Aus der

                                                         Medizinischen Kern- und Poliklinik

                                        Universitätskrankenhaus Hamburg-Eppendorf

                                                             Direktor: Prof. Dr. H. Greten

 

                                              Produktion von Migrationsfaktoren

                                              durch Cholangiocarcinomzellen des

                                                          Menschen in vitro

 

                                                                  Dissertationsarbeit

 

                                              zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

 

                                             dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg

 

                                        vorgelegt

                                                                                  von

                                                                   Isabel Elena Zühlke

                                                                         aus Lübeck

 

                                                                           Hamburg 1999

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Angenommen von dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg am: 11.Januar 2000

 

 

Gedruckt mit der Genehmigung des Fachbereichs Medizin der Universität Hamburg

 

 

 

 

 

 

 

 

Sprecher:                       Prof. Dr. H.-P. Leichtweiß

 

Referent:                        Priv. Doz. Dr. Dr. M. Steffen

 

Koreferent:                     Prof. Dr. H. Greten

 

 

 

 

 

 

 

Erklärung

 

 

Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe, Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich gemacht habe, und dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung zur Promotion beworben habe.

 

Reinfeld, den 13.09.99      

 

 

 

 

 

 

Danksagung

 

Herrn PD Dr. med. Dr. rer. nat. M. Steffen möchte ich für die Überlassung diesen interessanten Themas und seine vertrauensvolle Unterstützung danken. Besonderen Dank schulde ich Herrn Dr. U. Scherdin für seine herausragende Betreuung in allen Bereichen der Dissertationsarbeit.Ferner bedanke ich mich bei allen Mitarbeitern der Forschungsabteilungen von dem Physiologisch-Chemischen Institut und der Medizinischen Kern- und Poliklinik der Universität Hamburg für die gute Zusammenarbeit und freundliche Hilfsbereitschaft. An dieser Stelle möchte ich meinen Eltern herzlichen Dank sagen, die mich über die Jahre meiner schulischen und beruflichen Ausbildung bewundernswert unterstützt und mir das Medizinstudium an der Universität Hamburg ermöglicht haben. Gewidmet ist diese Dissertationsarbeit meiner gesamten Familie, insbesondere jedoch meinem Sohn Michel, der während der Zeit der Laborarbeit und des Schreibens ca. 40 cm gewachsen ist und mich stets „bei Laune gehalten“ hat.

 

 

 

 

Inhaltsverzeichnis

                                                                                                                                                                 

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1.                     Einleitung

2.                     Material und Methoden

2.1                   Zellinien/ Indikatorzellinien

2.1.1                               Zellinien mit bekannter oder  nicht bekannter Produktion von Migrationsfaktoren

2.2                   Zellkultur

2.2.1                Monolayer-Zellkulturen

2.2.2                Konditionierung von Zellkulturmedium

2.2.3                Zellfixierung und Färbung

2.2.4                Lösungen für die Zellkulturen

2.2.4.1                         Zellkulturmedium

2.2.4.2                         Trypsinlösung

2.2.4.3             PBS

2.3                   Scatterversuch

2.3                                     Scatterversuch nach Vorbehandlung des Überstandes mit Heparin-Sepharose

2.4                                     Titration von Kulturüberstand

2.6                   Fraktionierung von konditioniertem Kulturüberstand

2.7                   Boyden-Kammerversuch

2.8                   Invasionsversuch

2.9                   Proliferationsversuch

2.10                 HGF-ELISA

3.                     Ergebnisse

3.1                   Zellkulturüberstände der Cholangiokarzinomzellen enthalten Migrationsfaktoren

3.1.1                Scatterversuch mit MDCK- und NRK-Indikatorzellen

3.1.2                Scatterversuch mit HPAF-Indikatorzellen

3.2                   Titration der von den Cholangiokarzinomzellen produzierten Scatteraktivität

3.3                   Eingrenzung des Molekulargewichtes der Migrationsfaktoren

3.4                   Bei den von den Cholangiokarzinomzellen produzierten Migrationsfaktoren handelt es sich nicht um HGF/ Scatterfaktor

3.5                   Die Migrationsfaktoren aus den Kulturen der Cholangiokarzinom-zellen induzieren eine verstärkte Zellmigration

3.6                   Die Migrationsfaktoren der Cholangiokarzinomzellen.steigern nicht das invasive Wachstum von NRK-Indikatorzellen

3.7                   Heparin-Sepharose hemmt die chemotaktischen Eigenschaften.der von den Cholangiokarzinomzellen produzierten Migrationsfaktoren

3.8                   Steigerung der Proliferation von Indikatorzellen.durch den Kulturüberstand von EGI- Cholangiokarzinomzellen

4.                     Diskussion

5.                     Zusammenfassung

Literaturverzeichnis

Tabellenanhang

 

 

 

 

 

 

 

 

Abkürzungsverzeichnis

 

aFGF                                                  acidic Fibroblast Growth Factor

AMF                                                  Autocrine Motility Factor

ATX                                                   Autotaxin

CSF                                                    Cell-adhesive Scatter Factor

EDMF                                                Endothelioma-Derived Motility Factor

EDTA                                                Ethylendiamintetraacetat

EGF                                                    Epidermal Growth Factor

EGI-1                                                 Eppendorfer Gastrointestinal-Zellen-1

ELISA                                                Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay

FCS                                                    Fetal Calf Serum

HGF                                                   Hepatocyt-Growth-Factor

HCl                                                     Chlorwasserstoffsäure

HCO3-                                                Hydrogencarbonat

HH-16 cl.4                                         Hansestadt Hamburg-16 Clon 4

IGF-1                                                 Insulin-like Growth Factor-1

IL-1                                                    Interleukin-1

ISF                                                     Invasion Stimulating Factor

KCl                                                    Kaliumchlorid

kDa                                                    Kilodalton

KH2PO3                                             Kaliumdihydrogenphosphat

MAC-MF                                           Mammary Adenocarcinoma-derived Motility

 Factor

MDCK                                               Madin Darby Canine Kidney

MSF                                                   Migration Stimulating Factor

MW                                                    Mittelwert

MZ CHA 1-3                                     Mainzer Cholangiocarcinomzellen 1-3

NaCl                                                   Natriumchlorid

NaHCO3                                            Natriumhydrogencarbonat

NaH2PO2                                            Natriumdihydrogenphosphat

NRK                                                  Normal Rat Kidney

PBS                                                    Phosphate Buffered Saline Solution

PDGF                                                 Platelet-Derived Growth Factor

r.h.                                                      recombinant human

RNS                                                   Ribonukleinsäure

SF/HGF                                              Scatterfactor/ Hepatocyte Growth Factor

SF-IF                                                 Scatterfactor-Inducing Factor

SFL                                                    Scatterfactor-Like

STABW                                             Standardabweichung

TGF                                                    Transforming Growth Factor

TNF                                                   Tumornekrosefaktor

UpM                                                   Umdrehungen pro Minute

 

 

 

 

 

 

 

1. Einleitung

 

Die Motilität und Proliferation von Zellen ist die fundamentale Basis vieler physiologischer und pathologischer Lebensprozesse. Die Entwicklung eines Individuums setzt voraus, daß es entsprechend determinierte Zellen gibt, die proliferieren, sich differenzieren und in die Umgebung auswandern können. So wird beispielsweise die Befruchtung durch die Beweglichkeit der Spermien ermöglicht. Deren Migration muß zur Eizelle hingerichtet sein und wird durch positive Chemotaxis gewährleistet. Die embryonale Entwicklung beginnt mit einer raschen Proliferation der Zellen von der Morula bis zum Embryoblasten. In diesem Stadium lassen sich die Zellen schon in Ektoderm und Entoderm, aus denen sich später die Primitivorgane entwickeln werden, unterscheiden. Sämtliche Schritte werden durch die Zellteilung und Differenzierung ermöglicht. Außerdem muß Zellmigration in bestimmte Gewebe stattfinden, um neue Organe festzulegen. Bei der Knospung der embryonalen Extremitäten wandern mesodermale Zellen aus den Somiten in ihre neue Position. Dieses ist der Ausgangspunkt für z.B. Muskelgewebe (Bladt et al., 1995). Die Entwicklung des peripheren Nervensystems hängt von der Fähigkeit neuronaler Zellen ab, sich orientiert zu bewegen (Hynes and Lander, 1992). Die richtige Positionierung von sekretorischen Drüsenzellen und Pigmentzellen ist ein weiteres Beispiel für die Bedeutung der Zellmigration (Newgreen and Erikson, 1986). Nicht nur für die Entstehung, sondern auch für die Erhaltung eines Lebewesens ist die Zellmotilität von entscheidender Bedeutung. Die Migration und anschließende Proliferation von Fibroblasten und vaskulären Endothelzellen sind Grundlage der Wundheilung (Lauffenburger und Horwitz, 1996). Viele Gewebearten können alternde und sterbende Zellen so ersetzen und z.B. auch nach Schädigung ihre Funktionalität aufrechterhalten. Eine körperliche Beeinträchtigung durch eindringende Krankheitserreger wird ebenfalls durch Migration und Proliferation von Zellen des Immunsystems abgewehrt. Im menschlichen Körper kommt es durch Zytokine zu einer Entzündungsreaktion und gerichteten Leukozytenwanderung.

Von pathologischer Bedeutung ist hingegen die Rolle bei der Entstehung der Arteriosklerose. Die glatten Muskelzellen einer Arterie, die durch die elastische Lamina des Gefäßes migrieren, verengen zusammen mit anderen Faktoren als arteriosklerotische Plaques das Gefäßlumen (Goldberg et al., 1982). Die koronare Herzkrankheit, die periphere arterielle Verschlußkrankheit oder der cerebrale Insult werden als Folge auslöst.

Verliert ein Gewebe seine Funktionalität und seine Regulationsfähigkeit (Darnell et al., 1994), kann es zur Bildung maligner Tumoren, invasivem Wachstum und zur Induktion von Angiogenese kommen. Die Tumorzellen wandern aus dem Ursprungsgewebe in die Blut- und Lymphzirkulation, es kommt zur Metastasierung des Primärtumors (Folkman and Shing, 1992). Metastasierung hängt von der Fähigkeit zur Zellmigration und migrationsstimulierenden Faktoren in der unmittelbaren Umgebung des Primärtumors ab (Stetler-Stevenson et al., 1993). Der hauptsächliche Grund für die Krankheit und Tödlichkeit von Krebs liegt in der Metastasierung. Dieser Vorgang ist ein vielstufiger Prozeß:

1. Die Tumorzellen brechen in die eigenen oder Gastgefäße ein (Weiss et al., 1989).

2. Es erfolgt eine Anheftung an endotheliale oder subendotheliale Basalmembranen, Degradation von extrazellulärer Matrix und Tumorzellmigration (Auerbach et al., 1987; Mc Carthy et al., 1985; Juliano et al., 1987).

3. Nach der Invasion in das Blut oder die Lymphzirkulation (Liotta et al., 1974) wiederholt sich die Anheftung, Matrix-Degradation und Extravasation an einem anderem Ort im

Körper und von der anderen Seite des Gefäßes.

4. Die Tumorzelle muß sich in dem Parenchym des neuen Gewebes etablieren und dann proliferieren.

Amoeboide Motilität ermöglicht die Wanderung aus und in die Blutgefäße. Die Forschung über die Basismechanismen der Zellbeweglichkeit ist im Vergleich zu den Regulatoren dieser Vorgänge weit fortgeschritten. Für die Koordination und Modulation der komplexen Vorgänge sind inhibierende Faktoren ebenso wichtig wie stimulierende. Dieses sind meist Glykoproteine mit regulierender Wirkung für die Kontrolle z.B. des Wachstums oder der Differenzierung von Zellen, die Zytokine. Genannt seien hier beispielsweise die Interferone, die eine immunologische, antivirale, antitumorale und antiproliferative Aktivität besitzen. Diese Eigenschaften macht man sich in der Therapie von Hepatitis B und C, Haarzelleukämie und myeloproliferativen Erkrankungen zu Nutze. Die bisher bekannten 12 Interleukine ermöglichen die Kommunikation zwischen Lymphozyten, Granulozyten und Makrophagen. Sie werden teilweise ebenfalls in der Tumortherapie eingesetzt. Die Tumornekrosefaktoren können hämorrhagische Tumornekrosen verursachen, ohne gesundes Gewebe anzugreifen.

 

Zytokine hemmen oder stimulieren bei bestimmten Zielzellen neben vielen anderen Zellvorgängen die Migration. Unter diesen sind: Autokrine Motilitätsfaktoren (Liotta et al., 1986), Wachstumsfaktoren (Stracke et al.,1989; Jouanneau et al., 1991; Stoker and Gherardi,1991), Fragmente von extrazellulärer Matrix z.B. Kollagen (Aznavoorian et al., 1990; Mc Carthy et al., 1985), Fibronectin (Mc Carthy et al., 1986; Mensing et al., 1984), Laminin (Mc Carthy et al., 1985), Elastin (Yusa et al., 1989), proteolytische Fragmente der Komplementkaskade (Hamada et al.,1993), sowie die Migrationsfaktoren (Rosen et al.,1990; Weidner et al., 1990). Migrationsfaktoren haben ihre Hauptwirkung auf die Stimulation der Wanderung von Indikatorzellen, eine Wirkung auf die Proliferation ist nicht ausgeschlossen. Die Indikatorzellen können gerichtet oder ungerichtet, parakrin oder autokrin stimuliert werden. Das ist ein Unterscheidungsmerkmal für Migrationsfaktoren. Zu den autokrin stimulierenden Faktoren, d.h. die Produzentenzelle ist gleichzeitig die Zielzelle, gehören folgende Zytokine: Autocrine Motility Factor (Liotta et al.,1986), Migration Stimulating Factor (Grey et al., 1989), Autotaxin (Stracke et al., 1992), Endothelioma-Derived Motility Factor (Taraboretti et al., 1993) und Invasion Stimulating Factor (Stearns and Stearns, 1993). Das Molekulargewicht dieser Faktoren liegt zwischen 53 und 125 kDa. Die parakrin wirkende Gruppe der Faktoren, für die Produzentenzelle und Zielzelle unterschiedlich ist, setzt sich aus folgenden Zytokinen zusammen: Scatterfactor/ Hepatocyte Growth Factor (Stoker et al., 1987), Cell-adhesive Scatterfactor/ Ladsin (Miyazaki et al., 1993), Mammary Adenocarcinoma-derived Motility Factor (Scherdin and Hölzel, 1993) und Scatterfactor-Like Factor (Bellusci et al., 1994). Ihr Molekulargewicht liegt zwischen 50 und 1000 kDa.

 

Umfassend charakterisiert aus der Gruppe der autokrin wirkenden Faktoren sind das „Autotaxin“ (ATX), der „Autocrine Motility Factor“ (AMF) und der „Migration Stimulating Factor“ (MSF). Humane Melanomzellen der Linie A2058 produzieren das Autotaxin und den Autocrine Motility Factor. AMF wird außerdem von murinen und humanen Leukämie-Zellen (Stoker and Gherardi, 1991), humanen Fibrosarkom- und Melanomzellinien (Furlong et al., 1992), sowie von murinen und Ratten-Hepatom-Zellen synthetisiert. Autotaxin ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 125 kDa, der Autocrine Motility Factor hat ein Molekulargewicht von 64 kDa (Siletti et al.,1993). Beide stimulieren über die Bindung an einen Pertussis-sensitiven G-Protein-gekoppelten Rezeptor autokrin die Mobilität von A-2058-Produzentenzellen (Stracke et al., 1992). AMF stimuliert auto-, aber auch parakrin (Liotta et al., 1986). Der Rezeptor, an den AMF bei der parakrinen Stimulation bindet, ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 78 kDa, das an ein G-Protein gekoppelt ist (Watanabe et al., 1991). AMF wird als Tumormarker bei Patienten mit Blasenkarzinom im Urin bestimmt (Guirgius et al., 1988). Es wird vermutet, daß der Faktor in vivo für die Migration und Invasion der Produzentenzellen in das „gesunde“ umgebende Gewebe verantwortlich ist.

Der „Migration Stimulating Factor“ wird von fötalen humanen Fibroblasten der Haut produziert (Schor et al., 1988) und stimuliert die Migration und das invasive Wachstum der Produzentenzellen in eine Kollagenmatrix (Schor et al., 1985). Bei Patientinnen mit familiär gehäuftem oder sporadisch auftretendem Brustkrebs produzierten auch adulte humane Fibroblasten in vitro MSF (Schor et al., 1988). Auf MSF reagieren nicht nur die fötalen Fibroblasten, die auch den Faktor produzieren, sondern auch adulte Fibroblasten der Haut, die MSF nicht selbst sezernieren. MSF stimuliert also auch parakrin. Der MSF ist ein an Heparin-bindendes Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 70 kDa. Ein Rezeptor, der die Faktoraktivität vermittelt, konnte bislang nicht identifiziert werden. Die Wirkung wird durch eine Stimulation der Produktion einer hochmolekularen Klasse von Hyaluronsäure ausgelöst.

 

Unter den parakrin wirkenden Migrationsfaktoren sind SF/HGF und MAC-MF näher charakterisiert. Bei dem Scatterfactor handelt es sich um ein lösliches, hitzelabiles Protein, das erstmals aus Blutplättchen der Ratte isoliert wurde (Nakamura et al., 1986). Die molekularen Strukturen des Skatterfaktors (SF) sind mit denen des Hepatocyt Growth Factor (HGF) identisch (Gheradi and Stoker, 1990; Weidner et al., 1991). Der Faktor ist auch unter den Namen „Hepatopoetin A“ und „Mammary Growth Factor“ bekannt (Sasaki et al., 1994). Der Scatterfaktor ist ein basisches Glykoprotein, das durch Concanavalin A (Nakamura et al., 1989; Weidner et al., 1990), durch das Proteoglykan Heparin (Rosen et al., 1989) und das anionische Detergens Suramin (Steffen, 1996) gebunden werden kann. Diese Bindung führt zu einer Inhibierung der Scatterfaktor-Aktivität (Rosen and Goldberg, 1989).

Der Faktor wird in vivo hauptsächlich von fibroblastoiden Zellen z.B. von embryonalen Zellen der humanen Lungen-Fibroblastenlinie MRC-5 (Stoker et al., 1987) sezerniert (Rosen et al., 1991). Außerdem wurde SF/HGF-Expression in Endothelzellen der Lunge (Yanagita et al., 1992) und in den Kupfferschen Sternzellen der Leber (Noji et al., 1990), sowie der Milz und der Niere (Kono et al., 1992) nachgewiesen.

Die Expression des SF/HGF-Gens wird von verschiedenen Zytokinen beeinflußt. Einige Wachstumsfaktoren z.B. EGF inhibieren die Produktion des Faktors. TNF-, IL-1 oder Proteinkinase-C-aktivierende Phorbolester stimulieren dagegen die SF/HGF-Synthese bei humanen Haut-Fibroblasten (Matsumoto et al., 1992). Es besteht die Vermutung, daß die SF/HGF-Synthese durch parakrine Mechanismen geregelt wird (Rosen et al., 1994). Es gibt humane Tumorzellinien, die Faktoren produzieren, die die SF/HGF-Synthese bei Fibroblasten stimulieren. Dabei spielen offenbar Scatterfaktor-induzierende Faktoren (SF-IF) eine Rolle, von denen zwei bisher identifiziert wurden: Ein hitzestabiles Protein mit einem Molekulargewicht von< 30 kDa und ein hitzelabiles, dessen Molekulargewicht >30 kDa ist. Fibroblasten, die SF/HGF produzieren, können autokrin deren eigene Synthese anregen (Rosen et al., 1994).

Die Zielzellen für SF/HGF stammen aus den unteren Epithel- oder Endothelschichten und zeichnen sich durch eine hohe Teilungsaktivität und die Fähigkeit zur Differenzierung aus (Watt, 1989). In vitro sezernieren transformierte, fibroblastoide Zellen (Stoker et al., 1987) und Zellen der glatten Muskulatur (Rosen et al., 1989) den Scatterfaktor in das umgebende Milieu. Identifizierung und Charakterisierung des Proteins erfolgte aufgrund seiner motogenen Wirkung für die „normalen“ Cocker-Spaniel-Nierenzellen der Linie MDCK (Stoker et al., 1986). Geschlossene Kolonien epitheloider MDCK-Zellen werden durch die stimulierende Wirkung des Faktors aufgebrochen, und es kommt zu einer weitgehenden Auflösung des kolonialen Zellverbandes. Vereinzelt wachsende Epithel- und Endothelzellen beginnen ebenfalls unter dem Einfluß des Scatterfaktors zu migrieren (Stoker et al., 1987). Der Scatterfaktor kann chemokinetisch oder chemotaktisch wirken (Rosen et al., 1990). Neben der eindeutig motilitätsfördernden Wirkung des Faktors, besitzt das Protein auch mitogene, morphogene, cytostatische und cytotoxische Eigenschaften. Die Funktion des Scatterfaktors, die schon in pikomolaren Konzentrationen deutlich wird, variiert mit der Art der Zielzellen. Eine mitogene Wirkung des Scatterfaktors wurde für epitheloide, endotheliale Zellen und Melanocyten, nicht aber für fibroblastoide Zellen beschrieben (Stearns and Stearns, 1993; Furlong et al., 1992). Für humane Carcinom- und Melanomzellen konnten cytotoxische und cytostatische Eigenschaften des Scatterfaktors nachgewiesen werden (Higashio et al., 1990; Tashima et al., 1992). MDCK-Zellen, die auf einer Kollagenmatrix kultiviert werden, begannen unter dem Einfluß des Scatterfaktor invasiv zu wachsen und in die Kollagenmatrix einzuwandern (Weidner et al., 1990). Wurden die MDCK-Zellen dagegen in eine Kollagenmatrix eingegossen und mit SF/HGF behandelt, so wirkte der Scatterfaktor als Morphogen. Aus den Einzelzellen entstanden durch vielfache Teilungen Sphäroide, deren peripher gelegene Zellen sich unter dem Einfluß von SF/HGF organisierten und tubuläre, teils mehrfach verzweigte Ausläufer bildeten (Montesano et al., 1991). Die Kontrollen, die nicht mit dem Faktor behandelt wurden, wuchsen sphäroid ohne Ausläufer. Die gleiche Wirkung zeigte sich auch bei epitheloiden Brustdrüsenzellen (Soriano et al., 1995; Yang et al., 1995) und bei endothelialen Zellen (Bussolini et al., 1992). In vivo ist der SF/HGF offenbar sowohl an der Entwicklung des Gehirns (Jung et al., 1994) und der Skelettmuskulatur (Bladt et al., 1995), als auch bei der Organentwicklung von Niere (Karp et al., 1994), Leber (Schmidt et al., 1995) und Bauchspeicheldrüse (Otonsky et al., 1994) beteiligt. Auch bei der Regeneration von Leber (Selden et al., 1990; Noji, 1990), Niere (Kawaida et al., 1994), bei der Erneuerung von intestinalen Epithelien (Nusrat et al., 1994) sowie bei der Angiogenese (Grant et al., 1993; Bussolini et al., 1992) ist die Wirkung des Scatterfaktors nachweisbar. In der Klinik besitzt der SF/HGF prognostische Bedeutung beim Mammakarzinom (Yamashita et al., 1994). Die Konzentration an SF/HGF korreliert mit der Größe des Tumors, der Rückfallquote und der Überlebensrate der erkrankten Patienten (Yamashita et al., 1994).

Der Scatterfactor ist als primäres Translationsprodukt aus 728 Aminosäuren aufgebaut. Ein N-terminales Signalpeptid, bestehend aus 31 Aminosäuren, wird in einer ersten proteolytischen Reaktion abgespalten (Nakamura et al., 1989). Eine Serinprotease, die nach Gewebsschädigung aktiviert wird, katalysiert die zweite proteolytische Spaltung, die Auflösung einer Arginin-Valin-Bindung (Miyazawa et al., 1994). Die Spaltung dieser Prosequenz erfolgt extrazellulär, und es entstehen zwei durch eine Disulfidbrücke verbundene Polypeptidketten. Die aus 440 Aminosäuren (57 kDa) bestehende a-Kette enthält sogenannte Kringle-Domänen, vier Schleifen, die innerhalb der Kette durch Disulfidbrücken gebildet werden, und eine Haarnadelschleife (Nakamura et al., 1989). Die b-Kette besteht aus 223 Aminosäuren (30kD) und weist für einige Sequenzen Homologie mit Serinproteasen auf, ohne aber katalytische Aktivität zu besitzen (Nakamura et al., 1989). HGF und Plasminogen, die inaktive Vorstufe des proteolytisch wirkenden Enzyms Plasmin, haben eine signifikante Ähnlichkeit (38%) in ihrer Aminosäurensequenz. Beide Proteine haben Schleifen in ihren Ketten. Während HGF vier Kringle-Strukturen aufweist, hat Plasminogen fünf. Die Protease-Aktivität des Plasminogens wird bedingt durch eine Histidin-Serin-Verbindung, die bei dem Protein HGF einer Glutamin-Tyrosin-Verbindung entspricht (Nakamura et al., 1989). Eine biologisch aktive Variante des Scatterfaktors, isoliert von humanen Leukozyten und Fibroblasten, entsteht durch alternatives RNA-Spleißen (Furlong et al., 1992). Dabei kommt es auf der ersten Kringle-Domäne der schweren Kette zu einer Deletion, die fünf Aminosäuren umfaßt (Seki et al., 1990; Rubin et al., 1991). Es gibt ein weiteres durch alternatives mRNA-Spleißen entstandenes HGF, welches von humanen Fibroblasten isoliert wurde (Chan et al., 1991) und den Aminosäuren-Terminus sowie die ersten beiden Kringel-domänen enthält. Dieses so bezeichnete HGF/NK2 konkurriert mit HGF um seinen Rezeptor und inhibiert dadurch die spezifisch durch HGF induzierte Mitosesteigerung bei Zielzellen (Chan et al., 1991).

Die Wirkung des SF/HGF erfolgt nach Bindung an einen spezifischen, membranständigen Rezeptor (Ponzetto et al., 1994). Dieses heterodimere Protein ist das Produkt des c-met Proto Onkogens (Naldini et al., 1991; Bottaro et al., 1991). Es besteht aus einer a-Kette und einer b-Kette, hat ein Molekulargewicht von 190 kDa (Giordano et al., 1989). Die b-Kette des Rezeptors besteht aus 458 Aminosäuren und bildet die membranständige und die zytoplasmatische Domäne, die über Tyrosinkinaseaktivität verfügt (Giordano et al., 1989). Die a-Kette aus 926 Aminosäuren bildet den extrazellulären Bereich. Ein möglicher Signaltransduktionsweg beschreibt, daß nach der Bindung von SF/HGF das ras-Protein aktiviert (Graziani et al., 1993; Hartmann et al., 1994) und so die mitogenaktivierte Protein-Kinase-Kaskade beeinflußt wird (Halaban et al., 1992; Ponzetto et al., 1993). Am Ende der Signalübertragung steht die Auflösung der interzellulären Verbindungen und die Ausbildung von Pseudopodien. Das c-met Proto-Onkogen ist im humanen Genom auf Chromosom 7 (q21-31) lokalisiert (Park et al., 1987). In dieser Region sind häufig chromosomale Aberrationen, vor allem Deletionen, zu beobachten (Heim and Mitelman, 1987; Bieche et al., 1992). Eine Expression des c-met Gens findet in Hepatozyten, den Epithelien von Magen, Darm und Ovar, sowie im Stratum basale von Oesophagus und Haut statt. Eine erhöhte Expression des c-met Proteins wurde bei Schildrüsen-, Magen- und Kolonkarzinomen (DiRenzo et al., 1991, 1992, 1995) sowie bei Sarkomen beschrieben (Rong et al., 1993; Ferracini et al., 1995).

Wie der SF/HGF hat auch der von der Ratten-Mammakarzinomzellinie HH-16 cl.4 produzierte Faktor MAC-MF (Mammary Adenocarcinoma-derived Motility Factor) parakrine Wirkung auf die Zielzellen. Zu den Indikatorzellinien, die von dem produzierten Faktor zur verstärkten Migration induziert werden, gehören die humanen Adenokarzinomzellen der Linien MFM-223, T47-D, SKBR-7, MCF-7, die humanen Osteosarkomlinie MG-63, die humanen Lungenkarcinomlinie A549 (Gastmann,1995), die „normalen“ Rattennierenzellen der Linie NRK und die „normalen“ Cockerspaniel-Nierenzellen der Linie MDCK. Der Einfluß des konditionierten HH-16 cl.4-Überstandes ist nicht nur chemokinetisch, sondern auch chemotaktisch (Scherdin and Hölzel, 1993). Zellen der Rattenfibrosarkomalinie HH-16 cl.2/1 und der „normalen“ Fibroblastenlinie SDR, die beide keine geschlossenen Kolonien bilden, wurden zur verstärkten Migration stimuliert (Gastmann, 1995). MAC-MF führte zu keinen morphologischen Veränderungen bei MDCK-Indikatorzellen, die in ein Kollagenbett eingegossen sind (Gastmann, 1995). Der Faktor ist ein Protein mit einem Molekulargewicht zwischen 50 und 100 kD und verliert durch Hitze- und Trypsinbehandlung die motilitätssteigernde Funktion für die Indikatorzellen (Scherdin et al., 1995). Im Gegensatz zum Scatterfaktor bindet MAC-MF nicht an Concanavalin A, ist somit kein Glykoprotein. Außerdem wird die biologische Wirkung von dem Faktor nicht durch Heparin, TGF-b (Scherdin et al., 1993, ‘94, ‘95) oder Suramin (Steffen, 1996) gehemmt. MAC-MF und SF/HGF weisen in ihrer biologischen Aktivität als Migrationsfaktoren ähnliche Eigenschaften auf, sind aber nicht identisch.

 

Ziel der vorliegenden Arbeit war der Nachweis einer Produktion von Migrationsfaktoren durch humane Cholangiocarcinomzellen. Dazu wurden eine Reihe von Zellinien verwendet. Kulturüberstände dieser Zellinien, in die Faktoren sezerniert wurden, wurden in ihrer Wirkung auf verschiedene Indikatorzellinien getestet. Die biologischen Eigenschaften dieser Faktoren wurden mit denen der parakrin wirkenden Faktoren SF/HGF und MAC-MF verglichen, und Unterschiede zwischen den Faktoren werden herausgearbeitet. Die Überstände der Cholangiocarcinomzellinien, der MRC-5-Zellen, die den Scatterfactor produzieren, und der HH-16 cl.4- Zellen, die Mammary Adenocarcinoma-derived Motility Factor sezernieren, wurden in ihrem Einfluß auf die Motilität, Chemokinesis und -taxis, Proliferation, Invasivität, Hemmbarkeit der Motilität durch Behandlung des Überstandes mit Heparin-Sepharose von verschiedenen Indikatorzellen verglichen . Das Molekulargewicht der Faktoren wurde eingegrenzt und die Intensität der biologischen Aktivität der Überstände untersucht.

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Material und Methoden

 

2.1 Zellinien

 

2.1.1 Indikatorzellinien

Die Indikatorzellinien wuchsen in normalem Kulturmedium in geschlossenen Kolonien. In Gegenwart von Migrationsfaktoren kam es zum „Scatter-Phänomen“. Dabei wanderten die Zellen aus den Kolonien in die Umgebung.

In dieser Arbeit wurden folgende im epitheloiden Monolayer-Zellverband wachsende Zellen verwendet:

 

·      NRK-Zellen: „Normale“ Ratten-Nierenzellen (Abb.1B, Duc-Nguyen et al., 1966), freundlicherweise zur Verfügung gestellt von J.Billello, Abt. Molekularbiologie, Physiologisch-Chemisches Institut des Universitäts-Krankenhauses Eppendorf, Hamburg.

                                                                                                                        

·      MDCK(f)-Zellen: „Normale“ Cockerspaniel-Nierenzellen (Abb.1D); freundlicherweise erhalten von J. Jouanneau, CNRS, Lab. de Physiopathologie du Dev., Paris. Von der Zellinie MDCK gibt es die Untergruppen (f) und (d). Da in dieser Arbeit nur MDCK(f) als Indikatorzellinie benutzt wurde, wurde im weiteren Text auf den Zusatz (f) verzichtet.      

                                                                      

·      HPAF-Zellen: Humane Pankreas Adenocarcinomzellen (Abb.1F) aus Ascites gewonnen, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von PD Dr.Kalthoff und Dr. Röder, Arbeitsgruppe gastroenterologische Onkologie der Universitätsklinik Kiel.            

 

 

 

2.1.2 Zellinien mit bekannter oder nicht bekannter Produktion von Migrationsfaktoren

In dieser Arbeit wurde konditionierter Überstand von Cholangiocarcinomzellen unterschiedlicher Zellinien mit Kulturüberstand von Zellinien mit bekannter Produktion von Migrationsfaktoren verglichen.

Als Monolayer wachsende Zellinien mit bekannter Faktor Produktion:

 

·      HH-16 cl.4-Zellen: Mamma-Adeno-Carcinomzellinie der Ratte (Abb.1C, Hölzel et al., 1983) mit epitheloider, polygonaler Morphologie. HH-16 cl.4 produziert den Migrationsfaktor MAC-MF (Scherdin et al., 1995), freundlicherweise erhalten von Professor Hölzel, Abt. Molekularbiologie, Physiologisch-Chemisches Institut, Universitäts-Krankenhaus Eppendorf, Hamburg.           

 

·      MRC-5-Zellen: Embryonale humane Lungen-Fibroblasten (Abb.1E) mit spindelförmiger Morphologie sezernieren den Scatterfaktor/ HGF, käuflich erworben von Bio-Whittaker/Serva, Heidelberg (Cat.No.:72-211A).                                                         

 

Cholangiocarcinomzellinien mit nicht bekannter Faktorproduktion:

 

·      EGI-1-Zellen: Eppendorfer Gastro-Intestinalzellen (Abb.1A) humane Cholangio-Carcinomzellen etabliert durch G.Scherdin mit epitheloider, polygonaler Morphologie und erhalten von dem Physiologisch-Chemischen Institut, Universitäts-Krankenhaus Eppendorf, Hamburg.                                                   

 

·      MZ CHA-1-, -2- und -3-Zellen: Humane Gallengangscarcinomzellinien aus Ascites-Punktat gewonnen mit ephiteloidem, polygonalem Erscheinungsbild, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Kalthoff und Dr. Röder der Arbeitsgruppe gastroenterologische Onkologie der Universität Kiel.

 

·      RPMI 7451            -Zellen : Humane Gallengangscarcinomzellinie mit epitheloider, polyglonaler Morphologie, freundlicherweise erhalten von Dr. Kalthoff und Dr. Röder der Universität Kiel.

 

Abb.1. Epitheloide EGI-1-Cholangiocarcinomzellen (A) mit nicht bekannter Faktorproduktion, epitheloide Indikatorzellen der Linie NRK (B), epitheloide Kontrollzellen der Linie HH-16 cl. 4 (C) mit bekannter Faktorproduktion,  epitheloide MDCK-Indikatorzellen (D), fibroblastoide MRC-5-Kontrollzellen (E) mit bekannter Faktorproduktion sowie die epitheloiden HPAF-Indikatorzellen (F). Alle Zellen wuchsen als Monolayer-Zellkulturen (Phasenkontrast, 120x).

 

 

 

2.2 Zellkultur

 

2.2.1 Monolayer-Zellkulturen

Die Zellen wurden in Plastikflaschen oder auf Petrischalen (Nunc, Roskilde, Dänemark) bei 37°C, 5% CO2 und maximaler Luftfeuchte im Inkubator (Heraeus Holding, Hannover)

kultiviert. Die Zellkulturarbeiten erfolgten in einer sterilen Werkbank (Flow Laboratories, Bonn) mit vertikalem Luftstrom. In Abhängigkeit von der Mitoserate der Zellen wurde das Kulturmedium alle 2-3 Tage gewechselt, für die Versuche gesammelt und bis zum Gebrauch bei 4°C oder tiefgefroren bei -20°C aufbewahrt.

Bei Konfluenz wurden die Zellen mit 2,5-5 ml einer 0,05 %igen Trypsin/ 5 mM EDTA-Lösung in PBS (Trypsin von Gibco/ BRL 2,5 %, 10x lyophilisiert, Cat. 25095-019) im Brutschrank inkubiert. Je nach Zellart waren die Zellen nach 5-25 Min. vom Boden der Kulturgefäße abgelöst. Die Zellzahl wurde durch Absaugen entweder reduziert oder es wurden weitere Zellkulturflaschen mit einem Teil der Zellsuspension beschickt.

Zur Konservierung wurden die Zellen nach Entfernen des Mediums mit 0,05 %igem Trypsin/ 5mMol EDTA-Lösung in PBS vom Boden der Kulturgefäße abgelöst und dann in einem Zentrifugenröhrchen mit 10-12 ml Medium aufgefangen. In einer Beckmann-Zentrifuge (TJ 6, Rotor TH-4) wurde die Zellsuspension für 4 Min. bei 1200 UpM zentrifugiert und anschließend in einer 10% igen Glycerin/ Medium-Lösung resuspendiert. In 1ml Portionen wurden die Zellen in Kryoröhrchen (Nunc, Roskilde, Dänemark) transferiert und bei -80°C oder in flüssigem Stickstoff eingefroren.

 

 

2.2.2 Konditionierung von Zellkulturmedium

Das Kulturmedium enthält nach Inkubation der Zellen Stoffwechselprodukte, die für jede Zellinie charakteristisch sind. Wurden von den Zellinien Migrationsfaktoren sezerniert, reicherten sich diese nach 2-3 Tagen im Medium an und konnten geerntet werden. Zellreste wurden aus dem konditionierten Zellkulturüberstand mit Hilfe eines Filters (Minisart NML Porengröße 0,45 µm, Sartorius Göttingen) entfernt.

Für einige Versuche wurde Überstand von serumfreiem Medium benötigt. Das serumhaltige Kulturmedium wurde abgesaugt, der Zellrasen 2-3 mal mit serumfreien Medium gespült und anschließend für 24-48 Std. mit serumfreiem Medium inkubiert.

Durch regelmäßige Titrationen des Kulturüberstandes wurde die Konzentration an Migrationsfaktor abgeschätzt.

 

2.2.3 Zellfixierung und Färbung

Das Medium wurde aus den Kulturgefäßen abgesaugt, die Zellen 2-3 mal mit serumfreiem Medium gespült und mit 70 %igem Äthanol für 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen des Äthanols und Lufttrocknen war zu sehen, daß die Zellstrukturen fast vollständig erhalten geblieben sind.

Zur Anfärbung wurde den fixierten Zellen bei Raumtemperatur für 10-15 Min. eine 0,1 %ige Kristallviolettlösung (in 20 % Methanol) zugesetzt. Nach 2-3 maligem Spülen mit Aqua-bidest  luftgetrocknet werde das Präparat luftgetrocknet.

Die Zellpräparate wurden mit einem Phasenkontrast-Mikroskop (Leitz Diavert, Wetzlar) mit Photoaufsatz bei 125-facher Vergrößerung fotografiert (AGFA ORTHO, 25 ASA).

 

2.2.4 Lösungen für die Zellkulturen

2.2.4.1 Zellkulturmedium

Bei dem verwendetem Kulturmedium handelte es sich um ein modifiziertes MEM-Medium (basierend auf Earle’s Salzen) mit verdoppelter Menge an essentiellen und nicht-essentiellen MEM-Aminosäuren und Vitaminen (Hölzel et al., 1981). Der pH-Indikator Phenolrot verfärbt das Medium im Alkalischen intensiver rot, im Sauren gelb. Ansatz für 10 Liter:

·      400 ml                    essentielle Aminosäuren                       (Biochrom, Berlin)

·      200 ml                    nicht-essentielle aminosäuren    (Biochrom, Berlin)

·      200 ml                    MEM Vitamine, 100x              (Biochrom, Berlin)

·      87 g                        Earle`s Salze mit Phenolrot                  (Serva, Heidelberg)

·      1,1 g                       Na-Pyruvat                                         (Merck, Darmstadt)

·      10,25 g                   NaHCO3                                            (Merck, Darmstadt)

·      100 ml                    L-Glutamin, 200mM                            (Serva, Heidelberg)

·      8 %                        Fötales Kälberserum                           (Biospa, Hamburg)

Pro Liter wurden dem Kulturmedium zur Stabilisierung des pH-Wertes12-15 ml einer 8%igen Bicarbonat-Lösung, deren Puffersystem (H2CO3/HCO3-) an den CO2-Partialdruck gekoppelt ist, zugefügt.

 

2.2.4.2 Trypsinlösung

Um die Zellen vom Boden der Kulturgefäße zu lösen, wurde folgende Enzym-Lösung verwendet. Ansatz für einen Liter:

 

·      20 ml                      Trypsin, 2,5%, 10x, lyophilisiert           (Gibco/BRL)

·      10 ml                      EDTA 0,5 M/ pH-Wert 8                   (Merck, Darmstadt)

 ad 1l mit Phosphatpuffer PBS (pH-Wert 7,4).

 

2.2.4.3 PBS

Zur Verdünnung wasserlöslicher Substanzen und Spülungen von Zellrasen wurde Phosphat gepufferte Salzlösung verwendet. Ansatz für 5 Liter:

·      40 g                        NaCl                                                   (Merck, Darmsadt)

·      1 g                          KCl                                                    (Merck, Darmstadt)

·      7,2 g                       NaH2PO2                                                          (Merck, Darmstadt)

·     1 g                          KH2PO3                                             (Merck, Darmstadt)

 

 

2.3 Scatterversuch

 

Die Produktion von Migrationsfaktoren kann mit dem Scatterversuch (Stoker et Perryman, 1985) nachgewiesen werden. Wird Migration von Zellen induziert, wird das als „Scattering“ bezeichnet. Die Reaktion der Indikatorzellen auf unterschiedliche konditionierte Überstände wurde im Vergleich zu Kontrollen, die nur mit Medium inkubiert wurden, getestet.

In eine 6-Lochschale (Nunc, Roskilde, Dänemark) wurden in jede Vertiefung 2 ml einer Indikatorzellsuspension mit 5000 Zellen/ml ausgesät. Nach 24 Std. Inkubationszeit erfolgte ein Mediumwechsel. Einem Teil der Kulturen wurde zu 25 % konditionierter Überstand beigefügt, als Kontrolle wurden 2 Vertiefungen weiterhin mit 2 ml Medium beschickt. Während der folgenden 48 Std. Kultivationszeit wurden die Koloniestrukturen ständig unter dem Phasenkontrast-Mikroskop kontrolliert. Der Versuch wurde gestoppt, als die einzelnen Kolonien der Kontrollkulturen sich noch nicht berührten, so daß das Wachstum der Kolonien gut beurteilt werden konnte. Zur Auswertung wurden die Zellen in den Kulturschalen fixiert und die Kolonien der Ansätze mit konditioniertem Überstand der Cholangio-Carcinomzellinien mit denen der Kontrollen verglichen.

Bei Verwendung der NRK Indikatorzellen mußte dem Medium auf 20 ml noch 4 µl des synthetischen Glukokortikoids Dexamethason mit der Konzentration 10 mg/ml (Sigma, München) hinzugefügt werden. Das war wichtig um die Bildung geschlossener Kolonien zu fördern und die Proliferation der Zellen zu hemmen.

Zum Vergleich wurde recombinantes humanes HGF (25 µg, R&D Systems, Cat. Nr. 294-HG-025) im Scatterversuch eingesetzt. Das Produkt war steril filtriert, in 20 mM Natrium-Phosphat-Puffer und 0,35 M NaCl (pH 7,0) gelöst und lyophilisiert, es enthielt 50 µg Kälber-Serum-Albumin pro 1µg HGF. Vor dem Einsatz wurde das lyophilisierte HGF in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit 0,1 % Kälber-Serum-Albumin gelöst, die Konzentration durfte nicht weniger als 1µg Zytokin/ml Lösungsmittel betragen. Nach Angaben der Hersteller lag das Maximum der biologischen Aktivität bei einer Konzentration von 20,0-40,0 ng/ml.

 

2.4 Scatterversuch nach Vorbehandlung des Kulturüberstandes mit Heparin-Sepharose

 

Der Scatterfaktor/HGF wird von dem Proteoglykan Heparin gebunden. Diese Bindung führt zu einer Inhibierung der Faktor-Aktivität.

Für diesen Versuch wurde Heparin-Sepharose (0,6 mg/ml, Bio-Rad, München) benutzt, welche in Tris-HCL ( 0,02 %) gelöst war. Da dieses Lösungsmittel auf Zellen einen toxischen Effekt hat, wurde die Suspension vor Gebrauch 3-5 mal mit PBS gewaschen. Dazu wurde 1 ml der Suspension bei 1000 UpM für 5 Min. zentrifugiert (Beckmann-Zentrifuge), der Überstand abgesaugt und in 1 ml PBS resuspendiert. Nach mehrfacher Wiederholung dieses Vorgangs, wurden 5 ml von konditioniertem Überstand mit 250 µl Heparin-Sepharose bei 4°C Kühlung für 8-12 Std. vorsichtig geschüttelt. Danach wurde die Heparin-Sepharose bei 1000 UpM für 10 Min. abzentrifugiert, der behandelte Überstand steril filtriert und dann im Scatter- und Boyden-Kammer-Versuch eingesetzt.

 

2.5 Titration von Kulturüberstand

 

Zur Abschätzung der Konzentration von Migrationsfaktoren in den Kulturüberständen wurden die verschiedenen Überstände verdünnt, bevor sie im Scatterversuch eingesetzt wurden. Als Titer von Migrationsfaktoren eines eingesetzten Überstandes wurde die Verdünnung der Titrationsreihe definiert, bei der gerade noch eine „Scatteraktivität“ zu erkennen ist.

Für einen Doppelansatz wurde eine 24er-Lochplatte (Nunc, Roskilde, Dänemark) in jede Vertiefung mit 0,5 ml normalem Medium beschickt. Das erste Loch wurde als unbehandelte Kontrolle ausschließlich mit Medium und Zellen gefüllt. Das zweite Loch wurde nach dem Medium mit 0,5 ml konditioniertem Überstand beschickt. Es entstand ein Verdünnungs-Verhältnis von 2:1, nach gründlichem Mischen wurde 0,5 ml aus diesem Loch in das nächste transferiert. Dieser Vorgang wurde bis zu einer Verdünnung von 1:1024 fortgeführt. Auf die Verdünnungsreihe wurden die Zellen mit einer Konzentration von 3000 Zellen/ml ausgesät, d.h. es wurde 0,5 ml Zellsuspension in jede Vertiefung pipettiert. Je nach Indikatorzellinie konnte der Versuch nach 2-3 Tagen Inkubationszeit ausgewertet werden. Die Kolonien der Kontrolle wurden mit den behandelten Ansätzen verglichen.

 

2.6 Fraktionierung von konditioniertem Kulturüberstand

 

Um das Molekulargewicht der Überstand-Produkte, die die „Scatteraktivität“ auslösen, eingrenzen zu können, wurde der konditionierte Überstand durch Filter fraktioniert. Das Prinzip dieser Fraktionierung besteht aus der Druckfiltration durch eine poröse Membran, die für Moleküle unter 50 bzw. unter 100 kDa durchlässig ist.

 

 

 

 

Abb. 2. Centriprep-Filtrations-Röhrchen zur Fraktionierung nach Molekulargewicht.

 

 

 

Die Probenbehälter eines Centriprep-Röhrchens (Centriprep-50 Concentrator, Amicon) wurden mit ca. 12-15 ml serumfreiem Medium oder bereits konditioniertem serumfreien Kulturüberstand gefüllt. Damit die Poren der Membran nicht verklebten, wurde serumfreies Medium benutzt. Mit Hilfe der porösen Membran wurden die Moleküle des Kulturüberstandes in eine Fraktion >50 kDa und eine Fraktion <50 kDa getrennt. Dazu wurde das Röhrchen für 15-20 Min. bei 1000 UpM gekühlt zentrifugiert (Beckmann-Zentrifuge). Die >50 kDa Fraktion, die im Probenbehälter verblieben war, wurde auf das ursprüngliche Volumen aufgefüllt, da eine Konzentrierung des Faktors nicht gewünscht war. In dem Filtratkollektor des Röhrchens befand sich die Fraktion <50 kDa. Analog wurde ein Centriprep-Röhrchen (Centriprep-100 Concentrator, Amicon) beschickt, welches die Moleküle in eine Fraktion >100 kDa und eine Fraktion <100 kDa trennte. Alle Fraktionen wurden sterilfiltriert und anschließend im Scatterversuch verwendet.

Es wurde 40-50 ml serumfreier Überstand von einer Zellinie auf diese Weise fraktioniert, um mehrere Parallelansätze im Scatterversuch machen zu können.

 

 

 

2.7 Boyden-Kammer-Versuch

 

Dieser Versuch ist eine Nachweismethode für den Einfluß eines Migrationsfaktors auf die gerichtete bzw. ungerichtete Migration von Zellen. Die Boyden-Kammer besteht aus zwei Reservoirs, die durch eine poröse Membran (Porengröße: 8 µm) getrennt sind. Diese Membran stellt für die Zellen eine Barriere dar, die überwunden werden kann. In Gegenwart von Migrationsfaktoren kann die Membran vermehrt durchwandert werden.

Der Boyden-Kammer-Versuch kann auf zwei verschiedene Arten durchgeführt werden. Beim chemokinetischen Ansatz wurde im unteren und oberen Reservoir die gleiche Konzentration an Überstand eingesetzt, während beim chemotaktischen Ansatz nur das untere Reservoir beschickt und so für einen Gradienten gesorgt wurde.

 

                                                                                                                                                                                          

Abb. 3. Boyden-Kammer

 

 

Pro Einsatz einer 6-Loch-Schale (Costar Transwell TM, Cambridge, Ma, USA) wurden 2x105 Indikatorzellen in 1,5 ml Medium ausgesät. Für den chemotaktischen Versuch wurde in das untere Reservoir 2,5 ml Medium pipettiert, dem zu 20 % zellfreier konditionierter Kulturüberstand hinzugefügt war. Die Kontrollen wurden ausschließlich mit frischem Medium kultiviert.

Analog wurde im chemokinetischen Ansatz auch der Einsatz mit 20 % Überstand beschickt. Nach 24 Std. Inkubationszeit wurde das Medium abgesaugt und 0,8 ml Trypsinlösung in das untere Reservoir zur Ablösung der Zellen von der unteren Membran pipettiert. Nach 20 Min. wurden die Zellzahlen zur Auswertung in der Neubauer-Zählkammer ermittelt und die Zellzahlen der Kontrolle mit den behandelten Ansätzen verglichen.

 

2.8 Invasionsversuch

 

Als Modifikation zum unbeschichteten Boyden-Kammerversuch kann die Membran des Einsatzes mit Kollagengel beschichtet werden. Mit diesem Versuch kann invasives Wachstum nachgewiesen werden. Dabei induzieren die Migrationsfaktoren bei den Indikatorzellen die Bildung einer Kollagenase, die es den Zellen ermöglicht durch die Kollagenschicht zu migrieren.

Zunächst wurde die Kollagenbeschichtung vorbereitet. Das Kollagengel bestand aus 7 Teilen Kollagenlösung (3mg/ml in 0,2% Essigsäure / Kollagen Typ 1, isoliert aus Rattenschwanz, Boehringer Biochemica, Mannheim Nr.1179179), 2 Teilen Medium (pH 7,4, 5-fach konzentriert) und 1 Teil Hepes-Puffer (0,2M, pH 7,3). Während der Verarbeitung mußte das Kollagengel ständig auf 4°C gekühlt werden, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern. Nach gründlichem Durchmischen der Kollagenmischung wurde jede Membran der Einsätze mit 200 µl beschichtet, das entsprach 20 µl pro cm2. Nach 2 Std. Inkubationzeit bei ca. 37°C war das Gel soweit ausgehärtet, daß die Kammern analog dem Boyden-Kammerversuch mit Zellen beschickt werden konnten. Die Auswertung erfolgte nach 5 Tagen durch Zählen der insgesamt migrierten Zellen.

 

2.9 Proliferationsversuch

 

Dieser Versuch soll den Einfluß von Migrationsfaktoren bzw. eines konditionierten Überstandes auf die Mitoserate von Indikatorzellinien zeigen. Hierzu wurden Indikatorzellen mit 2 ml Medium in jeweiligen Zweifach-Ansätzen in einer 6-Loch-Platte (Nunc, Roskilde, Dänemark) in Gegenwart von 20% Überstand ausgesät und kultiviert. Die Zellkonzentration betrug 5000 Zellen/ml, d.h. in jeder Vertiefung befanden sich 10000 Zellen. Die Kontrolle wurde ohne konditioniertes Medium inkubiert. Nach jeweils 2 Tagen Kulturdauer wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. Nach 2 Tagen Inkubationszeit wurden in jeweils einem der Zweifachansätze die Zellen mit 1 ml 0,05 % Trypsin/ 5 mM EDTA-Lösung vom Boden gelöst, in einer Neubauer-Zählkammer gezählt und anschließend der Mittelwert der angewachsenen Zellen bestimmt. Mit dem Zweitem der Ansätze wurde nach 4 Tagen Inkubationszeit ebenso verfahren.

Zur Auswertung des Versuchs wurden die Zellzahlen der Kontrollen mit denen der Ansätze mit 20 %igem konditioniertem Medium verglichen.

 

2.10 HGF-ELISA

 

Der Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay ermöglicht mit der “sandwich-enzyme-immunoassay“-Technik eine spezifische quantitative Bestimmung des HGF-Gehalts einer Probe.

Der Assay (Human HGF Immunoassay, R&D Systems, Minneapolis Cat. No. DHG00) wurde auf einer Mikrotiterplatte (96 Vertiefungen), die spezifische monoklonale HGF-Antikörper am Boden gebunden hat, ausgeführt. Jede Vertiefung wurde mit 150 µl Verdünnungsmittel beschickt. 50 µl einer Standardreihe des gelieferten r.h.HGF und der zu untersuchenden Proben wurden in die Vertiefungen einpipettiert. Bei Raumtemperatur wurde die Platte genau 2 Std. inkubiert. Innerhalb dieser Zeit wurde vorhandener Scatterfaktor gebunden. Dann mußte der Ansatz mit einer speziellen Waschlösung viermal gewaschen werden, um ungebundene Proteine zu entfernen. Jeweils 200 µl eines polyklonalen Enzym-gebundenen HGF-spezifischen Antikörpers (mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert, in Konservierungsmittel) wurden hinzugegeben. Vorhandenes HGF, das durch die erste Inkubationszeit auf der Platte immobilisiert wurde, wurde wie ein „sandwich“ gebunden. Nach 1,75 Std. Inkubationszeit wurde der Ansatz erneut viermal gewaschen, um die überschüssigen Antikörperenzyme zu entfernen. Folgend wurden 200 µl einer Substrat-Lösung (stabilisiertes hydrogenes Peroxid/ chromogenes Tetramethylbenzidin) zugegeben. Diese Substratlösung bewirkte eine Farbentwicklung proportional der HGF-Menge, welche im ersten Schritt gebunden wurde. Die Färbung schlug von farblos zu blau um. Nach einer halben Stunde wurden 50 µl einer Stopp-Lösung (Schwefelsäure) hinzugegeben, Die Färbung änderte sich von blau zu gelb. Nach Zugabe dieser Lösung blieben 30 Min. zur Auswertung des Versuchs. Mit Hilfe eines Photometers (MEDGENIX Diagnostics / V max. EASIA READER) wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm die optische Dichte gemessen und eine Kurve gegen die HGF-Konzentration in den Standardansätzen aufgezeichnet. Durch das Vergleichen der optischen Dichte der Proben mit der Standard-Kurve erhielt man die HGF-Konzentration der unbekannten Proben. Die Konzentration der Standard-Kurve reichte von 0 bis zu 8000 pg/ml. Die Sensitivität des Assays lag bei 40 pg/ml, der Variabilitätskoeffizient bei 7%.

 

 

 

Abb.4. Standard-Kurve der HGF-Konzentrationen von 125 pg/ml-8000 pg/ml gegen die optische Dichte gemessen bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Photometer

 

 

 

 

 

 

Ergebnisse

 

3.1 Zellkulturüberstände der Cholangiocarcinomzellen enthalten      Migrationsfaktoren

 

3.1.1 Scatterversuch mit MDCK- und NRK-Indikatorzellen

 

Zellmigration kann im Scatterversuch nachgewiesen werden. Dazu werden Indikatorzellen mit epitheloider Morphologie benutzt, die in geschlossenen Kolonien wachsen, wenn sie mit frischem und unbehandelten  Medium inkubiert werden. In Gegenwart von Scatterfaktoren lösen sie ihren Zellverband und migrieren. Zellinien mit einer gesicherten Produktion an Migrationsfaktoren werden als Positivkontrolle verwendet. MRC-5-Zellen sezernieren HGF bzw. den Scatterfaktor in das Kulturmedium, und HH-16 cl.4-Zellen produzieren MAC-MF. Von diesen Faktoren ist bekannt, daß sie bei MDCK-und NRK-Indikatorzellinien das „Scatterphänomen“ auslösen können.

Die MDCK-Zellen wurden mit Medium oder mit Medium, dem zu 20 % konditionierter Überstand zugesetzt war, in 6-Loch-Schalen ausgesät. Die Ansätze wurden ständig mit einem Lichtmikroskop kontrolliert. Die Auswertung erfolgte zu einem Zeitpunkt, an dem die Kontrollen in geschlossenen Kolonien ohne Kontakt zueinander wuchsen. Zeigten die Indikatorzellen nach Zugabe von konditioniertem Medium einer Zellinie keine „Scatteraktivität“, wurde der Überstand vor der nächsten Untersuchung 6-fach konzentriert. Diese Vorgehensweise sollte die Wahrscheinlichkeit senken, daß diese Zellen einen Migrationsfaktor in kleinen Mengen ohne sichtbaren Effekt im Scatterversuch produzierten.

MDCK-Zellen wuchsen unbehandelt im zusammenhängenden Zellverband (5A), in dem die einzelnen Zellen von epitheloider Morphologie waren. In Gegenwart von MRC-5-Überstand zeigte sich eine deutliche Auflockerung des Zellverbandes und eine Veränderung der einzelnen Indikatorzellen von einem epitheloiden  in einen fibroblastoiden Zelltyp (5B). In Gegenwart von Überständen der Gallengangscarcinomzellinien EGI-1 (5C), RPMI, MZ CHA-1 und MZ CHA-2 (ohne Abbildung) verließen nur einzelne Zellen aus dem Randbereich der Kolonien den Zellverband. Diese Zellen veränderten ihre Morphologie in ein fibroblastoides Zellbild. Die Grundstruktur der Kolonien blieb erhalten. Eine eindeutige Unterscheidung der Intensität der Aktivität dieser Kulturüberstände konnte nicht gemacht werden. Durch Überstand der Gallengangscarcinomzellinie MZ CHA-3 wurde bei MDCK-Zellen weder eine „Scatteraktivität“ noch eine Veränderung der Morphologie induziert (5D). Die Gegenwart von Überstand der Ratten-Mammacarcinomzellinie HH-16 cl.4 (5E) bewirkte ebenso wie der Überstand der humanen Lungenfibroblasten MRC-5 (5B) eine stärkere Auflockerung des Zellverbandes. Nicht nur die randständigen Indikatorzellen wurden spindelförmig und langgestreckt, sondern auch die Zellen, die weiter in der Koloniemitte lagen veränderten ihre Morphologie und zeigten eine deutlich stärkere Neigung, auf die Überstände mit „Scattering“ zu reagieren. Eine vollständige Vereinzelung der Zellen konnte aber auch bei diesen zwei Positivkontrollen nicht erreicht werden. Zusammenfassend induzierten alle konditionierten Überstände außer dem Überstand einer Gallengangscarcinomzellinie (MZCHA-3) bei den MDCK-Zellen Scatteraktivität (Tab. 1).

 

 

 

Abb.5. Scatterversuch mit der Indikatorzellinie MDCK ohne Zugabe von konditioniertem Kulturüberstand als Negativkontrolle (A), in Anwesenheit von MRC-5-Überstand als Positivkontrolle (B), mit Überstand der Gallengangscarcinomzellinien EGI-1 (C) und MZ CHA-3 (D) sowie der Ratten-Mamma-Adenocarcinomzellinie HH-16 cl.4 (E). Die Negativkontrolle wurde ausschließlich mit Medium und Zellen beschickt. Der Anteil des Zellkulturüberstandes in den behandelten Ansätzen betrug jeweils 20%. Nach 2 Tagen Inkubationszeit wurde der Versuch gestoppt und fixiert. EGI-1-Überstand (C) bewirkte ein vermehrtes Lösen der Zellen aus dem Randbereich der Kolonien, während konditioniertes Medium der Zellinie MZ CHA-3 (D) keine Auswirkung auf die Kolonien zeigte. MRC-5-und HH-16 cl.4-Überstand (B/E) bewirkte eine stärkere Kolonieauflockerung (Phasenkontrast, 120x).

 

Abb.6. NRK-Indikatorzellen im Scatterversuch. Negativkontrolle (A), die nur mit Medium inkubiert wurde, Ansätze mit 20% konditioniertem Medium der Gallengangscarcinomzellinien EGI-1 (B), RPMI (C), MZ CHA-1 (D), MZ CHA-2 (E) und MZ CHA-3 (F) sowie als Positivkontrollen der Zellinien HH-16 cl.4 (G) und MRC-5 (H). Die Inkubationszeit betrug 2 Tage. Eine Zellvereinzelung enstand durch die Behandlung mit konditioniertem Überstand von Zellen der Linien EGI-1 (B), MZ CHA-1 (D), HH-16 cl.4 (G) und MRC-5 (H). Zellen aus dem Randbereich der Kolonien lösten sich unter dem Einfluß von RPMI- (C) und MZ CHA-2- Überstand (E). Konditioniertes Medium von MZ CHA-3-Zellen löste keine Veränderungen aus (F) (Phasenkontrast, 120x).

 

 

Die NRK-Indikatorzellen wurde analog dem Ansatz mit den MDCK-Zellen mit unbehandeltem Medium oder mit Medium, dem zu 20% konditionierter Überstand zugesetzt war, in 6-Loch-Schalen ausgesät. Die Auswertung erfolgte zu dem Zeitpunkt, an dem die Kontrollen in geschlossenen Kolonien ohne Kontakt zueinander wuchsen.

Im Gegensatz zu den MDCK-Zellen konnte bei den NRK-Indikatorzellen ein nahezu vollständiges Auseinanderrücken der einzelnen Zellen beobachtet werden (6). NRK-Zellen wuchsen als Negativkontrolle unbehandelt im zusammenhängenden  Zellverband (6A). Die einzelnen Zellen der Kolonien zeigten ein epitheloides Erscheinungsbild. Kulturüberstände der Gallengangscarcinomzellinie EGI-1 (6B) und MZ CHA-1 (6D) induzierten ein starkes „Scattering“ bei den Indikatorzellen, die den Zellverband verließen und vereinzelt wuchsen (Tabelle 2). Die Morphologie der Zellen veränderte sich nicht. Die Stimulation durch konditioniertes Medium der Cholangiocarcinomzellinien RPMI (6C) und MZ CHA-2 (6E) war deutlich geringer, sehr viele Kolonien blieben erhalten. Überstand der Gallengangscarcinomzellinie MZ CHA-3 hatte wie bei dem Scatterversuch mit MDCK-Zellen keinen Effekt auf die Migration oder Morphologie der NRK-Indikatorzellen (6F). In Gegenwart von Überstand der HH-16 cl.4- (6G) und MRC-5-Zellen (6H) als Positivkontrolle zeigten die Indikatorzellen das „Scatterphänomen“ in ähnlicher Ausprägung wie in Anwesenheit von Überstand der EGI-1- und MZ CHA-1-Zellen.

Die NRK-Indikatorzellen, die in unbehandelten Medium als Kolonien von epitheloiden Zellen wuchsen (7A), veränderten ihren Phänotyp unter dem Einfluß des MRC-5-Zellen  produzierten Scatterfaktors (7C). Die Zellen, die vor bzw. ohne Stimulation epitheloid wuchsen, wurden langgestreckt mit schmalen Zellkörpern und langen Ausläufern. Die Zellen zeigten eine fibroblastoide Morphologie. Bei allen anderen Ansätzen z.B. mit EGI-1-Überstand (7B) wurde der epitheloide Phänotyp der Indikatorzellen nicht beeinflußt .

 

 

 

 

Abb.7. Ausschnitt aus einem Scatterversuch mit NRK als Indikatorzellinie zur Verdeutlichung der morphologischen Veränderungen. Die Negativkontrolle wurde nur mit Medium und Zellen beschickt (A). Die Zellen wuchsen im epitheloiden Zellverband. In Gegenwart von 20% konditioniertem Medium von EGI-1-Zellen „scatterten“ die NRK-Zellen, veränderten ihren Phänotyp aber nicht. Überstand der MRC-5- Zellen (C) induzierte nicht nur das „Scatterphänomen“, sondern auch morphologische Veränderungen in ein fibroblastoides Zellbild. Auswertung des Versuchs war nach 2 Tagen Inkubationszeit (Phasenkontrast, 120x).

 

 

 

 

3.1.2 Scatterversuch mit HPAF-Indikatorzellen

 

Die Morphologie der in Kolonien wachsenden HPAF-Zellen ist epitheloid, die einzelnen Zellen wachsen polygonal, wobei die Zellgrenzen kaum sichtbar sind (8A). Die konditionierten Überstände der Gallengangscarcinomzellen EGI-1  (8B), RPMI, MZ CHA-1, MZ CHA-2 und -3 sowie der Mamma-Adenocarcinomzellinie HH-16 cl.4 (alle ohne Abbildung) zeigten keine Wirkung auf das Migrationsverhalten der Indikatorzellen (Tab. 1). Es ist bekannt, daß Überstände der MRC-5-Zellen einen deutlichen Effekt auf die Migration der Indikatorzellen haben. Die Zellen rundeten sich ab und verloren den Zellkontakt, so daß die Zellgrenzen erkennbar wurden (8C). Zum Vergleich wurden HPAF-Zellen mit r.h. HGF behandelt. Im Gegensatz zu den NRK-und MDCK-Indikatorzellen war ab einer Konzentration von 140 ng/ml ein deutlich positiver „Scattereffekt“ auf die HPAF-Indikatorzellen sichtbar. Eine r.h. HGF-Konzentration von 140 ng/ml löste eine ähnliche Intensität der „Scatteraktivität“ wie 20% MRC-5-Überstand aus (8D). Bei einer Verdopplung der Konzentration auf 280 ng/ml kam es durch eine deutliche Intensitätssteigerung der „Scatteraktivität“ zu einer vollständigen Vereinzelung der HPAF-Zellen (8E).

Im Gegensatz zu den NRK- und MDCK-Indikatorzellen kam es durch die Stimulation mit MRC-5-Zellüberstand bzw. r.h. HGF bei den HPAF-Zellen nicht zu einer morphologischen Veränderung der Zellen von einem epitheloiden zu einem fibroblastoiden Erscheinungstyp.

 

 

Abb.8. Scatterversuch mit HPAF-Indikatorzellen. Zellen ohne Zusatz von konditioniertem Medium (A), Ansätze mit 20% EGI-1- (B) und MRC-5-Überstand (C) sowie Ansätze mit 140 ng/ml (D) und 280 ng/ml (E) r. h. HGF. Nach 2 Tagen Inkubationszeit erfolgte die Auswertung. Auf Überstand von den Gallengangscarcinomzellen EGI-1 (B)  reagierten die Indikatorzellen nicht. MRC-5-Überstand (C) und 140 ng/ml r.h. HGF (D) lösten eine ähnliche Intensität der „Scatteraktivität“ aus, während eine Konzentration von 280 ng/ml r.h. HGF (E) eine völlige Vereinzelung der Zellen bewirkte. (Phasenkontrast, 120x).

 

 

Die Scatterversuche wurden während der Durchführung dieser Arbeit mehrfach wiederholt. Die Ergebnisse waren reproduzierbar und es wurden nur Kulturüberstände in den weiteren Versuchen eingesetzt, die vorher durch diese Methode auf ihre Aktivität untersucht wurden.

Insgesamt zeigen die Überstände der Cholangiocarcinom- und HH-16 cl.4-Zellen im Gegensatz zu MRC-5-Zellüberstand „Scatteraktivität“ bei den gleichen Indikatorzellen (Tabelle 1).

 

Tabelle 1: Kulturüberstände von Cholangiokarzinomzellen im Scatterversuch.

Cholangio-

carcinomzellinien

                                Indikatorzellinien

         MDCK                       NRK                         HPAF

EGI-1

              +/-

              ++

             -

RPMI 7451

              +/-

              +/-

             -

MZ CHA-1

              +/-

              ++

             -

MZ CHA-2

              +/-

              +/-

             -

MZ CHA-3

              -*

              -*

             -

Kontrollzellinien

 

 

 

MRC-5

              +

              ++

            +

HH-16 cl.4

              +

              ++

             -

r.h. HGF

              -

               -

   ab einer Kon-

   zentration von

   140ng/ml +

-              keine Aktivität des Überstandes im Scatterversuch, die Kolonien

                sind erhalten

+/-           die Kolonien sind weitgehend erhalten, nur einige Zellen aus dem

                Randbereich lösen sich

+             die Kolonien sind deutlich aufgelockert, die Zellen verlassen den

                Zellverband

++           die Zellen wachsen vereinzelt, es sind keine ursprünglichen Kolo-

nien mehr erkennbar

*             auch nach 6-facher Konzentrierung ist keine Scatteraktivität nach-

weisbar

 

 

3.2 Titration der von den Cholangiocarcinomzellen produzierten  „Scatteraktivität“

 

Zur Einschätzung der Konzentration der produzierten Migrationsfaktoren im konditionierten Medium wurden regelmäßig Titrationen des Kulturüberstandes durchgeführt. Verdünnungen der Überstände bis zu 1:1024 wurden im Scatterversuch eingesetzt. Der Titer wurde als das Verdünnungsverhältnis definiert, für das gerade noch Scatter-Aktivität bei den Indikatorzellen nachgewiesen werden konnte. Als Indikatorzellen wurden NRK-und MDCK-Zellen benutzt.

Identische Überstände einer Zellinie hatten bei den unterschiedlichen Indikatorzellen verschiedene Titerendpunkte. Bei NRK-Zellen war der Titerendpunkt immer höher als bei MDCK-Zellen (Tab.2). Überstände von EGI-1 (Abb.9), MZ CHA-1 und HH-16 cl.4-Zellen erreichten eine Aktivität bis zu einer Verdünnung von 1:32 bei NRK-Zellen. Bei einer 1:64 Verdünnung war keine „Aktivität“ mehr vorhanden, die Indikatorzellen wuchsen in Kolonien. Bei MDCK-Indikatoren hingegen reichte ein sichtbarer Effekt nur bis zu 1:4 bzw. bei HH-16 cl.4-Überstand bis zu 1:16.

 

Tabelle 2 : Überstands-Aktivität nach Verdünnung.

Kulturüberstände

                                   Indikatorzellinien

Cholangio-

carcinomzellen

 

                  NRK

 

                   MDCK

EGI-1

            bis zu 1:32 +

                     1:4

RPMI 7451

                   1:8

                     1:4

MZ CHA-1

                   1:32

                     1:4

MZ CHA-2

                   1:8

                     1:4

MZ CHA-3

                     -

                       -

Kontrollzellen

 

 

MRC-5

                   1:16

                     1:8

HH-16 cl.4

                   1:32

                     1:16

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb.9. Titerbestimmung eines konditionierten EGI-1-Überstandes mit NRK-Indikatorzellen. (A) Kontrollansatz mit ausschließlich  Kulturmedium, Ansätze mit einer Verdünnung von 1:4 (B) und von 1:32 (C). Inkubationszeit war 2 Tage. Bei der 1:4 Verdünnung (B) zeigte sich die stärkste Intensität der „Scatteraktivität“. Bei der 1:32 Verdünnung (C) war gerade noch eine schwache Scatteraktivität zu erkennen (Phasenkontrast, 120x).

 

                                                                             

 

 

 

3.3 Eingrenzung des Molekulargewichtes der Migrationsfaktoren

 

Zur Eingrenzung des Molekulargewichtes der Faktoren, die von den Cholangio-Carcinomlinien produziert wurden, wurde der konditionierte Überstand im Centriprep-Röhrchen zentrifugiert und so in verschiedene Fraktionen unterteilt. Molekulargewichtsfraktionen <50 kDa und >50 kDa bzw. <100 kDa und >100 kDa wurden erhalten und dann im Scatterversuch eingesetzt (Tabelle 3). Das Molekulargewicht von HGF/SF beträgt 83 kDa, das von HH-16 cl.4 liegt zwischen 50 und 100 kDa. Das Molekulargewicht der „Aktivität“ der Überstände von RPMI 7451, MZ CHA-1 und -2 lag ebenfalls zwischen 50 und 100 kDa. EGI-1-Zellen produzierten eine „Aktivität“, welche das „Scatterphänomen“ auslösen konnte, dessen Molekulargewicht über 100 kDa lag.

 

Tabelle 3 : Scatterversuch nach Fraktionierung des Überstandes nach Molekulargewicht

 

Kulturüberstände

                                 „Scatteraktivität“

Cholangio-

Carcinomzellinien

              Fraktion

             >50KDa

               Fraktion

             >100KDa

EGI-1

                   +

                   +

RPMI 7451

                   +

                   -

MZ CHA-1

                   +

                   -

MZ CHA-2

                   +

                   -

Kontrollzellinien

 

 

MRC-5

             ca.82KDa*

             ca.82KDa*

HH-16 cl.4

                   +

                   -

+             vorhandene

„Aktivität“

 

-              nicht vorhandene

„Aktivität“

 

*             aus der Literatur

bekannt

 

              (Nakamura et al., 1989)

 

 

 

3.4 Bei den von Cholangiokarzinomzellen produzierten Migrationsfaktoren handelt es sich nicht um HGF/ Scatterfaktor

 

Es lag nahe, daß es sich bei den von den Cholangio-Carcinomzellinien produzierten Migrationsfaktoren um den HGF/Scatterfaktor handeln könnte. Daher wurden die eingesetzten Überstände mit einem spezifischem ELISA auf die Anwesenheit von HGF untersucht.

Jeder eingesetzte Kulturüberstand wurde vorher im Scatterversuch auf seine Aktivität untersucht. Nur aktive Überstände wurden im ELISA eingesetzt. Eine Ausnahme war der konditionierte Überstand von MZ CHA-3, der im Scatterversuch keine „Scatteraktivität“ zeigte. Der ELISA wurde insgesamt viermal wiederholt.

 

Tabelle 4: Untersuchung der konditionierten Überstände auf HGF-Gehalt

mit dem HGF-spezifischen ELISA

Kulturüberstände

 

Cholangiocarcinomzellen

HGF-Konzentration

EGI-1

unter der Nachweisgrenze von 40 pg/ml

RPMI 7451

unter der Nachweisgrenze von 40 pg/ml

MZ CHA-1

unter der Nachweisgrenze von 40 pg/ml

MZ CHA-2

unter der Nachweisgrenze von 40 pg/ml

MZ CHA-3

unter der Nachweisgrenze von 40 pg/ml

Kontrollzellinien oder HGF

 

MRC-5

7000-40000 pg/ml

HH-16 cl.4

unter der Nachweisgrenze von 40 pg/ml

r.h. HGF

>8000 pg/ml

 

 

 

 

In allen ELISA-Ansätzen mit Überständen der Gallengangscarcinomzellen EGI-1, RPMI,  MZ CHA-1, -2 und -3 war die HGF-Konzentration unter der Nachweisgrenze von 40 pg/ml (Tabelle 4). HH-16 cl.4-Zellen produzierten ebenfalls keine aufdeckbare HGF- Konzentration. Im Gegensatz dazu produzierten die MRC-5-Zellen HGF-Mengen, die häufig weit über 8000 pg/ml lagen, so daß Verdünnungsreihen angefertigt werden mußten, bevor die Überstände im ELISA eingesetzt werden konnten. Die Konzentrationen an HGF reichten von ca 7000 bis zu 40.000 pg/ml. Die Menge an von den MRC-5-Zellen abgegebenen HGF war variabel und unabhängig von der Zelldichte oder Kulturdauer. In den biologischen Versuchen war die Aktivität ebenfalls relativ stark schwankend. Die  korrelierten die Ergebnisse nicht mit der nachgewiesenen Menge an HGF. Wurde eine Konzentration von z.B. 39.000 pg/ml HGF im ELISA nachgewiesen, konnte im Scatterassay  eine biologische „Aktivität“ von „kaum vorhanden“ bis „sehr deutlich sichtbar“ beobachtet werden. Der HGF-ELISA war spezifisch, konnte aber nicht zwischen aktivem und inaktivem Faktor unterscheiden.

 

 

3.5 Die Migrationsfaktoren aus den Kulturen der EGI-Cholangiokarzinomzellen induzieren eine verstärkte Zellmigration

 

Der Boyden-Kammerversuch ist eine Methode zur Untersuchung von induzierter Migration. Zusätzlich kann bestimmt werden, ob ein Faktor bei Indikatorzellen eine ungerichtete Motilität (Chemokinesis) induziert oder ob er eine Wanderung der Zellen in Richtung des Migrationsfaktors (Chemotaxis) auslöst. Als Indikatorzellen wurden NRK-Zellen benutzt. Der Anteil des zu testenden Überstandes betrug 20% am Kulturmedium und wurde im chemokinetischen Ansatz in das obere und untere Reservoir der Boyden-Kammer und beim chemotaktischen nur in das untere pipettiert. Jeder Einsatz wurde mit 2x105 Zellen beschickt. Nach 24 Stunden Inkubationszeit erfolgte die Zellzählung mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer.

 

 

 

 

 

Abb.10. Migration nach chemokinetischer (1) und chemotaktischer (2) Stimulation der Indikatorzellinie NRK durch EGI-1-, MRC-5- und HH-16 cl.4- Kulturüberstand in einer Boyden-Kammer. 2x105 Indikatorzellen wurden im Einsatz der Kammer für 24 Stunden kultiviert. Zur Auswertung wurden die in das untere Reservoir migrierten Zellen gezählt (Zahlenwerte, siehe Anhang Tabelle 9).

 

 

Untersucht wurden Kulturüberstände von der Cholangiokarzinomzellinie EGI-1, der humanen Lungenfibroblastenzellinie MRC-5 und Mamma-Adenokarzinomzellinie HH-16 cl.4 im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle, die nur mit Medium inkubiert wurde (Abb.10). Alle eingesetzten Überstände bewirkten eine chemotaktische und eine weniger starke chemokinetische Stimmulation. Die durch die Membran migrierte Zellzahl war je nach Überstand beim chemotaktischen Ansatz um 0,9-1,3x104 Zellen höher als beim chemokinetischen Ansatz. Die NRK-Zellen migrierten also stärker in Richtung eines Faktors (Tabelle 5).

 

 

 

Tabelle 5: Steigerung der Migration von NRK-Zellen in Gegenwart von konditionierten Kulturüberständen.

 

 

 

             Kulturüberstand

              Migrationssteigerung im Boyden-

              Kammerversuch mit NRK-Zellen

              chemotaktisch        chemokinetisch

                      EGI-1

                   1,5-fach                     1,2-fach

                      MRC-5

                   1,6-fach                     1,2-fach

                      HH-16 cl.4

                   1,6-fach                     1,4-fach

 

Die Zahlenwerte der Tabelle 5 beziehen sich auf einen Versuch mit Dreifachansätzen und zweifacher Zählung jedes Schälchens. Aus den sechs Zahlenwerten wurden Mittelwerte und Standardabweichungen errechnet. Die dazugehörige Tabelle 9 zu diesem einzelnen Versuch befindet sich im Anhang und ist repräsentativ für ca. 10 weitere analog angesetzte Versuche. Die Bezeichnung x-fache Steigerung bezieht sich auf die Zellzahl der Kontrolle, die ohne Zugabe eines Kulturüberstandes ermittelt wurde.

 

Es bestand das Problem, daß sich der Faktor beim chemotaktischen Ansatz im gesamten Raum der Boyden-Kammer verteilt, so daß bis zum Ende des Versuches kein Konzentrationsgefälle mehr bestehen würde. Daher wurde untersucht, inwieweit und wie lange das Konzentrationsgefälle des Migrationsfaktors aufrechterhalten blieb.

Dazu wurde ein Ansatz mit MRC-5-Überstand pipettiert, bei dem in das untere Reservoir 30 % Überstand und in das obere Reservoir Medium eingesetzt wurde. Bei Versuchsbeginn im ELISA quantifiziert, entsprach das ca.8903 pg/ml HGF im unteren Reservoir. Im oberen Reservoir  konnte kein HGF nachgewiesen werden. Es wurden nach 3, 6 und 24 Stunden Aliquots aus dem oberen und unteren Reservoir genommen und der HGF-Gehalt im ELISA gemessen (Abb.11). Nach 3 Stunden Inkubationszeit waren ca.1196 pg/ml von dem Ausgangswert von 8903 pg/ml durch die Membran in das obere Reservoir diffundiert. Im unteren Reservoir verblieb eine Menge von ca.7108 pg/ml. Nach 6 Stunden betrug das Konzentrationsgefälle noch ca.6027 zu ca.2628 pg/ml vom unteren zum oberen Reservoir. Nach 24 Stunden Inkubationszeit war die Konzentration immer noch nicht ausgeglichen; betrug oben ca.3575 und unten noch ca.4502 pg/ml. Das Ergebnis zeigt, daß bis zum Ende des Versuchs ein ausreichendes Konzentrationsgefälle bestand, um eine Unterscheidung zwischen chemotaktischer und chemokinetischer Stimulation zu treffen.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abb.11. Änderung des HGF-Konzentrationsgradienten zwischen oberem und unterem Reservoir der Boyden-Kammer während einer 24-stündigen Inkubation. Zu Versuchsbeginn war im unteren Reservoir 8903 pg/ml HGF vorhanden. Im oberen Reservoir befand sich reines Medium. Nach 24 Stunden Inkubationszeit war die Faktorkonzentration noch nicht ausgeglichen. Im oberen Reservoir betrug sie ca. 3575 pg/ml und im unteren Reservoir ca. 4502 pg/ml.

 

 

 

 

 

 

3.6 Die Migrationsfaktoren der EGI-Cholangiokarzinomzellen steigern nicht das invasive Wachstum von NRK Indikatorzellen

 

Migrationsfaktoren können bei bestimmten Indikatorzellen die Fähigkeit zu invasivem Wachstum induzieren. Um invasiv wachsen zu können, müssen die Zellen Stoffe und Enzyme produzieren, die in der Lage sind, Zellverbände bzw. -verbindungen aufzulösen, z.B. Kollagenase um Kollagen zu spalten. Die Membran einer Boyden-Kammer wurde mit Kollagen beschichtet, bevor in den Einsatz 2x105 Zellen pipettiert wurden. Um die Membran zu passieren und in das untere Reservoir zu gelangen, mußte die Bildung einer Kollagenase induziert werden. Es wurde ein chemotaktischer und ein chemokinetischer Ansatz mit EGI-1-, MRC-5- und HH-16 cl.4-Überstand gemacht. Die Auswertung erfolgte wieder durch Zählung der durch die Membran migrierten Zellen in einer Neubauer-Zählkammer(Abb.12).

 

 

 

 

 

 

Abb. 12. Invasives Wachstum der NRK-Indikatorzellen in Gegenwart von 20% konditioniertem Überstand der EGI-1-, MRC-5- und HH-16 cl.4-Zellen. 2x105 Zellen wurden in den oberen Einsatz einer Boyden-Kammer mit Kollagen-beschichteter Trennmembran pipettiert. Die in das untere Reservoir migrierten Zellen wurden nach 5 Tagen gezählt (Zahlenwerte, siehe im Anhang Tabelle10). 

 

Mit EGI-1-Überstand behandelte Ansätze zeigten im Vergleich zu den nur mit Medium behandelten Kontrollen keine Invasivitätssteigerung. Der Kulturüberstand induzierte weder im chemotaktischen noch im chemokinetischen Ansatz eine Kollagenase-Bildung bei den Indikatorzellen. Im Gegensatz dazu konnte in Gegenwart von MRC-5- und HH-16 cl.4-Überstand bei NRK-Zellen ein verstärktes invasives Wachstum beobachtet werden. Die Anzahl der invasiv gewachsenen und gewanderten Zellen war um 104 (siehe Anhang) höher, wenn ein Gradient zwischen oberen und unteren Reservoir bezüglich des Überstandes bestand (Tab.6). Die Zellzahl der durch die Membran migrierten Zellen konnte die Zahl der eingesetzten Zellen deutlich überschreiten, da die Zellen sich in der Inkubationszeit von 5 Tagen vermehrt haben.

 

Tabelle 6: Steigerung des invasiven Wachstums in Anwesenheit von konditioniertem Überstand von EGI-1, MRC-5 und HH-16 cl.4.

Kulturüberstand

   chemotaktische Stimulation

 chemokinetische Stimulation

EGI-1

                      -

                       -

MRC-5

                 2,1-fach

                  1,8-fach

HH-16 cl.4

                1,9-fach

                  1,5-fach

 

Die Steigerung bezieht sich auf den Wert der ohne Zugabe von Überstand ermittelt wurde. Die Zahlenwerte der Tabelle 6 beziehen sich auf einen einzelnen Versuchsansatz, der repräsentativ ist (siehe Anhang, Tabelle 10). In wenigen Ansätzen steigerte sich die Grundinvasivität der NRK-Zellen bis zu 2,4-fach durch die Behandlung mit konditionierten Überständen.

 

 

 

 

 

3.7 Heparin-Sepharose hemmt die chemotaktischen Eigenschaften des Migrationsfaktors aus den EGI-Cholangiokarzinomzellen

 

Das Proteoglykan Heparin ist in der Lage Scatterfaktor/HGF zu binden, der dadurch in seiner Aktivität gemindert wird. Es wurde die Inhibition der „Scatteraktivität“ und der Chemotaxie bei NRK-Indikatorzellen durch Heparinbehandlung des Kulturüberstandes von Cholangiokarzinomzellen untersucht. Die Überstände wurden über Nacht mit einer bestimmten Menge an Heparin-Sepharose geschüttelt. Vor der Verwendung mußte die ungebundene Heparin-Sepharose abzentrifugiert werden.

Im Scatterversuch wurde Heparin-behandelter und unbehandelter Überstand eingesetzt. Im Vergleich zur Kontrolle konnte beobachtet werden, daß die „Scatteraktivität“ durch die Behandlung von EGI-1-Kulturüberstand deutlich gemindert wurde. Ebenso war eine deutliche „Aktivitätsminderung“ bei MRC-5-Überstand zu beobachten. Im Gegensatz dazu zeigte HH-16 cl.4-Überstand vor und nach Heparin-Behandlung das gleiche Maß an Aktivität. Parallel dazu wurden alle Überstände im chemotaktischen Boyden-Kammerversuch eingesetzt. Hier bestätigte sich das Ergebnis (Abb.13.).

 

 

 

 

Abb.13. Inhibition der Chemotaxie bei NRK-Indikatorzellen durch Heparinbehandlung des konditionierten Kulturüberstandes von EGI-1, MRC-5 und HH-16 cl.4. Der chemotaktische Ansatz des Boyden-Kammerversuchs wurde mit und ohne vorbehandeltem Überstand und 2x105 Indatorzellen beschickt. Die Auswertung erfolgte nach 24 Stunden (Zahlenwerte, siehe Anhang Tabelle 11).

 

Tabelle 7: Inhibition der Chemotaxie durch Heparin-Behandlung des Kulturüberstandes.

 

Kultur-

Überstand

             Boyden-Kammer-Versuch (chemotaktisch)

                      ohne                                       mit

         Heparin-Behandlung           Heparin-Behandlung

 

EGI-1

                   1,5-fach                                  1,2-fach

 

MRC-5

                   1,6-fach                                  1,1-fach

 

HH-16 cl.4

                   1,6-fach                                  1,6-fach

 

 

Die Bezeichnung „x-fach“ bezieht sich auf die Steigerung gegenüber einem Ausgangswert, der ohne Zugabe von konditioniertem Kulturüberstand ermittelt wurde.

 

 

Nach Vorbehandlung der EGI-1- und MRC-5-Überstände mit Heparinsepharose zeigte sich eine deutliche Minderung der „Faktor-Aktivität“ bzw. der chemotaktischen Wanderung durch die Membran einer Boyden-Kammer. Die „Aktivität“ wurde aber nicht vollständig inhibiert, es bestand eine Rest-Migrationssteigerung. HH-16 cl.4-Überstand wurde durch Heparin-Behandlung auch in diesem Versuch nicht inaktiviert (Tab.7).

Zur Quantifizierung der Heparin-Bindung wurde behandelter und nicht behandelter MRC-5-Überstand im ELISA eingesetzt. Die Konzentration verringerte sich von 38724 auf 7052 pg/ml.

 

 

 

 

 

3.8 Steigerung der Proliferation durch den Kulturüberstand aus EGI-Cholangiokarzinomzellen

 

Dieser Versuch sollte den Einfluß von EGI-1-Zellüberstand auf die Mitoserate der Indikatorzellinie MDCK zeigen. In 6-Loch-Schalen wurden 10.000 Zellen in eine Vertiefung ausgesät und für 4 Tage in Anwesenheit von 20% konditioniertem Überstand aus EGI-1-Zellkulturen oder nur mit Kulturmedium als Kontrolle inkubiert. Zum Vergleich wurden Ansätze mit MRC-5- und HH-16 cl.4-Überstand pipettiert. Nach 2 und 4 Tagen erfolgte die Auszählung der verschiedenen Ansätze (Abb.14).

 

 

Abb. 14. Proliferation der Indikatorzellen MDCK in Gegenwart von 20% konditioniertem Kulturüberstand der Linien EGI-1, MRC-5 und HH-16 cl.4. Die Kontrollkultur wurde nur mit Medium inkubiert. Pro Ansatz wurden 10.000 Indikatorzellen ausgesät und nach 2 und 4 Tagen gezählt (Zahlenwerte, siehe Anhang Tabelle 12).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Im Vergleich zur Kontrolle wurde ein prolifertationssteigernder Effekt auf MDCK-Zellen für Überstände der Zellinien EGI-1 und MRC-5 festgestellt. Der HH-16 cl.4-Überstand zeigte keine Wirkung auf die Mitoserate der Indikatorzellen. Als Maß für die proliferationssteigernde Wirkung wurde die Zunahme der Zellzahlen von dem 2.Tag auf den 4.Tag gewählt. Bei den MDCK-Zellen war die Zunahme bei dem Ansatz mit EGI-1-Überstand um 1,5-fach, bei MRC-5- Überstand um 2,0-fach gesteigert (Tab.8). Die Zellzahl vermehrte sich in den 4 Tagen Inkubationszeit von 10.000 auf 385833. Bei EGI-1-Überstand konnten 18x104 und bei MRC-5-Überstand 37x104 Zellen mehr gezählt werden.

 

Tabelle 8: Steigerung der Proliferation von MDCK-Indikatorzellen durch Zugabe von konditionierten Kulturüberständen.

 

 

                    Kulturüberstand

                      Proliferations-

            steigerung bei MDCK-Zellen

                            EGI-1

                            1,5-fach*

                            MRC-5

                            2,0-fach*

                            HH-16 cl.4

                                 -

 

-              keine Proliferationssteigerung

*             Die Bezeichnung x-fache Steigerung bezieht sich auf einen Kontrollwert, der ohne Zugabe eines Kulturüberstandes ermittelt wurde.

 

 

 

Die Auswertung des Boyden-Kammerversuchs, Invasionsversuchs, Boyden-Kammerversuchs nach Vorbehandlung des Überstandes mit Heparin-Sepharose und des Proliferationsversuchs erfolgt durch Zellzählung der migrierten bzw. proliferierten Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer. Von dem Gitterfeld der Kammer wurden 4x16er Felder gezählt. Die erhaltene Zahl sollte mindestens 50 betragen. Diese wurde dann erst durch 4 dividiert und dann mit der Zahl 10.000 multipliziert. Die so ermittelten Zahlen gaben die Zellzahlen pro ml an. Bei jedem Versuch wurden Dreifach-Ansätze gemacht, wobei jedes der drei Schälchen zweifach ausgezählt wurde. Aus diesen 6 Zahlen wurde der Mittelwert (MW) mit Standardabweichung (STABW) ermittelt. Die Versuchsanordnung wurde ca.10 mal wiederholt und die Ergebnisse waren reproduzierbar. Im Tabellenanhang befinden sich zu jedem der Versuche eine Zahlentabelle, die in ihren Ergebnissen repräsentativ ist. Einzelne Versuche zeigten durch die konditionierten Überstände eine wesentlich höhere Stimulation.

 

 

 

 

4. Diskussion

 

In den letzten Jahren gab es neue Erkenntnisse über Migrationsfaktoren und deren Funktionsbreite. Migrationsfaktoren werden von vielen mesenchymalen und tumorösen Zellen gebildet, sie sind also kein Einzelphänomen. Die Faktoren wirken parakrin und autokrin. Tumorzellen können teilweise Zytokine produzieren, die meist „gesunde“ Zellen zur Produktion von Faktoren induzieren, die dann wieder parakrin die malignen Zellen stimulieren. Die Vermutung liegt nahe, daß nicht alle Vorgänge, wie Invasivität, Metastasierung oder Mitoseratensteigerung autonom geschehen, sondern daß die Karzinomzellen von einer Kooperation mit anderen Zellen abhängig sind. Durch das Erfassen von Faktoren, die für diese Zellkommunikation zuständig sind, erschließen sich neue Erkenntnisse in der Diagnostik von bösartigen Erkrankungen. Ein Einsatz als Tumormarker wäre vorstellbar. Die therapeutischen Möglichkeiten sind anhand der bisherigen Forschungsergebnisse schwer einschätzbar. Die Entwicklung eines Antikörpers gegen Migrationsfaktoren wäre nur denkbar, wenn dadurch keine lebenswichtigen physiologischen Vorgänge im menschlichen Körper inhibiert würden.

 

In der vorliegenden Arbeit wurden Kulturüberstände von den fünf Cholangiocarcinomzellinien EGI-1, RPMI 7451, MZ CHA-1,-2 und -3 im Vergleich zu denen einer humanen Fibroblasten-Linie (MRC-5) und einer Mamma-Carcinomzellinie der Ratte (HH-16 cl.4) auf die Anwesenheit von Migrationsfaktoren untersucht. MRC-5-Zellen produzieren den Faktor HGF/SF und HH-16 cl.4-Zellen den in vielen biologischen Eigenschaften ähnlichen, aber nicht identischen Migrationsfaktor MAC-MF.

Der eine Faktor wird von einer „normalen“ humanen Fibroblasten-Zellinie sezerniert, der andere von einer Ratten-Carcinomzellinie. Beide bewirken bei MDCK- und NRK-Indikatorzellen das „Scatterphänomen“. Vier der fünf eingesetzten Überstände der Cholangiocarcinomzellen enthielten Scatteraktivität und führten bei den eingesetzten Indikatorzellen zu der Fähigkeit, aus dem geschlossenen Zellverband zu migrieren.

Die Zellen der drei in der Arbeit verwendeten Indikatorlinien reagierten zum Teil unterschiedlich auf die eingesetzten Kulturüberstände. Bei den Kolonien der MDCK-Indikatorzellen zeigten die Überstände der Cholangiocarcinomzellinien beim Scatterversuch ein relativ einhaltliches Bild. Der Zellverband war am Rand der Kolonien deutlich aufgelockert, wenige Zellen waren vereinzelt gewachsen, teilweise blieben die Kolonien vollständig erhalten. Im Gegensatz dazu wuchsen die Zellen in Gegenwart des SF/HGF und MAC-MF zum größten Teil vereinzelt, fast ohne Ausbildung von zusammenhängenden Kolonien; die Morphologie der MDCK-Indikatorzellen änderte sich bei Behandlung mit diesen Überständen von einem epitheloiden in einen langgestreckten fibroblastoiden Phänotyp. Diese in der vorliegenden Arbeit gezeigte morphologische Änderung steht im Einklang mit früheren Untersuchungen (Behrens et al., 1989). Bei den konditionierten Überständen der Cholangiocarcinomzellinien waren nur die Zellen am Rand der Indikatorzellkolonien deutlich fibroblastoid verändert. Die Intensität der Scatteraktivität bzw. der morphologischen Veränderungen war bei den Kulturüberständen der Cholangiocarcinomzellinien mit unbekannter Faktorproduktion deutlich geringer als bei den bekannten Migrationsfaktoren.

Die Kolonien der NRK-Indikatorzellen zeigten unter dem Einfluß von MRC-5-, HH-16 cl.4-, EGI-1- und MZ CHA-1-Überstand vereinzelt wachsende Zellen und eine Auflösung des Zellverbandes. Die Stimulation war stärker als bei RPMI- und MZ CHA-2-Überstand, bei denen die Kolonien teilweise vollständig erhalten geblieben sind und sich nur einzelne Zellen aus dem Randbereich lösten. Die NRK-Indikatorzellen behielten ihr epitheloides Erscheinungsbild weitgehend bei, nur unter dem Einfluß des SF/HGF bekamen die Zellen ein stark fibroblastoides Aussehen mit langen Ausläufern und sehr schmalen Zellkörpern. Diese Veränderungen der Morphologie waren auch bei geringer Scatteraktivität d.h. bei geringerer Produktion des Faktors durch MRC-5-Zellen, zu beobachten. Der Überstand der Zellinie MZ CHA-3 bewirkte bei keiner der eingesetzten Indikatorzellen eine Scatteraktivität. Da der Überstand 6-fach konzentriert wurde und trotzdem keine Scatteraktivität zeigte, liegt die Vermutung nahe, daß diese Zellinie zumindest keinen Migrationsfaktor produziert, der auf die eingesetzten Indikatorzellen wirkt.

 

Bei Einsatz der HPAF-Indikatorzellen, die humane Karzinomzellen sind, wurde das Scatterphänomen nur durch HGF/SF ausgelöst. Auf Überstand von HH-16 cl.4 und den Cholangiocarcinomzellen wurde keine Reaktion festgestellt, weder eine Migrationsinduktion noch morphologische Veränderungen. Die Kolonien der HPAF-Zellen waren meist rund mit dicht gedrängten Zellen, so daß kaum die Zellgrenzen zu sehen waren. Wie bereits beschrieben (Di Renzo et al., 1995), trennten sich die Zellen in Gegenwart von HGF/SF voneinander und verließen den Zellverband, ohne dabei ihr epitheloides Aussehen zu verlieren. Auch nach Behandlung mit r.h. HGF zeigten die Zellen keine morphologischen Veränderungen. Bei Steigerung der eingesetzten HGF-Menge bis zu 280 ng/ml rückten die Zellen immer weiter auseinander.

 

Die morphologischen Veränderungen, die durch HGF/SF bewirkt werden, entstehen durch Veränderungen des Aktin-Cytoskeletts und damit verbundenen Kräuselungen der Zellmembran („membran ruffling“) sowie einer Extension von Lamellopodien. Es wurde nachgewiesen, daß neben dem Scatterfaktor auch Wachstumsfaktoren wie EGF (Epidermal Growth Factor) und IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) dieses „membran ruffling“ induzieren können. Verschiedene Faktoren bewirken morphologisch differenzierbare Membranveränderungen. Daraus wurde die Folgerung gezogen, daß die Art des „membran ruffling“ mit der von dem jeweiligen Faktor induzierten Signalkaskade korreliert (Nishiyama et al., 1994). Geht man von dieser Hypothese aus, kann vermutet werden, daß MAC-MF und die Faktoren der Gallengangscarcinomzellinien im Vergleich zu SF/HGF durch unterschiedliche intrazelluläre Signalkaskaden die verschiedenen morphologischen Veränderungen bei den NRK-Indikatorzellen bewirken. Da MRC-5-Überstand bzw. HGF/SF bei HPAF-Indikatorzellen im Gegensatz zu MDCK- und NRK-Zellen keine morphologischen Veränderungen hervorruft, könnte spekuliert werden, daß die Wege der Signalübertragung ebenfalls unterschiedlich sind.

 

Die biologische Aktivität der Überstände von EGI-1-, RPMI-, MZ CHA-1- und 2-, HH-16 cl.4- und MRC-5-Zellen wurde durch die Verwendung der konditionierten Überstände im Scatterversuch mit Verdünnungsreihen ermittelt. Dabei zeigte die HGF-/ SF-Produktion der MRC-5-Zellen starke Schwankungen. Der Überstand wurde geerntet, sobald die Zellen konfluent gewachsen waren. Dieses Phänomen wurde bereits in der Literatur in Bezug auf aufgereinigtes HGF/SF beschrieben (Gheradi and Coffer, 1991). Die Faktorproduktion von HH-16 cl.4- und EGI-1-Zellen blieb dagegen über einen längeren Zeitraum relativ konstant. Bis zu einer maximalen Verdünnung von 1:32 bei NRK-Indikatorzellen und 1:16 bei MDCK-Zellen für HH-16 cl.4-Überstand und 1:4 für EGI-1-Überstand konnte Aktivität im Scatterversuch nachgewiesen werden. RPMI-, MZ CHA-1- und -2-Zellen zeigten eine weniger konstante Faktorproduktion, für MZ CHA-1-Überstand eine Scatteraktivität bis zu einer Verdünnung von 1:32 bei NRK-Zellen und von 1:4 bei MDCK-Zellen. Insgesamt reagierten NRK-Zellen bei zunehmender Verdünnung sensibler als MDCK-Indikatorzellen. Der Grund dafür liegt möglicherweise in einer unterschiedlichen Rezeptordichte an der Membranoberfläche der Indikatorzellen. Andere Ursachen könnten verschiedene Rezeptoren, an die der Faktor bindet, oder die Auslösung anderer Signalkaskaden sein.

 

Ein wichtiger Gesichtspunkt in der Charakterisierung eines Migrationsfaktors ist die Bestimmung bzw. Eingrenzung der molekularen Größe. Die Molekülgröße von HGF/SF liegt je nach Glykolisierungsgrad der Ketten bei ca. 82 kDa (Nakamura et al., 1987). Bei MAC-MF konnte das Molekulargewicht zwischen 50 und 100 kDa eingegrenzt werden (Kopdag et al., 1994; Steffen, 1996). In dem gleichen Bereich liegt die molekulare Größe der Migrationsfaktoren in den Überständen von RPMI-, MZ CHA1- und -2-Zellen. In dem konditioniertem Überstand von EGI-1 war die Scatteraktivität in der Fraktion >100 kDa. EGI-1-Zellen produzieren also wahrscheinlich einen Migrationsfaktor, der eine molekulare Größe von mehr als 100 kDa hat. Es besteht die Möglichkeit, daß dieser Faktor als dimeres Protein vorliegt. Somit ist nicht ausgeschlossen, daß es sich um den gleichen Faktor, der auch von den anderen Cholangiocarcinomzellen produziert wird, handelt.

 

Zum Ausschluß, daß HGF/ SF in den Überständen von HH-16 cl.4- und den Gallengangscarcinomzellinien vorhanden ist, wurde ein HGF-spezifischer ELISA durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß keine der Zellinien inaktive oder aktive Konzentrationen an HGF produzierte. In den MRC-5-Überständen konnten stark schwankende Konzentrationen an HGF aufgedeckt werden. Die ermittelten HGF-Konzentrationen in den MRC-5-Überständen korrelierten nicht mit den vorher untersuchten biologischen Aktivitäten im Scatterversuch. Der Grund liegt darin, daß der ELISA nicht zwischen aktivem und inaktiven HGF unterscheiden konnte.

 

Die Aktivität von MAC-MF wird im Gegensatz zu HGF/SF nach Behandlung mit dem Proteoglykan Heparin nicht gehemmt oder vermindert (Scherdin and Hölzel, 1993). HGF/ SF wird sowohl durch Bindung an lösliches Heparin als auch an immobilisiertes Heparin inhibiert (Rosen et al., 1989). Parallel wurden die Überstände von MRC-5, HH-16 cl.4 und EGI-1 mit Heparin-Sepharose, also immobilisieretem Heparin, behandelt und danach in dem Scatterversuch und Boyden-Kammerversuch eingesetzt. Für MAC-MF und HGF/SF bestätigte sich das erwartete Ergebnis. Wurde EGI-1-Überstand mit Heparin-Sepharose behandelt, zeigte sich wie bei MRC-5-Überstand eine deutliche Hemmung der Scatteraktivität, der Faktor muß also gebunden worden sein. Heparin bindet normalerweise an basische Proteine, so daß die Schlußfolgerung nahe liegt, daß es sich bei dem von EGI-1-Zellen produzierten Faktor um ein basisches Protein handelt. Für HGF/ SF hat sich diese Vermutung durch eine Ionenaustausch-Chromatographie bestätigt (Coffer et al., 1991). Bei MAC-MF handelt es sich wahrscheinlich nicht um ein basisches Protein. Durch den Einsatz der heparinbehandelten Überstände im Boyden-Kammerversuch konnte die Minderung der Aktivität der Überstände quantifiziert werden. Bei MRC-5- und EGI-1-Überstand wurde die Aktivität durch die Behandlung mit der Menge Heparin-Sepharose, die in dieser Arbeit eingesetzt wurden, nicht vollständig gehemmt, sondern stark gemindert. Durch die Heparinbehandlung wurde die Migrationssteigerung von 1,5-fach, die normalerweise durch EGI-1-Überstand ausgelöst wurde, auf 1,2 gemindert. Bei dem MRC-5-Überstand wurde die Aktivität um 0,5 verringert. Durch den Einsatz des behandelten und unbehandelten MRC-5-Überstandes im ELISA konnte die Bindung des Faktors quantifiziert werden. Die Konzentration verminderte sich von 38724 auf 7052 pg/ml.

 

Im Boyden-Kammerversuch mit NRK-Zellen konnte, wie durch die bisherigen Ergebnisse im Scatterversuch erwartet, für Überstand der Cholangiocarcinomzellinie EGI-1 ebenso wie für die Faktoren HGF/SF und MAC-MF eine chemokinetische und eine stärkere chemotaktische Stimulation gezeigt werden. Die Steigerung der Migration war deutlich und lag für die beiden bekannten Faktoren in der gleichen Größenordnung wie für EGI-1-Überstand. Die Stimulation durch HGF/SF und MAC-MF wurde bereits in früheren Untersuchungen gezeigt (Gastmann,1995; Steffen 1996), im chemotaktischen Ansatz mit NRK-Indikatorzellen wurde eine 2,2- bis 2,5-fache Erhöhung der motogenen Aktivität berichtet. Einzelne Versuchsansätze dieser Arbeit konnten dieses Maß an Steigerung erreichen. Die stärkere chemotaktische Stimulation zeigt, daß die Indikatorzellen zur gerichteten Wanderung zur „Quelle“ eines Faktors angeregt wurden. Wird den Zellen durch den Migrationsfaktor eine Richtung gezeigt, können sie ihre Migrationsaktivität anscheinend wesentlich koordinierter bzw. geordneter ablaufen lassen. Diese „in vitro“ Versuche wecken die Vorstellung, daß Zellen „in vivo“ durch parakrine Stimulation eines Tumors angeregt werden, in Richtung eines Migrationsfaktors zu wandern. In der Umgebung des Faktors angekommen, könnten die Zellen entweder selbst parakrin zur Produktion von weiteren Zytokinen stimuliert werden oder andere Wirkungen auf weitere pathologische Prozesse in der Entwicklung eines Tumors haben.

 

Die Malignität eines Tumors ist durch sein invasives Wachstum und durch die Fähigkeit zur Metastasierung gekennzeichnet. Die meisten der Tumorpatienten versterben nicht an ihrem Primärtumor, sondern an den Metastasen in verschiedenen Organen mit entsprechenden Funktionalitätseinbußen. Voraussetzung für die Tumorabsiedlung in andere Gewebe ist das invasive, destruierende Wachstum und das anschließende Einbrechen bzw. Einwandern von „kranken“ Zellen in das Blut- oder Lymphgefäßsystem (Folkman and Shing, 1992). In Einklang mit früheren Untersuchungen stimulierten die bekannten Migrationsfaktoren MAC-MF und HGF/SF (Gastmann, 1995) „in vitro“ das Wachstum von NRK-Zellen in und durch eine Kollagenschicht hindurch. Die chemotaktische Stimulation war auch bei diesem Versuchsansatz höher als die chemokinetische. In Gegenwart des EGI-1-Überstandes zeigten diese Indikatorzellen bei dieser Versuchsanordnung keine Steigerung der Invasivität. Um die Kollagenschicht verstärkt durchwandern zu können, müssen die NRK-Zellen durch Faktoren von außen induziert werden, Kollagenase zu produzieren. Offenbar bewirken Faktoren aus EGI-1-Überstand keine Induktion der Kollagenase. Das schließt natürlich nicht eine mögliche Stimulation von anderen Indikatorzellen aus.

 

Bei der Regeneration wird eine Wiederherstellung des Normzustandes und der Funktionalität angestrebt. Wird vermehrt Gewebe gebildet, kann die Regeneration pathologisch gesteigert sein. Der Begriff „Tumor“ trifft für eine Gewebsvermehrung erst zu, wenn das Wachstum mit dem „normalen“ umgebenden Gewebe nicht mehr koordiniert ist und auch dann anhält, wenn der auslösende Reiz nicht mehr direkt wirksam ist (Grundmann, 1992). Dieser Ausdruck sagt noch nichts über die Dignität der durch eine unangemessene Zellproliferation entstandenen Gewebsvermehrung aus. Es stellt sich die Frage, ob es unterschiedliche Zytokine gibt, die differenziert eine „maligne“ oder „benigne“ Proliferationsinduktion „in vivo“bewirken. „In vitro“ wurde die Steigerung der Proliferation der MDCK-Zellen unter dem Einfluß von den Kulturüberständen untersucht. Für die EGI-1- und die MRC-5-Überstände bzw. HGF/SF wurde im Gegensatz zu HH-16 cl.4-Überstand eine Stimulation der Proliferation der Indikatorzellen gefunden. Unter dem Einfluß von HGF/SF wuchsen die Zellen innerhalb von zwei Tagen 2-fach schneller als die unbehandelte Kontrolle.

 

Die vorliegende Arbeit kann Ergebnisse (Gastmann, 1995; Steffen, 1996) bestätigen, daß es sich bei den bekannten Migrationsfaktoren MAC-MF aus der Rattenzellinie HH 16 cl.4 und HGF/SF um unterschiedliche Faktoren handelt. Das Molekulargewicht liegt bei beiden Faktoren zwischen 50 und 100 kDa. Das gefundene Indikatorzellspektrum ist zwar ähnlich, aber nicht gleich. Die humanen Pankreaskarzinomzellen HPAF wurden nur durch HGF/SF zur Migration induziert. Es werden von beiden Faktoren MDCK-Zellen zu einer Veränderung ihrer Morphologie, NRK-Zellen zu einer verstärkten Migration und Invasivität stimuliert. Morphologische Veränderungen bei NRK-Zellen bewirkte nur HGF/SF. Eine Fähigkeit zur Induktion der Zellproliferation oder Hemmbarkeit durch Heparin wurde nur bei HGF/SF gefunden.

Die vergleichenden Untersuchungen zeigten eine starke Ähnlichkeit zwischen den biologischen Aktivitäten der Überstände der Gallengangscarcinomzellinien des Menschen und der HH-16 cl.4 Ratten-Zellinie mit der bekannten MAC-MF-Produktion. Das Indikatorzellspektrum ist gleich, die unterschiedlich stark ausgeprägten Effekte bei den Indikatorzellen könnten durch eine unterschiedliche quantitative Faktorproduktion erklärt werden. Bei MDCK-Indikatorzellen führten alle Faktoren  zu morphologische Veränderungen. Das Molekulargewicht der Faktoren aus RPMI, MZ-CHA 1,2 und MAF-MC liegt zwischen 50-100 kDa. Durch die durchgeführten Untersuchungen konnte nicht gezeigt werden, daß die Zellen von den Cholangiocarcinomzellinien RPMI und MZ CHA-1 und -2  einen zu MAF-MC differenten Faktor produzieren.

Eine eigene Stellung nimmt offenbar die „Aktivität“ des EGI-1-Überstandes ein. Das Molekulargewicht liegt im Gegensatz zu allen anderen Faktoren über 100 kDa. Bei dem von EGI-1-Zellen produzierten Faktor könnte es sich im Gegensatz zu den anderen um ein dimeres Protein handeln. Die Untersuchungen zeigten Gemeinsamkeiten und Unterschiede zu MAC-MF und HGF/SF. EGI-1-Überstand wurde diskrepant zu MAC-MF wie HGF/SF durch eine Heparinbehandlung gehemmt. EGI-1-Überstand bewirkte eine Migrations- und Proliferationssteigerung wie HGF/SF, aber im Gegensatz keine Invasivitätssteigerung der Indikatorzellen. Wie MAC-MF hatte EGI-1-Überstand keinen Einfluß auf HPAF-Indikatorzellen oder auf morphologische Veränderungen bei NRK-Zellen. Die Scatteraktivität auf MDCK- und NRK-Zellen wurde in ähnlicher Stärke bewirkt.

Es besteht die Möglichkeit, daß die biologische Aktivität in den hier untersuchten Überständen der Cholangiocarcinomzellen des Menschen auf ein Spektrum verschiedener Faktoren mit migrations-, proliferationssteigernder oder invasivitätsauslösender Potenz zurückzuführen ist. Um von einem Migrationsfaktor mit spezifischen Eigenschaften sprechen zu können, müßte der Faktor durch geeignete Methoden isoliert, aufgereinigt und auf seine biologische Aktivität untersucht werden.

Die Ergebnisse, die bisher auf dem Forschungsgebiet der Migrationsfaktoren erzielt worden sind, zeigen, daß das Entstehen und die Entwicklung von „Krebs“ kein unkoordiniertes Ereignis ist. Die vielen unterschiedlichen Zellbotenstoffe mit differenzierbaren Rezeptoren, verschiedenen Signaltransduktionswegen und daraus resultierenden variablen Reaktionen an den Zielorganellen demonstrieren ein noch nicht überschaubares Bild von Reaktion und Gegenreaktion. Mit dem Wissen über die Kommunikation der Tumorzellen untereinander und mit normalen Zellen durch Zytokine, kann man davon ausgehen, daß es sich bei der Tumorentwicklung um ein multifaktorielles, sehr komplexes und im Prinzip geordnetes Geschehen handelt. Ein erstrebenswertes Ziel stellt die Systematisierung dieser Faktoren dar. Das Zuordnen von einzelnen Migrationsfaktoren zu einer bestimmten Carcinom- oder Sarkomart könnte in der Diagnostik, eventuell beim „Staging“ des Tumors oder generell bei dem Aufdecken einer Krebserkrankung wegweisend sein. Eine bessere Unterteilung einer bestimmten Tumorart in Untergruppen mit spezifischer Produktion von Migrationsfaktoren, könnte in Zukunft differenzierte Therapieansätze ermöglichen.

 

 

5. Zusammenfassung

 

Kulturüberstände von fünf humanen Cholangiocarcinomzellinien EGI-1, RPMI 7451, MZ CHA-1,-2 und -3 wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, eine Migration von epitheloiden Indikatorzellen, die normalerweise im geschlossenen Zellverband wachsen, im sogenannten Scatterversuch zu induzieren. Dabei waren vier, die EGI-1-, RPMI-, MZ CHA-1- und -2-Überstände, in der Lage, die Auflösung der geschlossenen Koloniestrukturen bei den Indikatorzellinien MDCK und NRK zu bewirken. Als Positivkontrolle wurden bei jedem Versuch Überstände von humanen, embryonalen Lungenfibroblasten MRC-5 und Mammakarzinomzellen der Ratte HH-16 cl.4 eingesetzt, die die bekannten Migrationsfaktoren HGF und MAC-MF enthielten. Wurden die humanen Pankreaskarzinomzellen HPAF als Indikatorzellen eingesetzt, zeigte nur der Überstand von MRC-5-Zellen eine Wirkung auf die Zellmigration.

Im Scatterversuch konnten neben der Zellmigration auch morphologische Veränderungen der Indikatorzellen beobachtet werden. Durch die Stimulation, die von Überstand der MRC-5-Zellen ausgelöst wurde, änderten die MDCK- und NRK-Zellen ihren epitheloiden in einen fibroblastoiden Phänotyp. Die 4 Überstände der Cholangiokarzinomzellen, die „Scatteraktivität“ enthielten, induzierten deutlich weniger ausgeprägt und nur bei den MDCK-Indikatorzellen ähnliche Veränderungen der Zellmorphologie.

Zum Vergleich der „Scatteraktivität“ in den unterschiedlichen Kulturüberständen wurden Titrationen durchgeführt. Dazu wurden Verdünnungen der Überstände bis 1:1024 im Scatterversuch eingesetzt. Bis zur Verdünnungsstufe 1:32 konnte eine positive Scatter-Aktivität in den Überständen von EGI-1-, MZ CHA-1- und HH-16 cl.4-Zellen nachgewiesen werden. Wegen unterschiedlicher Sensivität der Zellen lag der Aktivitätstiter bei Verwendung der NRK-Zellen immer höher als bei den MDCK-Indikatorzellen.

Die Migrationsfaktoren wurden auf chemokinetische und chemotaktische Effekte bei den Indikatorzellen untersucht. Die Zellinien EGI-1, MRC-5 und HH-16 cl.4 produzierten Faktoren, die chemotaktisch bis zu 104mal wirksamer waren als chemokinetisch. Invasives Wachstum konnte durch EGI-1-Überstand nicht gesteigert werden, das heißt es wurde keine Kollagenasebildung bei den Indikatorzellen induziert. Faktoren aus EGI-1- und MRC-5-Kulturen hatten im Gegensatz zu Faktoren aus HH-16 cl.4-Kulturen einen proliferationssteigernden Effekt auf MDCK-Indikatorzellen.

Neben den Untersuchungen zur biologischen Aktivität wurden auch molekulare Eigenschaften von den in den verschiedenen Überständen befindlichen Faktoren verglichen. Mit Hilfe einer Druckfiltration durch eine permeable Membran wurde das Molekulargewicht der Migrationsfaktoren aus den Cholangiokarzinomzellen eingegrenzt. Bei HH-16 cl.4-, MZ CHA-1- und -2- und RPMI-Überstand lag es zwischen 50KDa und 100KDa , bei EGI-1 über 100KDa. Ähnlich wie HGF wird der Migrationsfaktor aus EGI-1-Zellen durch Heparin in seiner Aktivität gehemmt.

Das Ergebnis der Arbeit zeigt, daß 4 der 5 Cholangiokarzinomzellen Migrationsfaktoren mit einer Wirkung auf geeignete Zielzellen produzierten. Aufgrund der molekularen und biologischen  Eigenschaften der untersuchten Kulturüberstände ist es wahrscheinlich, daß es sich bei dem von HH-16 cl.4 Zellen produzierten MAC-MF und den von den Gallengangscarcinomzellinien, insbesondere von der Linie EGI-1, sezernierten Faktoren um unterschiedliche Migrationsfaktoren handelt. Alle Faktoren unterscheiden sich in ihren Eigenschaften von HGF, wie durch den HGF-ELISA bewiesen wurde.

 

 

 

 

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Tabellenanhang

Tabelle 9: Statistische Auswertung mit Mittelwert (MW) und Standardabweichung (STABW) eines Boyden-Kammerversuches (siehe Abb. 10.) mit 2x105 eingesetzten NRK-Indikatorzellen:

Kontrolle

47500

47500

 

57500

57500

 

38750

38750

 

62500

62500

 

42500

42500

 

41250

41250

MW

48333

48333

STABW

8770

8770

 

chemokinetischer Ansatz

chemotaktischer Ansatz

EGI-1

63750

72500

 

66250

76250

 

61250

78750

 

70000

75000

 

62500

65000

 

56250

68750

MW

63333

72708

STABW

4249

4644

MRC-5

68750

78750

 

67500

71250

 

63750

76250

 

56250

68750

 

65000

80000

 

57500

83750

MW

63125

76458

STABW

4719

5124

HH-16 cl.4

67500

73750

 

72500

76250

 

66250

78750

 

65000

81250

 

62500

78750

 

71250

86250

MW

67500

79166

STABW

3461

3831

Diese Zahlen sind repräsentativ für ca. 10 Versuchs-Ansätze.

 

 

 

Tabelle 10: Statistische Auswertung eines Invasivitätsversuches (siehe Abb. 12.), dessen Ergebnisse reproduzierbar waren, mit Mittelwert (MW) und Standardabweichung (STABW):

Kontrolle

360000

360000

 

412500

412500

 

387500

387500

 

337500

337500

 

375000

375000

 

312500

312500

MW

364170

364170

STABW

32650

32650

 

chemokinetisch

chemotaktisch

EGI-1

337500

400000

 

287500

412500

 

362500

275000

 

400000

325000

 

387500

337500

 

287500

362500

MW

352080

352080

STABW

44340

46440

MRC-5

700000

762500

 

687500

800000

 

650000

775000

 

675000

850000

 

612500

675000

 

625000

725000

MW

658330

764580

STABW

32000

55160

HH-16 cl.4

537500

662500

 

550000

737500

 

500000

687500

 

537500

700000

 

587500

650000

 

562500

612500

MW

545830

675000

STABW

26680

39530

 

 

Tabelle 11: Original-Zahlen eines chemotaktischen Boyden-Kammerversuchs (siehe Abb. 13.), dessen Ergebnisse repräsentativ sind:

Kontrolle

8770

8770

 

47500

47500

 

57500

57500

 

38750

38750

 

62500

62500

 

42500

42500

Mittelwert

41250

41250

Standardabweichung

48333

48333

 

Ohne Heparin-Behandlung

Mit Heparin-Behandlung

EGI-1

72500

53750

 

76250

52500

 

78750

62500

 

75000

57500

 

65000

63750

 

68750

57500

Mittelwert

72708

57916

Standardabweichung

4644

4125

MRC-5

78750

60000

 

71250

58750

 

76250

50000

 

68750

48750

 

80000

53750

 

83750

51250

Mittelwert

76458

53750

Standardabweichung

5124

4270

HH-16 cl.4

73750

76250

 

76250

80000

 

78750

86250

 

81250

81250

 

78750

73750

 

86250

78750

Mittelwert

79166

79375

Standardabweichung

3931

3936

 

 

 

Tabelle 12: Statistische Auswertung eines Proliferationsversuchs (siehe Abb. 14.)mit 10.000 Zellen pro Ansatz. Als Indikatorzellen wurden MDCK-Zellen eingesetzt.

   MDCK

2 Tage

4 Tage

 

Kontrolle

35000

387500

 

 

36250

382500

 

 

42500

370000

 

 

35000

377500

 

 

37500

402500

 

 

40000

395000

 

MW

37708

385833

 

STABW

3002

10769

 

EGI-1

43750

562500

 

 

46250

552500

 

 

48750

550000

 

 

46250

567500

 

 

51250

575000

 

 

48750

592500

 

MW

47500

566667

 

STABW

2394

14337

 

MRC-5

73750

760000

 

 

70000

792500

 

 

61250

747500

 

 

66250

717500

 

 

71250

755000

 

 

66250

742500

 

MW

68125

752500

 

STABW

4067

22407

 

HH-16 cl.4

31250

377500

 

 

33750

385000

 

 

28750

372500

 

 

32500

367500

 

 

31250

390000

 

 

27500

372500

 

MW

30833

377500

 

STABW

2125

7773

 

 

 

 

 

Lebenslauf

 

Persönliche Daten:   

Name:                         Dr. med. Zühlke, Isabel Elena

Geburtsdatum/-ort:       16.03.1970 in Lübeck

 

Schulbildung:

1976-1980                  Matthias-Claudius-Grundschule, Reinfeld

1980-1991                  Theodor-Mommsen-Gymnasium, Bad Oldesloe

 

Hochschulbildung:

1992-1997                  Universität zu Hamburg

1997                           Universität Wien

1995/ 97/  98              Erster, zweiter und dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

 

Praktisches Jahr:

seit  Herbst 1997         Innere Medizin am Ev. Amalie-Sieveking KH, Hamburg

                                   Dermatologie an der Universitätsklinik Hamburg

                                   Chirurgie am Ev. Amalie-Sieveking KH, Hamburg

 

AiP- und Assistenzarzt-Zeit:

2/1999-7/2000            KH Großhansdorf, Zentrum für Pneumologie und Thoraxchirurgie

seit 8/2000                  Assistenzärztin s.o.

 

Wissenschaftliche Tätigkeiten:

1995-1998                  Internistische Arbeitsgruppe UKE

                                   “Motilitätsfaktoren bei Tumorzellen”

1999-2000                  Betreuung klinischer Studien, Krankenhaus Großhansdorf,

                                   Onkologischer Schwerpunkt   

                                                                                             

 

 

        Reinfeld, den 13.09.99