1. Einleitung............................................................................................ 1
1.1 Wie Krebs entsteht.................................................................................. 1
1.1.1 Onkogene.................................................................................................................. 4
1.1.2 Tumor-Suppressor-Gene........................................................................................... 6
1.1.3 Andere an der Tumorentstehung beteiligte Faktoren................................................ 9
1.2 Das Retinoblastom-Gen (RB 1)............................................................................... 11
1.2.1 Funktion des RB 1-Gens............................................................................................ 12
1.2.2 Möglichkeiten der RB 1-Gen-Inaktivierung.............................................................. 15
1.3 Das Osteosarkom..................................................................................................... 16
1.3.1 Klinik und Diagnose................................................................................................. 16
1.3.2 Pathogenese.............................................................................................................. 18
1.3.3 Histologische Klassifikation..................................................................................... 19
1.3.4 Therapie und Prognose............................................................................................. 21
1.4. DNA-Methylierung und Tumorentstehung.......................................................... 24
1.4.1 Normaler DNA-Methylierungsstatus........................................................................ 24
1.4.2 Hypomethylierung und Tumorentstehung................................................................ 25
1.4.3 Hypermethylierung und Tumorentstehung............................................................... 26
1.4.4 DNA-Methylierung als therapeutischer Angriffspunkt............................................. 30
1.5 Hypermethylierung des RB-Gens.......................................................................... 31
2. Ziel und Fragestellung.............................................................................. 33
3. Material und Methoden............................................................................ 37
3.1 Material.................................................................................................................... 37
3.1.1 Patientenmaterial....................................................................................................... 37
3.1.2 Zellinien.................................................................................................................... 38
3.1.3 Gensonde p123 und Positivkontrolle......................................................................... 38
3.1.4 Verbrauchsmaterial................................................................................................... 38
3.1.5 Geräte........................................................................................................................ 40
3.2 Methoden................................................................................................................. 41
3.2.1 Amplifizierung p123................................................................................................. 41
3.2.2 DNA-Extraktion aus Tumorgewebe......................................................................... 43
3.2.3 Quantifizierung der extrahierten DNA-Menge......................................................... 44
3.2.4 Erste Restriktion der genomischen DNA................................................................. 45
3.2.5 Probegel geschnittener DNA.................................................................................... 46
3.2.6 Zweiter Restriktionsschnitt der DNA....................................................................... 47
3.2.7 DNA-Gelelektrophorese........................................................................................... 47
3.2.8 Southern Blot............................................................................................................ 48
3.2.9 Radioaktive Markierung von DNA nach der „Random Prime Labeling"-Methode.. 49
3.2.10 Hybridisierung und Autoradiographie...................................................................... 51
3.2.11 Dehybridisierung der Membran................................................................................ 52
4. Ergebnisse................................................................................................. 55
4.1 Amplifizierung der p123-Genprobe durch „Polymerasen-Ketten-Reaktion"... 55
4.2 Methylierungssensitive Restriktion der Placenta-DNA....................................... 56
4.3 Methylierungssensitive Restriktion der Osteosarkom-Zellinien-DNA............... 58
4.4 Methylierungssensitive Restriktion der Osteosarkom-DNA............................... 59
4.5 Methylierungssensitive Restriktion der Retinoblastom-DNA............................ 64
5. Diskussion.................................................................................................. 65
5.1 Amplifizierung der p123-Gensonde....................................................................... 65
5.2 Methylierungssensitive Restriktion der Placenta-DNA....................................... 66
5.3 Methylierungsstatus der Osteosarkom-DNA........................................................ 67
6. Zusammmenfassung................................................................................. 73
7. Literaturverzeichnis................................................................. 74
8. Abkürzungen............................................................................................ 86