3          Ergebnisse

 

3.1      Synthese der Ferrozene

 

3.1.1   Synthese von [59Fe]Ferrozen

 

Ferrozen ist kommerziell erhältlich, jedoch nicht als radioaktiv markierte Eisenverbindung. Das mit [59Fe]-markierte Ferrozen wurde aus den Ausgangsverbindungen Cyclopentadien und 59FeCl2 analog einer beschriebenen Methode hergestellt (Nielsen 1993c) (s. auch.Kap. 2.2.2 und Abb. 6).

 

Abbildung 6:           Synthese von Ferrozen unter Verwendung der Radionuklide [55Fe] bzw. [59Fe]

 

 

3.1.2   Synthese von [55Fe](3,5,5-Trimethyhexanoyl)Ferrozen

 

Acylierte Ferrozene sind kommerziell nicht erhältlich. Das verwendete acylierte und radioaktiv markierte Ferrozen [55Fe](3,5,5-Trimethyhexanoyl)Ferrozen ([55Fe]TMH-Ferrozen) wurde deshalb selbst synthetisiert (Abb. 7).

Als Ausgangssubstanz wurde das [55Fe]-markierte Ferrozen entsprechend den Beschreibungen (Kap. 2.2.3) synthetisiert. Durch eine Acylierungreaktion wurde das [55Fe]Ferrozen durch eine Seitenkette ergänzt.

Durch eine weitere Acylierung des entstandenen [55Fe]TMH-Ferrozen kann aus diesem [55Fe](TMH)2-Ferrozen synthetisiert werden. Das Mengenverhältnis beider Produkte

läßt sich über die Menge des eingesetzten Katalysators (Aluminiumchlorid) gut steuern. Dadurch war es möglich, das Reaktionsgleichgewicht zugunsten des [55Fe]TMH-Ferrozens zu beeinflussen.

 

Abbildung 7:           Synthese von (3,5,5-Trimethylhexanoyl)Ferrozen unter Verwendung des Radionuklids [55Fe]

 

 

Die Trennung der Reaktionsprodukte erfolgte durch Chromatographie an Kieselgel. [55Fe]TMH-Ferrozen ist eine relativ stabile Verbindung, unempfindlich gegenüber Licht und bei +4°C über ein Jahr unzersetzt haltbar.

 

 

 

3.2      Verfügbarkeit der Ferrozene für die Hepatozyten im Inkubationsmedium

 

Das Eisen liegt im Ferrozen und TMH-Ferrozen als kovalent gebundenes und durch zwei Cyclopentadien-Ringe maskiertes Atom vor. Im TMH-Ferrozen ist diese Struktur durch eine Acyl-Gruppe an einem der Cyclopentadien-Ringe erweitert (s.Kap. 3.1). Die das Eisen-Atom umgebenden Strukturen des Ferrozens und TMH-Ferrozens bestimmen den lipophilen Charakter dieser Verbindungen, wobei Ferrozen lipophiler ist als TMH-Ferrozen. Somit sind diese Verbindungen in wässrigen Medien wie dem HIP unlöslich und bedürfen eines Lösungsvermittlers mit amphiphilem Charakter. Aus den hierfür in Frage kommenden Stoffen wurden DMSO und Ethanol ausgewählt und hinsichtlich ihrer Eignung als Detergenz für Ferrozen experimentell verglichen.

 

 

 

3.2.1   Löslichkeit von Ferrozen in Ethanol und Dimethylsulfoxid

 

Das [59Fe]Ferrozen wurde in jeweils 70 µl DMSO bzw. Ethanol aufgelöst und dieses in 6,93 ml HIP (ohne Zellen; Inkubationstemperatur 37° C; pH 7,4) pipettiert. Die Konzentration des Lösungsvermittlers im HIP betrug somit 1 Vol%. (Gesamtvolumen: 7 ml). Die Konzentration des [59Fe]Ferrozen betrug 1,5 mM.

 

Nach ca. 30 min Inkubation im Schüttelwasserbad bei 37°C wurden Aliquots zu 0,5 ml entnommen und die Radioaktivität der Proben im Hamburger 4p-Großraum-Radioaktivitätsdetektor  bestimmt. Die Ergebnisse für DMSO hatten eine geringere Streubreite um den Mittelwert als die Ergebnisse für Ethanol (Tab. 1; Abb. 8).

 

Tabelle 1:     Vergleich von DMSO und Ethanol als Lösungsvermittler

 

Zusatz

Vol%

Probenanzahl

Bq/ Probe

± SD

in %

DMSO

1

8

12473

790

6

Ethanol

1

8

12015

2711

23

 

 

Abbildung 8:           Vergleich der Löslichkeit von Ferrozen in Dimethylsulfoxid und Ethanol; Endkonzentration jeweils 1 Vol%; n=8;

 

 

 

3.2.2   Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel

 

Aufgrund der geringeren Schwankungen der Ergebnisse fiel die Entscheidung über das geeignete Lösungsmittel zugunsten des DMSO aus. Um das Ergebniss für DMSO mit einem größeren Probenumfang zu sichern, wurden weitere Versuche bei gleichem Ablauf des Experimentes wiederholt. Es wurde statt 1,5 mM [59Fe]Ferrozen 12 µM [55Fe]Ferrozen benutzt. Die DMSO-Konzentration betrug 1 Vol.%.

Der gesamte Hepatozyteninkubationspuffer (7 ml/ Gefäß) wurde nach ca. 20 min Inkubation bei 37°C im Schüttelwasserbad in Aliquots a` 0,5 ml fraktioniert und diese in ein Gefäß mit 7 ml Szintillationsflüssigkeit überführt. Die Radioaktivität der Proben wurde im b-Counter detektiert.

Wie beim Vergleich von Tab. 1 und Tab. 2 zu sehen, ließen sich die Ergebnisse des Vorversuches auch bei größerem Probenumfang sehr gut reproduzieren (Abb. 9).

 

 

 

Tabelle 2:     Verteilung des Ferrozen im Hepatozyteninkubationspuffer

 

Zusatz

Vol%

Probenanzahl

Bq/ Probe

± SD

in %

DMSO

1

65

5558

320

6

 

 

Abbildung 9:           Radioaktivitätsverteilung des [55Fe]Ferrozen in der in 0,5 ml Proben fraktionierten Ferrozen DMSO-HIP-Lösung; n=65;

 

 

 

3.2.3   Zytotoxizität von Dimethylsulfoxid

 

DMSO ist eine toxische Substanz und hat konzentrations- und zeitabhängig Einfluß auf den Zellmetabolismus (De La Vega et al. 1991). Um zu untersuchen, ob die zytotoxische Wirkung des DMSO in dieser Versuchskonstellation (maximale Versuchsdauer: 60 min, DMSO-Konzentration: 1Vol.%) einen relevanten Einfluß auf die Ferrozen- bzw. TMH-Ferrozenaufnahme hat, wurden die Hepatozyten mit DMSO-Konzentrationen von 1 bis 10 Vol.% inkubiert. Zur Überprüfung der Viabilität wurde die Trypanblau-Ausschlußmethode angewendet (Kap.2.3.3).

Abbildung 10:         Viabilität der Hepatozyten in Abhängigkeit der DMSO-Konzentration im HIP; Maximale Inkubationsdauer: 60 min; Kontrolle=100%; n=3;

 

 

Es zeigte sich, daß eine DMSO-Konzentration von 1 Vol% von den Hepatozyten relativ gut toleriert wurde. Im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne DMSO gab es eine Abnahme der Viabilität um 8%. Mit steigender Konzentration des DMSO bis zu 10 Vol% nahm auch die Viabilität der Hepatozyten ab. Bei Inkubation der Hepatozyten mit 5 Vol.% DMSO war eine Viabilitätsabnahme von 17% zu verzeichnen. Bei Verdopplung der DMSO-Konzentration auf 10 Vol% sank die Viabilität im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne DMSO im gleichen Zeitraum um 30%  (Abb. 10).

Auf der Grundlage dieser Versuche wurde in allen weiteren Versuchen mit Ferrozen und TMH-Ferrozen DMSO in einer Konzentration von 1 Vol.% als Emulgator benutzt.

 

 

 

3.3      Wiederfindung der eingesetzten Radioaktivität

 

Während der Inkubation der Hepatozyten mit den verschiedenen Eisenverbindungen ist davon auszugehen, daß durch unspezifische Anhaftung an das Inkubationsgefäß, die Pipettenspitzen oder die Eppendorfgefäße ein Teil der Radioaktivität den Zellen nicht mehr zur Verfügung steht bzw. eine fälschlicherweise erhöhte Radioaktivität in der Spitze der Eppendorfgefäße bestimmt wird. Um die Größe dieser Effekte abschätzen zu können, wurde die Summe der Radioaktivität in Zellen, Medium und Material bestimmt (=Recovery).

 

 

 

3.3.1   Radioaktivitätsverlust im Inkubationsgefäß

 

Hydrophile Eisenverbindungen

Wie auf Abb. 11 zu sehen, war die Verteilung der Radioaktivität auf Zellen und Überstand im Versuchsverlauf komplementär. Radioaktivität, die in die Zellen aufgenommen wurde, fehlte im Überstand. Die Summe der Radioaktivität (Zellen  + Überstand ) blieb konstant. Die Recovery der Radioaktivität betrug in analogen Versuchen mit [55Fe]Ascorbat 98% (n=5).

Abbildung 11:         Kinetik der Radioaktivitätsverteilung des [55Fe]Citrat (12 µM) auf Überstand (Trennöl + HIP) und Zellen; n=1;

 

 

Lipophile Eisenverbindungen

Die Radioaktivitätsverteilung für [55Fe]TMH-Ferrozen zeigt ein anderes Verteilungmuster als für [55Fe]Citrat. Wie in Abb. 12 zu sehen, war die Radioaktivität in den Zellen zu der Radioaktivität im Überstand nicht komplementär. Die Abnahme der Radioaktivität in den Zellen führte nicht erwartungsgemäß zu einer Zunahme der Radioaktivität im Medium. Im Laufe des Versuches ist somit ein Verlust an Radioaktivität aus den erfassten Kompartimenten Zellen und Medium zu beobachten. Die Radioaktivität an der Wand des Inkubationsgefäßes wurde nicht gemessen.

Bei der Durchführung des gleichen Versuches ohne den Einsatz von Zellen (Abb. 13) war der Verlust an Radioaktivität im Versuchsverlauf auch zu beobachten und in einem noch stärkerem Maß ausgeprägt als in den Versuchen mit Zellen. So liegt die Vermutung nahe, daß die verlorene Radioaktivität an der Wand des Inkubationsgefäßes unspezifisch haften geblieben ist. Unspezifische Adhäsionphänomene bei besonderer Affinität des aus Kohlenwasserstoffen bestehenden Ferrozens bzw. TMH-Ferrozens zur Wand des Inkubationsgefäßes sind hierbei denkbar.

 

 

Abbildung 12:         Kinetik der Radioaktivitätsverteilung des [55Fe]TMH-Ferrozens (12 µM) auf Überstand (Trennöl + HIP) und Zellen; n=1;

Abbildung 13:         Radioaktivitätsänderung im Inkubationsgefäß in Abwesenheit der Zellen; n=2;

 

 

 

3.3.2   Radioaktivitätsverlust im Eppendorfgefäß

 

Das Zellpellet wird nach der Trennung vom Überstand mit der Spitze des Eppendorfgefäßes in das Countergefäß überführt. Somit wird auch eine gewisse Menge an Radioaktivität an der Wand des Eppendorfgefäßes mitgemessen, die nicht zellassoziiert ist und zu falsch erhöhten Werten für die Radioaktivitätsaufnahme führt. Um diesen Anteil an der gemessenen Radioaktivität zu bestimmen, wurde der Versuch ohne Zellen durchgeführt. Die Eisenverbindung wurde in das Inkubationsgefäß pipettiert, das HIP mit der Radioaktivität in Aliquots a´ 0,5 ml fraktioniert, die Eppendorfgefäße zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und nach Zusatz von Trennöl nochmals zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Trennöls wurde die Gefäßspitze in das Countergefäß überführt. Es wurde die Radioaktivität in den Überständen (HIP und Trennöl) und die Radioaktivität in der Eppendorfgefäßspitze bestimmt (n=12).

Abbildung 14:         Unspezifische Radioaktivität, die an der Spitze des Eppendorfgefäßes nach Trennung der Zellen vom Überstand zurückbleibt; MW;  n=12

 

 

Bei der Radioaktivitätsverteilung für [55Fe]Citrat war an der Eppendorfcupspitze weniger als 0,01% der Radioaktivität zu finden.  Für [55Fe]TMH-Ferrozen ergab sich ein Anteil von 2,1% für die unspezifisch an der Cupspitze haften gebliebene Radioaktivität (Abb. 14).

 

 

 

3.4      Eisenaufnahme der Hepatozyten

 

Die Versuche zur Aufnahme der Eisenverbindungen in Hepatozyten wurden in 50 ml Gewebskulturflaschen durchgeführt. Jedes Inkubationsgefäß enthielt 7 ml Zellsuspension. Die Zellzahl wurde mit dem Coulter Counter ermittellt (s. Kap. 2.3.4) und betrug 2 bis 4 Mill /ml.

 

Die mittels Trypanblau Färbung ermittelte Viabilität der Hepatozyten (Kap. 2.3.3.) lag zwischen 60 und 80%. Die Versuchstemperatur betrug 37°C, der pH-Wert des Hepatozyteninkubationspuffers wurde auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt.

Um unspezifisch anhaftende Radioaktivität von der Hepatozytenmembran zu entfernen, wurden die Hepatozyten vom Inkubationsmedium getrennt, mit Hepatozyteninkubationspuffer gespült und durch eine Ölschicht (1:4 -Mischung aus Dibutyl- und Diocytylphthalat) zentrifugiert (s.Kap. 2.4). Die im Zellpellet bestimmbare Radioaktivität wurde als internalisierte Radioaktivität interpretiert.

Zum Verständnis der Ergebnisse zur Aufnahme der Ferrozene in die Zellen ist die Erläuterung bestimmter verwendeter  Begriffe notwendig.

 

Als Aufnahme von Radioaktivität ist die nach einer bestimmten Zeit im Zellpellet meßbare Radioaktivität definiert. Sie gibt an, welche Menge an radioaktiv markiertem Eisen nach einem bestimmten Zeitraum in der Zelle zu finden ist.

 

Die Aufnahmerate bezeichnet die Aufnahme von radioaktiv markiertem Eisen pro Minute bezogen auf 1 Million Hepatozyten. Sie bezieht sich in der Regel auf die experimentelle Halbmaximalgeschwindigkeit. Sie ist ein Maß für die Aufnahmegeschwindigkeit einer bestimmten Substanz.

 

Die Aufnahmequote gibt an, welcher  Anteil der angebotenen Menge an radioaktivem Eisen nach einer bestimmten Zeit in der Zelle zu finden ist. Sie ist ein Maß für die Eliminationskapazität der Hepatozyten für die angebotene Substanz.

 

 

 

3.4.1   Eisen aus niedermolekularen Eisenchelaten

 

Der Aufnahmemechanismus für niedermolekulares NTB-Eisen ist in vielen seiner Eigenschaften gut erforscht und in der Literatur beschrieben worden. Um in diesem Versuchsaufbau die Ergebnisse für die Aufnahme von Ferrozen und TMH-Ferrozen mit der Aufnahme von NTB-Eisen vergleichen zu können, wurden eine Reihe von Versuchen zur Aufnahme von Fe-Ascorbat, Fe-Citrat und Fe-DTPA durchgeführt.

 

 

 

3.4.1.1            [55Fe]-Askorbat

 

In den exemplarischen Versuchen mit Fe-Ascorbat (n=2) wurde die Eisenkonzentration im Inkubationsmedium auf 0,25 µM eingestellt. Das Verhältnis von Fe zu Ascorbat betrug 1:20.  Die maximale Inkubationsdauer betrug 32 min.

Die Aufnahme des 55Fe  zeigte einen asymptotischen Verlauf mit einem experimentellen Halbmaximalwert nach 10 min (Abb. 15).  Zum Zeitpukt der letzten Messung nach 32 min Inkubation lag die Aufnahmequote bei 12% des angebotenen Eisens.

 

 

 

3.4.1.2            [55Fe]-DTPA

 

Im Versuch mit [55Fe ]-DTPA lag das Verhältnis von Eisen zu DTPA bei 1:4 , die Eisenkonzentration betrug 0,25 µM.

Die Aufnahme hatte einen logarithmischen Verlauf mit einem linearen Anteil im Inkubationszeitraum bis 40 min. Der Halbmaximalwert der Aufnahme wurde nach ca. 15 min erreicht. Am Ende der Inkubation nach 50 min lag die Aufnahmequote bei ca. 12% der angebotenen Eisenmenge (Abb. 16).

 

Abbildung 15:         Aufnahmekinetik für [55Fe]Ascorbat(1:20); [55Fe] = 0,25 µM; n=2;

 

Abbildung 16:         Aufnahmekinetik für [55Fe]DTPA(1:4); [55Fe] = 0,25 µM; n=1;

 

 

 

3.4.1.3            [55Fe]-Citrat

 

Die Inkubation mit [55Fe]-Citrat erfolgte bei einer Konzentration von 0,25 µM. Das Verhältnis von Fe zu Citrat betrug1:1,5. Die maximale Versuchsdauer lag bei 40 min

Die Aufnahme von [55Fe]-Citrat zeigte, wie die Aufnahme des [55Fe]-Ascorbats, einen logarithmischen Verlauf mit einem experimentellen Halbmaximalwert (Abb. 13). Dieser

wurde nach ca. 10 min erreicht. Nach 40 min Inkubation lag die Aufnahmequote bei ca. 17% der angebotenen Menge an [55Fe].

 

Es wurde exemplarisch ein Versuch durchgeführt, bei dem die Zellen mit Trypsin vorbehandelt wurden sowie ein Versuch, bei dem die Zellen einem 100-fachen Substratüberschuß mit nicht radioaktiv markiertem [56Fe]-Citrat ausgesetzt wurden.

 

Abbildung 17:         Aufnahmekinetik für [55Fe]Citrat (1:1,5); [55Fe] = 0,25 µM; n=13;

 

 

Substratüberschuß

Ein 100-facher Substratüberschuß von 25 µM nicht radioaktiv markiertem [56Fe3+]Citrat (n=1) führte im Vergleich zur Kontrollgruppe (n=1) zu einer Abnahme der Aufnahmerate für radioaktiv markiertes [55Fe] und zeigte somit die Spezifität der Aufnahme. Der asymptotische Verlauf der Aufnahme mit einem experimentellen Halbmaximalwert nach ca. 13 min blieb erhalten. Nach 40 min war die Aufnahme im Vergleich zum Kontrollversuch ohne Substratüberschuß um 72% vermindert (Abb. 18).

 

 

Trypsinandauung der Hepatozyten

Nach Inkubation der Hepatozyten mit 1 mg Trypsin/ ml (n=1) für eine Stunde nahm die Aufnahmerate für [55Fe] stark ab. Der asymptotische Verlauf der Aufnahmekurve und der experimentelle Halbmaximalwert nach 10 min blieben aber erhalten. Durch die Vorinkubation der Hepatozyten mit Trypsin war die Aufnahme nach 40 min im Vergleich zum Kontrollversuch (n=1) um 63% vermindert (Abb. 19).

 

Abbildung 18:         Änderung der Aufnahme von [55Fe]Citrat ([55Fe]=0,25 µM) durch 100-fachen            Substratüberschuß ([56Fe]=25 µM); n=1;

 

Abbildung 19:         Änderung der Aufnahme von [55Fe]Citrat ([55Fe]=0,25 µM) nach Inkubation mit Trypsin (1mg/ ml) für eine Stunde; n=1;

 

 

 

 

3.4.2   Eisen aus [59Fe]Ferrozen und [55Fe]TMH-Ferrozen

 

3.4.2.1            [59Fe]Ferrozen

 

Die Aufnahme von Ferrozen wurde im Konzentrationsbereich von 80 nM bis 350 µM untersucht. Die Inkubationsdauer lag zwischen 10 und 60 Minuten. Aus organisatorischen Gründen (Umfang der Versuchsreihe und damit verbundener zeitlicher Ablauf) konnten in den ersten Versuchen zur Aufnahme von Ferrozen Messungen zu früheren Zeitpunkten nicht durchgeführt werden.

Abbildung 20:         Aufnahmekinetik für [59Fe]Ferrozen bei Konzentrationen <100nM und Inkubationszeiten von 5 bis 30 min

 

Eine Ausnahme bildet eine Versuchsreihe mit Ferrozenkonzentrationen unter 100 nM, in der die zellassoziierte Radioaktivität schon nach 5 min gemessen wurde und die maximale Inkubationsdauer 30 min betrug. Wie auf der Abb. 20 zu erkennen, liegt der experimentelle Halbmaximalwert der Aufnahme in dem nicht erfaßten Zeitfenster von 0 bis 5 min Das Aufnahmemaximum wurde nach 20 min erreicht. Danach fiel bis zum Inkubationsende nach 30 min die zellassoziierte Radioaktivität wieder leicht ab.

In weiteren Versuchen bei Konzentrationen < 100 nmol/ l , beidenen der Zeitraum < 10 min Inkubation nicht erfaßt werden konnte, ließen sich diese Ergebnisse bestätigen (Abb. 21). Bei höheren Konzentrationen an Ferrozen bis ca. 45 µM und Inkubationszeiten von 10 bis 60 min wurde das Aufnahmemaximum schon zum Zeitpunkt der ersten Messung nach ca. 10 min erreicht. Somit lag der experimentelle Halbmaximalwert auch hier in dem nicht untersuchten Zeitfenster von 0 bis 10 min. Im zeitlichen Verlauf schwankte die Radioaktivität um einen Mittelwert und hatte mit Zunahme der Versuchsdauer, wie auch bei geringeren Ferrozenkonzentrationen zu beobachten, eine sinkende Tendenz (Abb. 22).

Abbildung 21:         Aufnahmekinetik für [59Fe]Ferrozen bei Konzentrationen < 100 nM und Inkubationszeiten von 10 bis 60 min; MW ± SD; n=5;

Abbildung 22:         Aufnahmekinetik für [59Fe]Ferrozen bei Konzentrationen > 1µM und Inkubationszeiten von 10 bis 60 min

 

 

Auch bei höheren Konzentrationen bis 357 µM blieb das zeitabhängige Muster der Aufnahme mit Erreichen eines Maximalwertes nach 10 bis 20 min und einem nicht erfaßten Halbmaximalwert im Zeitfenster bis 10 min mit leicht abnehmender Radioaktivität zum Versuchsende hin erhalten.

Der Vergleich der jeweiligen Radioaktivität am Versuchsende mit den Aufnahmemaxima zeigte, daß keine Abhängigkeit der Radioaktivitätsabnahme von der Ferrozenkonzentration vorliegt. Am Ende der Inkubation lag der Radioaktivitätsverlust bezogen auf das Aufnahmemaximum im Durchschnitt bei 17% und bezogen auf den Mittelwert der Aufnahme aller Messungen eines Versuches bei 9% (Tab. 3).

Bei Betrachtung der Aufnahme in Abhängigkeit von der Konzentration ließ sich bis zu der maximalen experimentellen Ferrozenkonzentration von 357 µM keine Sättigungscharakteristik erkennen (Abb. 23 und  24). Mit steigender Ferrozenkonzentration im Medium nimmt die zellassoziierte Radioaktivität linear zu. In Abb. 23 und 24 werden die Werte für eine Inkubationdauer von 30 min

dargestellt. Die Ergebnisse für andere Inkubationszeiträume (10-, 20, 40, 50 und 60 min) sind in ihrem konzentrationsabhängig-linearen Verlauf identisch.

 

 

Tabelle 3:     Radioaktivitätsabfall bei der Aufnahme von Ferrozen nach 30 bzw. 60 min Inkubationsdauer

 

Konzentration

Anzahl

 

Dauer der Inkubation

Differenz zum

Mittelwert

Differenz zum Aufnahmemaximum

µM

n

min

Bq

%

Bq

%

0,009

1

30

-0,05

-33

-0,1

-50

0,018

1

30

-0,02

-6

-0,1

-24

0,036

2

30

-0,03

-4

-0,03

-3

0,071

1

30

-0,05

-5

-0,12

-11

1,4

2

60

0

0

-0,14

-14

11,1

2

60

-0,82

-12

-1,79

-23

44,6

2

60

-2,28

-8

-5,46

-17

357

2

60

-36

-18

-88

-34

Abbildung 23:         Aufnahme des [59Fe]Ferrozen in Abhängigkeit von der Konzentration; Inkubationsdauer 30 min;

Abbildung 24:         Ausschnitt aus Abbildung  23

 

 

 

3.4.2.2            [55Fe]TMH-Ferrozen

 

Die Versuche zur Aufnahme von TMH-Ferrozen wurden in einem Konzentrationsbereich von 5 µM bis 200 µM durchgeführt. Die Inkubationdauer der Hepatozyten mit TMH-Ferrozen betrug jeweils 1, 5, 10, 20, 30 und 40 min.

 

Die Aufnahmekinetik des [55Fe]TMH-Ferrozens ist mit der von [59Fe]Ferrozen vergleichbar. Der sehr schnelle Anstieg der zellassoziierten Radioaktivität innerhalb der ersten Minuten mit einem Aufnahmemaximum nach ca. 10 min und einem experimentellem Halbmaximalwert nach weniger als 1 min ist hier durch die regelmäßig erfolgten frühen Messungen nach 1 und 5 min Inkubation gut zu sehen (Abb. 25). Besonders gut stellt sich dieser Befund an der Aufnahme von 200 µM TMH-Ferrozen dar. Im weiteren zeitlichen Verlauf ist  - wie bei der Ferrozenaufnahme auch -  eine Abnahme der zellassoziierten Radioaktivität festzustellen. Der Vergleich der Radioaktivitätsabnahme für unterschiedliche TMH-Ferrozenkonzentrationen zeigt keine Abhängigkeit des Radioaktivitätsabfalls von der Konzentration (Tab. 4). Der Radioaktivitätsabfall bezogen auf den Mittelwert aller Messungen eines Versuches betrug im Durchschnitt 8% und bezogen auf das Aufnahmemaximum 15%.

 

Um zu sehen, wie sich die beobachtete Tendenz zur Radioaktivitätsabnahme mit der Zeit bei längerer Inkubationsdauer verhält, wurde ein Versuch mit einer maximalen Inkubationsdauer von 127 min durchgeführt. Wie auf der Abb. 26  zu sehen, unterscheidet sich der Verlauf der zellassoziert-detektierten Radioaktivität in dem schon untersuchten Zeitfenster bis 40 min Inkubation nicht von den bisherigen Ergebnissen. Allerdings stabilisiert sich die Radioaktivitätsabnahme der Zellen nach ca. 60 min und bleibt bis zum Versuchsende nach 127 min nahezu konstant.

Die Aufnahme von TMH-Ferrozen zeigte bis zu einer Konzentration von 200 µM keine Sättigungscharakteristik (Abb. 27). Proportional zur TMH-Ferrozenkonzentration nahm auch die zellassozierte Radioaktivität zu. In Abb. 27 ist die Aufnahme für die einzelnen Konzentrationen nach 30 min Inkubationdauer zu sehen. Die konzentrationsabhängige Linearität der Aufnahme blieb über die gesamte Versuchsdauer erhalten (1, 5, 10, 20, 30 und 40 min).

Abbildung 25:         Aufnahmekinetik für [55Fe]TMH-Ferrozen bei Konzentrationen bis 200 µM und Inkubationszeiten von 1 bis 40 min;  MW ± SD; n=5;

 

 

Tabelle 4:     Radioaktivitätsabfall bei der Aufnahme von TMH-Ferrozen nach 60 min Inkubationsdauer

                         

Konzentration

Anzahl

 

Dauer der Inkubation

Differenz zum

Mittelwert

Differenz zum

Aufnahmemaximum

µM

n

min

Bq

%

Bq

%

 

5

5

60

-948

-14%

-1267

-18%

 

10

5

60

-1904

-15%

-3316

-24%

 

25

5

60

-4814

-14%

-7973

-21%

 

50

5

60

-4403

-7%

-6826

-10%

 

100

5

60

-18488

-14%

-32055

-22%

 

200

5

60

+2634

+1%

-11167

-5%

Abbildung 26:         Aufnahmekinetik für [55Fe]TMH-Ferrozen (25 µM) bei einer maximalen Inkubationsdauer von 127 min; n=1;

Abbildung 27:         Aufnahme des [55Fe]TMH-Ferrozen in Abhängigkeit von der Konzentration;

Daten für 30 min Inkubationsdauer; MW ± SD; n=5;

 

 

Temperaturabhängigkeit der Aufnahme

Um Informationen über den chemischen Charakter der Membranstrukturen zu bekommen, welche für die Aufnahme des TMH-Ferrozen verantwortlich sind, wurden Versuche mit 25 µM TMH-Ferrozen bei Temperaturen von 12°, 16°, 20°, 24° und 36° Celsius durchgeführt.

 

Zur graphischen Darstellung von Aufnahmeprozessen, die temperaturabhängig sind, hat sich die Darstellung nach Arrhenius als vorteilhaft erwiesen. Dadurch werden charakteristische Verläufe der Aufnahmeänderung gut dargestellt. Es wird hierfür der Logarithmus der gemessenen Radioaktivität [ log(cpm/ 0,5 ml Aliquot)] gegen den reziproken Wert der Temperatur in Kelvin multipliziert mit 1000 [1000/temp(K)] aufgetragen.

 

Wie in Abb. 28 zu sehen, zeigte sich beim Arrhenius-Plot der cpm/ 0,5 ml Aliquot, daß die Ferrozenaufnahme bei Temperaturen zwischen 12° und 36° Celsius nahezu konstant blieb. Die maximale Abnahme der Aufnahme nach Ende der Inkubation lag bei 21%.

Abbildung 28:         Aufnahme des [55Fe]TMH-Ferrozen in Abhängigkeit von der Temperatur; Temperaturgradient von 285K (12°C) bis 309K (36°C); MW und  ± SD; n=3;

 

 

pH-Abhängigkeit der Aufnahme:

Es wurden Versuche bei pH-Werten von 5,0/ 5,5/ 6,0/ 6,5/ 7,0/ 7,5 und 8,0 durchgeführt. Die TMH-Ferrozenkonzentration betrug in allen Versuchen 25 µM.

Die Durchführung der Aufnahmeversuche bei pH-Werten von 5,0 bis 8,0 zeigte nur geringfügige Unterschiede zwischen dem sauren und dem alkalischen Bereich. Das Aufnahmemaximum lag bei einem pH-Wert von 5,0. Durch die Erhöhung des pH-Wertes nahm die Menge der zellassoziierten Radioaktivität ab. Das Aufnahmeminimum war bei einem pH-Wert von 8,0 erreicht (Abb. 29; Tab. 5). Jedoch zeigte sich im Vergleich zur Kontrolle (pH 7,5; n=2), daß die Aufnahmeänderung bei allen pH-Werten bis auf pH 5,0 nicht signifikant waren. Zur Signifikanzprüfung wurden die Werte für die Aufnahme nach 30 min Inkubation herangezogen.

 

Insgesamt hatte die Änderung des pH-Wertes des Inkubationsmediums auf die Aufnahme des TMH-Ferrozen keinen signifikanten Einfluß.

 

 

Abbildung 29:         Aufnahme des [55Fe]TMH-Ferrozen in Abhängigkeit vom pH-Wert; pH 5,0 bis pH 8,0; MW ± SD; n=4;

 

 

Tabelle 5:     Einfluß des pH-Wertes auf die Aufnahme des TMH-Ferrozen; Aufnahme in % der Kontrolle;

 

pH-Wert

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

in %

113,3

109,6

93

92,4

94,5

=100%

89,8

 

 

 

Wirkung von Trypsin auf die Aufnahme

Die Versuche zur Aufnahme von [55Fe]TMH-Ferrozen durch Trypsin-vorbehandelte Hepatozyten wurden gleichzeitig mit den Versuchen zur Aufnahme von [55Fe]Citrat unter den selben Bedingungen durchgeführt. Die TMH-Ferrozenkonzentration in diesen Versuchen lag bei 25 µM.

 

 

Abbildung 30:         Änderung der Aufnahme des [55Fe]TMH-Ferrozen durch Behandlung der Hepatozyten mit Trypsin (1mg/ ml); Inkubationsdauer 1 Stunde; Terminierung             der Trypsinwirkung durch Antitrypsin (0,1 mg/ ml); MW  ±  SD; n=3;

 

 

Tabelle 6:     Effekt der Trypsinandauung auf die Aufnahme des TMH-Ferrozen; Differenz zur Kontrolle in %;

 

Zusatz

 

 

t(min)

 

 

 

MW

 

1

5

10

20

30

40

 

Trypsin

-32,2

-31,6

-33,2

-31,6

-29,8

-5,9

-23,9

 

 

Nach Inkubation der Hepatozyten mit Trypsin (1 mg/ ml) für eine Stunde wurde die proteolytische Radioaktivität mit Antitrypsin (0,1 mg/ ml) beendet.

Durch diese Behandlung sank die Aufnahme im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant. Im Durchschnitt aller Ergebnisse eines Versuches betrug die Abnahme 23,9% (Abb. 30 und Tab. 6).

Dies ist möglicherweise ein Hinweis für die Beteiligung von Membranstrukturen mit Peptidketten an der Aufnahme.  Allerdings ist die Verminderung der Aufnahme im Vergleich zu der von Fe-Citrat (Abnahme um 63%;  Kap. 3.2.1.3) relativ gering.

 

 

Substratüberschuß mit [56Fe]TMH-Ferrozen

In den Versuchen mit Substratüberschuß wurde zu 25 µM [56Fe]TMH-Ferrozen im Hepatozyteninkubationspuffer die hundertfache Menge (2,5 mM) an nicht radioaktiv markiertem [56Fe]TMH-Ferrozen zugesetzt. Das [56Fe]TMH-Ferrozen wurde vorher in DMSO gelöst und und in einem Volumen von 70 µl auf 6,93 ml Zellsuspension pipettiert. Erst nach 20 min Vorinkubation mit [56Fe]TMH-Ferrozen wurde der Versuch mit dem Zusatz des [55Fe]TMH-Ferrozen begonnen.

 

Der Zusatz von [56Fe]TMH-Ferrozen im Überschuß führte zu einer signifikant verminderten Aufnahme von Radioaktivität in die Zellen (Abb. 27).

Im Durchschnitt war die Aufnahme um 27,4% vermindert (Tab. 7). Im Vergleich hierzu war die Aufnahme von Fe-Citrat nach Substratüberschuß um 72% vermindert.

 

 

Tabelle 7:     Änderung der Aufnahme durch 100-fachen Substratüberschuß an nicht radioaktiv markiertem TMH-Ferrozen; Differenz zur Kontrolle in %;

Zusatz

 

 

t(min)

 

 

 

MW

 

1

5

10

20

30

40

 

25 µM [56Fe]

TMH-Ferrozen

 

-31,6

 

-26,4

 

-28,7

 

-26,3

 

-24,9

 

-26,9

 

-27,4

 

 

 

Abbildung 31:         Änderung der Aufnahme des [55Fe]TMH-Ferrozen durch 100-fachen Substratüberschuß an [56Fe]TMH-Ferrozen(2,5 mM); MW ± SD; n=4;

 

 

 

Zusatz von Apo-Transferrin und Holo-Transferrin

Apo- und Holo-Transferrin wurden in einer Konzentration von 12 µM verwendet. Das lypholisierte Apo- bzw. Holo-Transferrin wurde vor dem Einsatz in HIP gelöst und der Zellsuspension 20 min vor Versuchsbeginn zugegeben.

 

 

 

Tabelle 8:     Einfluß von Apo- und Holo-Transferrin auf die Aufnahme des TMH-Ferrozen; Differenz zur Kontrolle in %;

 

Zusatz

 

 

t(min)

 

 

 

MW

 

1

5

10

20

30

40

 

Apo-Transferrin

-2,8

-2,43

4,89

-3,56

-7,00

-10,83

-4,58

Holo-Transferrin

-1,1

-1,08

-2,84

-1,83

-3,73

-7,82

-2,34

 

 

 

Sowohl das Apo- als auch das Holo-Transferrin hatten auf die Aufnahme des TMH-Ferrozen keinen signifikanten Einfluß (Abb. 32). Im Vergleich zur Kontrollgruppe verminderte das Apo-Transferrin die Aufnahme im Durchschnitt um 4,6% und das Holo-Transferrin um 2,3% (Tab. 8).

 

 

Abbildung 32:         Aufnahme des [55Fe]TMH-Ferrozen bei Zusatz von Apo- und Holo-Transferrin; MW ± SD; n=4;

 

 

Zusatz von Eisenchelatoren

Als Chelatoren für Eisen wurden Ascorbat, Citrat, DFO, DTPA EDTA, Tiron und L1 verwendet.

Neben dreiwertigem Eisen komplexiert EDTA auch zweiwertiges Eisen, hat aber für Fe2+ eine viel kleinere Bindungskonstante. Ascorbat ist neben seiner Eigenschaft als effektiver Chelator auch ein Reduktionsmittel, welches Fe3+ zu Fe2+  reduzieren kann.

 

Alle Chelatoren außer L1 wurden in einer Konzentration von 1 mM verwendet. L1 wurde in einer Konzentration von 0,5 mM eingesetzt. Die Hepatozyten wurden 15 min vor Zusatz von 25 µM TMH-Ferrozen mit den Chelatoren vorinkubiert.

Alle verwendeten Chelatoren führten in unterschiedlichem Maße zur Verminderung der aufgenommen Radioaktivität (Abb. 33). Dabei zeigte DFO mit im Durchschnitt 1,7% Radioaktivitätsabfall in den Zellen den geringsten und EDTA mit 9,2% den größten Effekt unter den Komplexbildnern. Die restlichen Chelatoren führten zu Radioaktivitätsminderungen in den Zellen zwischen 5,3% und 7,7% (Tab. 9). Die Radioaktivitätsabnahme durch die verwendeten Chelatoren war nicht signifikant.

 

 

 

 

Tabelle 9:     Einfluß von Eisenchelatoren auf die Aufnahme des TMH-Ferrozens; Differenz zur Kontrolle in %;

 

Zusatz

 

 

t(min)

 

 

 

MW

 

1

5

10

20

30

40

 

Ascorbat

-4,94

-6,53

-8,75

-6,65

-6,22

-7,40

6,65

Citrat

-4,89

-6,72

-11,65

-3,61

-11,48

-13,30

7,72

DFO

0,35

-3,96

0,79

-3,83

-3,51

-1,91

1,74

DTPA

0,14

-7,35

-13,16

-13,05

-9,55

-13,06

5,29

EDTA

-7,10

-7,13

-10,51

-9,25

-10,82

-11,02

9,15

L1

-4,78

-10,27

-5,62

-8,79

-6,55

-5,95

6,75

Tiron

-3,36

-5,00

-6,02

-5,77

-8,39

-12,22

6,26

 

 

Abbildung 33:         Aufnahmekinetik des [55Fe]TMH-Ferrozen (25 µM) bei Zusatz von diversen Chelatoren: ein Überblick; MW ± SD; n=4;

 

 

Zusatz von Me 2+  Salzen

Um Informationen über eine mögliche Beteiligung von Ionenkanälen bei der Aufnahme von Eisen aus TMH-Ferrozen zu gewinnen, wurden als 2-wertige Metalle die Salze von Co2+, Cu2+, Mn2+ und Zn2+ eingesetzt. Vor dem Zusatz wurden die Salze der Metalle in HIP gelöst. Die Hepatozyten wurden 20 min vor Inkubation mit 25 µM   TMH-Ferrozen mit jeweils 1 mM Co(NO3)2, CuSO4*5H2O, ZnSO4*7H2O und MnSO4*H20 vorinkubiert.

Wie in Abb. 34 zu sehen, war der Einfluß der Metallsalze auf die Aufnahme von TMH-Ferrozen gering. Alle verwendeten Salze führten zu einer leicht erhöhten Aufnahme des TMH-Ferrozen in die Zellen. Dabei zeigte sich für Zn2+ mit ca. 10,1% Aufnahmesteigerung im Durchschnitt der höchste Wert. Die Werte für Co2+, Cu2+ und  Mn2+, lagen zwischen 3 und 3,8%. Der Zusatz der Metallsalze hatte keinen signifikanten Effekt auf die Aufnahme (Tab. 10).

 

 

Tabelle 10:   Effekte einiger zweiwertiger Metallsalze auf die TMH-Ferrozenaufnahme; Differenz zur Kontrolle in %;

 

Zusatz

 

 

t(min)

 

 

 

MW

 

1

5

10

20

30

40

 

Co2+

4,45

3,90

2,82

5,06

5,70

1,99

3,75

Cu2+

-2,79

3,71

4,37

2,85

4,07

1,35

2,99

Mn2+

7,70

7,05

6,40

0,76

-1,27

2,81

3,13

Zn2+

3,96

9,6

6,28

13,77

11,58

10,14

8,53

 

Abbildung 34:         Aufnahmekinetik des [55Fe]TMH-Ferrozen(25 µM) bei Zusatz von zweiwertigen             Metallsalzen; MW ± SD; n=3;

 

 

Zusatz von Ferricyanid

Die Hepatozyten wurden 20 min mit Ferricyanid vorinkubiert. Die Konzentration des Ferricyanids betrug 1 mM. Das Ferricyanid wurde vor dem  Zusatz zur Zellsuspension in HIP gelöst. Im Durchschnitt war die Radioaktivität in den Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe um 11,6% erniedrigt (Tab. 11 und Abb. 35).  Die Prüfung der Signifikanz ergab keinen Unterschied zu der Kontrollgruppe.

 

Abbildung 35:         Aufnahmekinetik des [55Fe]TMH-Ferrozen(25 µM) bei Zusatz von Ferricyanid; MW ± SD; n=3;

 

 

Tabelle 11:   Änderung der Aufnahme des TMH-Ferrozen durch Ferricyanid; Differenz zur Kontrolle in %;

 

Zusatz

 

 

 

t(min)

 

 

MW

 

1

5

10

20

30

40

 

Ferricyanid

-8,41

6,14

-13,78

-12,25

-15,26

-18,06

11,58

 

 

Zusatz von Na-Cyanid

Na-Cyanid wurde in einer Konzentration von 1 mM 20 min vor Versuchsbeginn der Zellsuspension zupipettiert.

Wie auf Abb. 36 zu sehen, war über den gesamten Versuchszeitraum keine signifikante Aufnahmedifferenz zwischen Kontrollgruppe und mit Na-Cyanid inkubierten Zellen zu beobachten. Im Durchschnitt sank die Aufnahme der mit dem Zellgift behandelten Zellen um 2,5% im Vergleich zur Kontrollgruppe (Tab. 12).

 

Abbildung 36:         Aufnahmekinetik des [55Fe]TMH-Ferrozen (25 µM) bei Zusatz von Na-Cyanid, MW  ± SD,  n=3;

 

 

Tabelle 12:   Einfluß des Na-Cyanid auf die Aufnahme von TMH-Ferrozen; Differenz zur Kontrolle in %;

 

Zusatz

 

 

t(min)

 

 

 

MW

 

1

5

10

20

30

40

 

Na-Cyanid

-4,45

-1,24

-0,45

-1,91

-2,96

-17,66

2,50