die Elektrophorese bei konstant 20 V und Raumtemperatur über Nacht. Sie wurde gestoppt, wenn die Bromphenolblau-Bande 9 cm erreicht hatte.
Das Gel wurde auf dem UV-Transilluminator photographiert und für den Southern Blot vorbereitet.
3.2.8 Southern Blot
Nach der Gelelektrophorese wurden die DNA-Fragmente auf eine Nylonmembran übertragen und darauf fixiert (Southern 1975, Meinkoth und Wahl 1984).
Dazu wurde das Gel nach erfolgter Dokumentation zunächst 15 min in einer 0,25 M HCL-Lösung geschwenkt, gefolgt von einer 30 minütigen Behandlung in einer Denaturierungslösung und einer anschließenden Neutralisierung für ebenfalls 30 min. Zwischen den einzelnen Lösungen wurde das Gel mit aqua bidest. gespült.
Nun wurde eine Blotkammer mit 20xSSC- Lösung gefüllt. Auf eine Plexiglasbrücke wurden zwei Lagen in 20xSSC getauchtes 3xMM Papier gelegt, dessen Enden in die Flüssigkeit eintauchten. Darauf wurde das Gel plaziert, auf das nun wiederum die positiv geladene Gene Screen Plus Membran, die ebenfalls in 20xSSC angefeuchtet wurde, gelegt wurde.
Auf die Membran wurden dann mehrere Lagen in 3xSSC angefeuchtetes Blotting-Papier, dann mehrere Lagen trockenes Blotting-Papier und abschließend eine dicke Schicht Saugpapier gelegt. Dieser Blotaufbau wurde mit einem Gewicht von ca. 1 kg auf einer Glasplatte beschwert.
Der Transfer der DNA in die Membran erfolgte durch den Flüssigkeitsstrom durch Gel und Membran über Nacht. Nach 12-20 h wurden die Papiere von der Membran entfernt, die Position der Taschen markiert und die Membran für 1 min in 0,4N NaOH-Lösung geschwenkt, gefolgt von einer ebenfalls 1 minütigen Neutralisierung.
Die Membran wurde luftgetrocknet, eingeschweißt und bei 4° C bis zur Weiterverwendung gelagert. Nach dem Transfer wurde die vollständige Übertragung der DNA aus dem Gel in die Membran durch Betrachtung des Gels auf dem UV-Transilluminator geprüft. Bei vollständiger Übertragung war keine Fluoreszenz durch DNA-Ethidiumbromid-Komplexe im Gel mehr zu beobachten.
3.2.9 Radioaktive Markierung von DNA nach der „Random-Prime-Labeling"-Methode
Zur Detektion komplementärer Sequenzen der geblotteten DNA-Proben wurde die DNA-Sonde p123 mit dem b -Strahler 32P radioaktiv markiert. Dazu wurde eine Markierungsmethode benutzt, die mit der 5`-3`-Polymeraseaktivität des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase 1 arbeitet (Feinberg and Vogelstein 1983). Dabei wurden nach Bindung von Hexanukleotiden zufälliger Sequenz („Random Primer") an ein p123-Template durch das Klenow-Fragment neue DNA-Abschnitte synthetisiert, die durch den Einbau radioaktiver Nukleotide markiert waren. Diese wurden dann nach Trennung der nicht eingebauten Nukleotide durch eine Säulenchromatographie für die Hybridisierung eingesetzt.
Es wurden 25 ng DNA-Sonde pro 50 m l-Ansatz markiert, der sich folgendermaßen zusammensetzte:
25 ng p123-Sonde
2 m l dATP (0,5mM)
2 m l dGTP (0,5 mM)
2 m l dTTP (0,5 mM)
15 m l Random-Prime-Puffer
5 m l [b -32P]-dCTP (50 m Ci)
1 m l Klenow Fragment (Polymerase)
aqua bidest ad 50 m l
Das aqua bidest und die Sonde wurden 5 min auf 100°C erhitzt und sofort auf Eis gestellt, um Einzelsträngigkeit der Sonde herzustellen und zu erhalten. Die anderen Zutaten wurden in obiger Reihenfolge dazugegeben und der Ansatz für 3 h bei 25° C im Wasserbad inkubiert. Durch Hinzufügen von 5 m l Stop-Puffer wurde die Reaktion gestoppt.
Durch diese Reaktion wird statistisch zu jeder einzelsträngig vorliegenden genetischen Information ein radioaktiv markierter Komplementärstrang synthetisiert (Feinberg and Vogelstein 1983).
Um die nicht eingebauten radioaktiven Nukleotide zu entfernen, wurde die Sonde durch eine Sephadex-Säule gereinigt. Dazu wurde eine Mobicol-Säule in einem Eppendorftube mit 1 ml Sephadex G 50 gefüllt und dreimal mit je 1 ml 4xSSPE äquilibriert. Nun wurde die radioaktiv markierte Sonde volumengleich mit Dextranblau versetzt und auf die Säule pipettiert. Die Sonde wurde 5 min mit 1500 Upm bei Raumtemperatur durch die Säule zentrifugiert und diese volumengleich mit 4xSSPE nachgewaschen.
Von der aufgefangenen, gereinigten und markierten Probe wurde 1m l entnommen und im Beta-counter gemessen. Nach den so ermittelten cpm/m l der Probe wurde errechnet, welches Volumen bei der anschließenden Hybridisierung zum Einsatz kam. Als Faustregel galt dabei, daß die Aktivität bei mindestens 1x106 cpm/ml Hybridcocktail liegen sollte (Feinberg and Vogelstein 1983).
3.2.10 Hybridisierung und Autoradiographie
Vor der eigentlichen Hybridisierung mit der markierten p123-Sonde erfolgte zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen an der zu hybridisierenden Membran eine Prähybridisierung, für die folgender Cocktail gemischt wurde:
4,0 ml 20xSSPE
4,0 ml 30% Polyethylenglycol (PEG)
0,5 ml 20% Sodiumdodecylsulfat (SDS)
0,5 ml 100x Denhardts Reagenz
0,2 ml Heringssperm-DNA
11,0 ml Aqua bidest.
Vor der Zugabe der heterologen Heringssperm-DNA muß diese 10 min gekocht und danach sofort für 3 min auf Eis gestellt werden.
Die Membran wurde in 2xSSC angefeuchtet und luftblasenfrei mit der DNA-Seite zum Röhreninneren in ein mit der o.g. Lösung gefülltes Hybridisierungsrohr gelegt. Die Prähybridisierung erfolgte bei 65° C für 4 h.
Anschließend wurde in das Rohr das vorher errechnete Volumen radioaktiv markierter DNA-Sonde gegeben. Zuvor muß diese 5 min gekocht und auf Eis gestellt werden, damit sie einzelsträngig wird und bleibt. Die Hybridisierung erfolgte ebenfalls bei 65° C über Nacht.
Nach Beendigung der Hybridisierung wurde die unspezifisch oder nicht gebundene Sonde von der Membran durch folgende Waschschritte entfernt:
2x 10 min in 2xSSC bei Raumtemperatur
2x 30 min in 2xSSC/0,1% SDS bei 55° C
2x 30 min in 1xSSC/0,1% SDS bei 60° C
2x 30 min in 0,5xSSC/0,1% SDS bei 65° C
Zwischen den einzelnen Schritten wurde mit dem Berthold-Handmonitor regelmäßig die Strahlung sowohl der jeweiligen Waschlösung als auch des Filters gemessen. In Abhängigkeit davon wurde das obige Protokoll individuell verändert. Der Waschvorgang wurde abgebrochen, wenn die Hintergrundaktivität des Filters etwa 10-20 cpm erreicht hatte. Der Bereich, in dem eine spezifische Hybridisierung mit der Sonde zu erwarten ist, sollte eine darüber liegende Aktivität aufweisen, nämlich ca. 50 cpm.
Um den Ort der spezifischen Bindung der radioaktiven DNA-Sonde sichtbar zu machen, wurden Autoradiographien erstellt. Dazu wurde der gewaschene Filter eingeschweißt und mit einem Röntgenfilm (Kodak, XAR 5) in eine Röntgenkassette gelegt und bei -80° C zur Autoradiographie über Nacht eingefroren. Nach der Entwicklung der Filme am nächsten Tag wurde entschieden, für welchen Zeitraum ein zweiter Film exponiert werden soll, um ein deutliches Bild aller Banden zu erhalten.
3.2.11 Dehybridisierung der Membran
Um einen bereits hybridisierten Filter mit einer weiteren Sonde hybridisieren zu können (z.B. zu Kontrollzwecken), muß er zunächst dehybridisiert werden. Dies gelingt allerdings nur, wenn die Membran im hybridisierten Zustand nie völlig getrocknet war, da die Bindung der Sonde dann irreversibel geworden ist.
Für die Dehybridisierung wurde die Membran für jeweils 30 min bei 42° C in folgenden Lösungen im Wasserbad geschüttelt:
200 ml 0,4 M NaOH
200 ml 0,1xSSC/0,1%SDS/0,2 M Tris-HCl pH 7,7
War mit dem Handmonitor keine Strahlung mehr meßbar, wurde die Membran eingeschweißt, ein Röntgenfilm (Kodak, XAR 5) aufgelegt und bei -80° C mindestens solange exponiert wie die letzte Filmexposition der Hybridisierung dauerte. War kein Signal mehr auf dem Film erkennbar, konnte mit der nächsten Hybridisierung begonnen oder die Membran bei 4° C zwischengelagert werden.
Bei unvollständiger Dehybridisierung kann die gleiche Waschung bei 55° C wiederholt werden.