2          Material und Methoden

 

2.1      Verwendete Lösungen

 

2.1.1   Perfusionslösungen für die Hepatozytengewinnung

 

Die Zellen wurden nach einer modifizierten Form der Kollagenaseperfusionsmethode von Seglen (1976) gewonnen. Hierfür wurden zwei unterschiedliche Lösungen, Perfusionslösung A und Perfusionslösung B, verwendet.

 

Zusammensetzung der Perfusionslösung A

*  200 ml PBS, pH 7,4

*  2 ml HEPES (1 M)

*  1,82 ml Glucose 40%ig

*  38 mg EGTA in 0.8 ml NaOH (1 M)

             

Zusammensetzung der Perfusionslösung B

*  250 ml DMEM, pH 7,4

*  2,5 ml HEPES (1 M)

*  82 mg CaCl2

*  70 - 75 mg Kollagenase ( in Abhängigkeit vom Tiergewicht)

 

Die Kollagenase wurde unmittelbar vor Beginn der Perfusion zur Perfusionslösung B zugegeben. Die Lösungen wurden unmittelbar vor den Versuchen frisch angesetzt und vor der Perfusion im Inkubationsbad auf 37° C erwärmt.

 

 

 

2.1.2   Pufferlösungen für die Zellfraktionierung und die Zellinkubation

 

Für die Fraktionierung der Zellen im weiteren Versuchsverlauf wurde ein Hepatozytenwaschpuffer (HWP) und für die Inkubation der Zellen in einem geeigneten Medium ein Hepatozyteninkubationspuffer (HIP) verwendet. Diese wurden nach Angaben in der Literatur hergestellt (Nilsen 1991). Die Zusammensetzung der Lösungen und die Konzentrationen der einzelnen Komponenten sind unten aufgeführt.

 

 

Hepatozytenwaschpuffer (HWP)

*  142 mM NaCl

*  6,7 mM KCl

*  1,2 mM CaCl2 x 2H2O

*  10 mM HEPES

*  5 mM NaOH

*  mit 1 N NaOH auf pH 7,4 eingestellt

 

Hepatozyteninkubationspuffer (HIP)

*  68,4 mM NaCl

*  5,4 mM KCl

*  1,2 mM CaCl2 x 2H2O

*  0,6 mM MgCl2 x 6H2O

*  1,1 mM KH2PO4

*  0,7 mM Na2SO4 x 10H2O

*  30,2 mM  HEPES

*  30,1 mM TES

*  36,3 mM Tricin

*  40 mM NaOH

*  mit 1 N NaOH auf pH 7,4 eingestellt

 

Der Hepatozytenwaschpuffer und der Hepatozyteninkubationspuffer wurden zehnfach konzentriert angesetzt (Gesamtvolumen: 1 Liter), mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und bei +4°C gelagert. Kurz vor dem Versuch wurden jeweils 50 ml entnommen und mit Aqua bidest. auf  500 ml aufgefüllt (1:10 Verdünnung), um die richtige Konzentration zu erhalten. Der pH-Wert wurde danach erneut überprüft und bei Abweichungen von pH 7,4 korrigiert.

 

 

 

2.2      Radioaktiv markierte Eisenverbindungen und ihre Synthese

 

2.2.1   Synthese von 3,5,5-Trimethylhexanoylchlorid

 

Die Synthese von 3,5,5-Trimethylhexanoylchlorid aus 3,5,5-Trimethylhexanal erfolgte nach der Methode von Brunner  (1949).

In einem Rundkolben mit Gasdurchleitungsrohr und Magnetrührer wurde durch 25 ml (140 mmol) 3,5,5-Trimethylhexanal während 36 h Sauerstoff geleitet. Anschließend wurden zu der entstandenen Carbonsäure 8,75 g (63,5 mmol) Phosphortrichlorid zugesetzt und unter Feuchtigkeitsabschluß (Calciumchloridröhrchen) 5 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Abdekantieren der flüssigen Phase wurde im Wasserstrahlvakuum destilliert.

 

*  Ausbeute:      17,8 g  (73,8%) 3,5,5-Trimethylhexanoylchlorid

 

 

 

2.2.2   Synthese von [59Fe]Ferrozen

 

Zu einer Suspension von 349 mg Eisenpulver (6,21 mmol) in 6 ml  2 M HCl wurden 1 ml einer Lösung von 59FeCl3Lösung (71 MBq) in 0,1 M HCl zugegeben. Unter N2-Schutzgas und leichtem Rühren wurde die Suspension bis zur vollständigen Auflösung des Eisens erwärmt. Die blaugrüne, klare Lösung wurde gefriergetrocknet und der Rückstand anschließend in 20 ml DMSO aufgenommen.

In einem 250 ml zwei-Hals-Kolben mit Magnetrührer und  Tropftrichter wurden unter N2-Schutzgas 2,6 g fein pulverisiertes KOH in 25 ml Dimethoxyethan suspendiert. Nach Zugabe von 2,6 ml (31,46 mmol) frischdestilliertem Cyclopentadien wurde das  59FeCl2  in DMSO während 60 min langsam zugetropft. Nach weiterem Rühren bei Raumtemperatur über 60 min wurde der Reaktionsansatz auf eine Mischung aus 40 g Eis, 20 ml H2O und 3 ml konzentrierte HCl gegossen. Die sich sofort abscheidende gelbe Substanz wurde abfiltriert (Glasnutsche) und über P2O5 getrocknet.

 

*  Ausbeute:            0,692 g [59Fe]Ferrozen (3,66 mmol) als Pulver; (58,9% bezogen auf eingesetztes elementares Eisen); Molekulargewicht:         189,6

Das [59Fe]Ferrozen wurde in  Dimethylsulfoxid gelöst und in Portionen zu 140 µl DMSO mit 71,42 mM [59Fe]Ferrozen fraktioniert. Die Radioaktivität der einzelnen Proben wurde im 4 p-Großraum-Radioaktivitätsdetektor der Abteilung Medizinische Biochemie, UKE bestimmt. Bis zur Verwendung in den Versuchen wurden die Proben eingefroren. Bei Bedarf wurde eine Probe aufgetaut und unter Berücksichtigung des Aktivitätsabfalls die Radioaktivität berechnet. Die Probe wurde dann in einem geometrischen Verdünnungsverfahren auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt.

 

 

 

2.2.3   Synthese von [55Fe](3,5,5-Trimethylhexanoyl)Ferrozen

 

Das [55Fe]Ferrozen als Ausgangssubstrat für die [55Fe]TMH-Ferrozen-Synthese wurde analog zu der Synthese des [59Fe]Ferrozen hergestellt (Kap. 2.2.2). Die für die Synthese eingesetzten Substratmengen sind unten tabellarisch aufgeführt

 

*  350 mg Eisenpulver (6,22 mmol),

*  6 ml  2 M   HCl,

*  110 µl  55FeCl3  Lösung  (74  MBq)  in  0.5 M  HCl,

*  14 ml Dimethylsulfoxid,

*  2,5 g KOH in 25 ml Dimethoxyethan und

*  4 ml (48,4 mmol) frischdestilliertes Cyclopentadien.

 

*  Zwischenprodukt:     0,697 g [55Fe]Ferrozen als Pulver (3,68 mmol)

                                         (59,1%)bezogen auf eingesetztes elementares Eisen)

 

 

Die Synthese des [55Fe]TMH-Ferrozen durch Acylierung des Ferrozens mit 3,5,5-Trimethylhexanoylchlorid ist von Latrell et al. beschrieben worden (Lattrell et al. 1978). Diese Methode wurde hier leicht modifiziert angewendet.

 

In einem 100 ml Rundkolben  mit Magnetrührer wurden 472 mg [55Fe]Ferrozen (2,51 mmol), 350 mg (2,6 mmol)  AlCl3 und 40 ml Methylenchlorid vorgelegt. Während einer Stunde wurde unter Eis-Wasser-Kühlung  6 x 100 µl  3,5,5-Trimethyhexanoylchlorid zupipettiert. Nach Säulenchromatographie an Kieselgel (3,3 x 80 cm,  Laufmittel Toluol) wurden zwei Fraktionen aufgefangen. Das Lösungmittel wurde in Vakuum eingedampft und die Mengen an [55Fe]Ferrozen und [55Fe]TMH-Ferrozen als Pulver bestimmt. Die radiochemische Reinheit betrug nach Dünnschichtchromatographie und HPLC (Lichrosorb-7-phenyl-Säule, E. Merck; Methanol:Wasser (80:20)) über  99%.

 

*  Ausbeute:               Fraktion 1: 0,054 g [55Fe]Ferrozen als Pulver (0,29 mmol) Fraktion 2: 0,512 g [55Fe]TMH-Ferrozen als Pulver (2,7 mmol) (43% bezogen auf eingesetztes elementares Eisen) Molekulargewicht:        325,26

 

[55Fe]TMH-Ferrozen wurde in Ethanol gelöst und kühl gelagert (bei 4°C und Lichtabschluß über 3 Monate stabil). Unmittelbar vor dem Versuch wurde die benötigte Menge  entnommen und das Ethanol mit Stickstoff abgedampft. Nach Verflüchtigung des Ethanols blieb das [55Fe]TMH-Ferrozen als rötlicher Belag am Reagenzglasboden zurück. Unmittelbar vor der Inkubation mit den Hepatozyten wurde das [55Fe]TMH-Ferrozen in Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgenommen.

 

 

 

2.2.4   Herstellung der radioaktiv markierten Eisenchelate

 

Als Eisenchelate wurden [55Fe2+]-Ascorbat [55Fe3+]-Citrat und[55Fe3+]-DTPA benutzt. Die instabile Ascorbat-Lösung wurde erst unmittelbar vor jedem Versuch frisch hergestellt. Die Citrat-Lösung und die DTPA-Lösung sind nach Herstellung bei +4°C gelagert worden. Die Eisenchelate [55Fe2+]-Ascorbat (1:20) ,[55Fe3+]-Citrat (1:1,5) und [55Fe3+]-DTPA (1:4) wurden immer frisch, unmittelbar vor jedem Versuch zubereitet und bis zum Gebrauch auf Eis gestellt, um die Bildung von polymerem Eisen möglichst gering zu halten.

Als radioaktiv markiertes Eisen wurde 55FeCl3 in 0,5 N HCl von der Firma NEN (spez. Radioaktivität = 24,8 mCi/ mg, Konzentration =17,35 mCi/ ml, Volumen: 115 µl, 2 mCi) verwendet.

 

 

 

2.3      Gewinnung viabler Hepatozyten

 

Für die Versuche wurden weibliche Wistar-Ratten (150g-340g) verwendet. Gemäß dem Hamburger Tierschutzgesetz wurde die Tierversuchsgenehmigung bei der Behörde für Arbeit, Gesundheit und Soziales, Abteilung gesundheitlicher Verbraucherschutz und Veterinärmedizin beantragt und genehmigt ( Genehmigungsnummer: F 17-95).

Die Gewinnung viabler, hochgereinigter Hepatozyten aus der Rattenleber erfolgte nach der Methode von Seglen in etwas abgewandelter Form. Diese Methode läßt sich in vier Arbeitsschritte einteilen:

 

  1. Perfusion der Leber, um eine Zellsuspension zu erhalten,

2.      Trennung der nicht-parenchymalen Zellen von den Hepatozyten,

3.     Feststellung der Viabilität in der gereinigten Zellsuspension und

  1. Bestimmung der Zellzahl in der Zellsuspension.

 

 

 

2.3.1   Leberperfusion

 

Die Ratten wurden vor dem Eingriff durch intraperitoneale Injektion von 0,3-0,4 ml Betäubungsmittel (NembutalR = Phenobarbital) betäubt. Der Eingriff wurde erst begonnen, wenn die Anästhesierung des Versuchstieres sichergestellt war. Bei unzureichender Betäubung wurden 0,2-0,3 ml Nembutal  - in Abhängigkeit vom Gewicht des Versuchstieres -  nachinjiziert.

 

Nach erfolgreicher Anästhesie wurde das Versuchstier mit dem Rücken auf den OP Tisch gelegt und die Extremitäten mit Kanülen fixiert. Zur Vermeidung von auffliegenden Fellhaaren wurde die Bauchseite mit 70%igem Alkohol benetzt, wonach vorsichtig das Bauchfell abgepelzt und durch einen Längsschnitt die Bauchhöhle bis zum Zwerchfell eröffnet wurde. Bei einem Teil der Versuche wurde 0.5 ml Thrombophob entsprechend 25000 i.E. intralienal injiziert. In den restlichen Versuchen wurde das Thrombophob der Perfusionslösung A zugesetzt.

Es wurde die Portalvene möglichst distal zur Veneneinmündung in die Leber punktiert. Nach erfolgreicher Punktion wurde die Punktionsnadel in der Portalvene mit einer Klemme fixiert. Die Leber wurde mit der Perfusionslösung A über ca. 5 Minuten mit einer Flußgeschwindigkeit von 22 ml/ min perfundiert, wobei die Leber durch die Auswaschung der Blutzellen kontinuierlich abblasste. Nach Beginn der unidirektionalen Perfusion wurde die Hohlvene mit der Bauchaorta durchgeschnitten und das Zwerchfell perforiert, um einen schnellen Tod des Versuchstieres herbeizuführen.

 

Nach Perfusion mit Perfusionslösung A wurde die Kollagenaseperfusion angeschlossen und die Leber für ca.8 Minuten mit einer Flußgeschwindigkeit von 22 ml/ min konstant  perfundiert. Die Kollagenase führte zur Desintegration des Zellverbandes bei intakter Leberkapsel.

 

Anschließend wurde die Leberkapsel von seinen Verbindungen im Bauchraum befreit, die Leber entnommen und in eine Petrischale mit auf  +4°C gekühltem DMEM überführt.

Hier wurde die Kapsel der Leber durch einen Schnitt eröffnet und die gelösten Zellen vorsichtig in gekühltes Medium (DMEM) ausgestrichen. Die Zellsuspension wurde mehrfach durch einen Gazefilter von Gewebsklumpen befreit, in Zentrifugierröhrchen überführt und jeweils mit DMEM auf 50 ml aufgefüllt.

 

 

 

2.3.2   Zellfraktionierung

 

Die nach der Kollagenaseperfusion erhaltene Zellsuspension enthielt neben den intakten parenchymalen Zellen (Hepatozyten) auch unerwünschte Bestandteile wie die Zellen der Sinusoide (Endothelzellen, Kupfer-Zellen, Pit-Zellen), die perisinusoidalen Fettspeicherzellen (Ito-Zellen), Zellfragmente, Zellklumpen, Bindegewebszellen und subzelluläre Bestandteile . Ziel der Zellfraktionierung war es, die parenchymalen Zellen von den sonstigen Bestandteilen der Zellsuspension zu trennen. Hierfür hat sich die Trennung mittels Zentrifugation bei Umdrehungszahlen unter 1000 Umdrehungen pro Minute (UPM) als vorteilhaft erwiesen.

 

Die intakten Hepatozyten sind größer und schwerer als die nicht-parenchymalen Zellen. Auch die nicht mehr intakten Hepatozyten verlieren durch z.B. Verlust an Cytosol auch an Gewicht. Die Zellfragmente und subzellulären Kompartimente sind die leichtesten Komponenten der Zellsuspension (Hendriks et al. 1990). Dadurch erhält man nach mehrfacher Zentrifugation bei geeigneter Zellzahl und Dekantierung des Überstandes ein Zellpellet (sedimentierte Zellen ), welches weitestgehend von den oben aufgeführten Bestandteilen befreit ist und eine reine Hepatozytenfraktion darstellt (Seglen 1976). Abb. 4 zeigt in einer Übersicht die einzelnen Schritte der Zellfraktionierung zur Gewinnung einer Hepatozytensuspension. Die Zellfraktionierung wurde bei Temperaturen zwischen 0° und +4°C durchgeführt, um die Zellaggregation zu verringern und den Stressmtabolismus der Zellen zu senken (Seglen 1976).

 

 

Zentrifugationszyklus 1

Um eine von nicht erwünschten Bestandteilen gereinigte Zellsuspension zu erhalten, wurden 50 ml  Zellsuspension in dem Zentrifugationsröhrchen  3 x 3 min bei 500 UPM (50 g) zentrifugiert. Nach jedem Zentrifugieren wurde der Überstand dekantiert, die Zellsuspension mit DMEM (4°C) auf ein Volumen von 50 ml  aufgefüllt und durch leichtes Schwenken die Zellen aus dem Pellet in Schwebe gebracht. Nach der 3. Zentrifugation wurde das Zellpellet in 200 ml DMEM (Raumtemperatur) aufgenommen.

 

 

Vorperfusion ohne Ca;

Kollagenaseperfusion

 

 
 

 


           

Filtern ; 3 min Zentrifugieren bei 50 x g;

 

Überstand verwerfen

 

Resuspendieren; 3x3 min Zentrifugieren bei 50 x g;

 

 

Überstand verwerfen

 

 Resuspendieren;

 30 min Inkubieren; Erneut Resuspendieren und 3 x 3 min bei 50 x g Zentrifugieren.;

 

Überstand verwerfen

 

REINE HEPATOZYTENKULTUR

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Abbildung 4:           Die einzelnen Schritte der Zellfraktionierung zur Gewinnung einer gereinigten Hepatozytenzellsuspension

 

 

Zwischeninkubation

Eine Inkubation der Zellsuspension  für 30 min im Schüttelwasserbad bei 37°C , wie es in einigen Arbeiten beschrieben worden ist, erleichtert die Zellfraktionierung (Seglen 1976; Berry und Friend 1969; Scheiber und Goldenberg 1996). Die Vorteile hierbei sind, daß sich die intakten Zellen erholen und stabilisieren können, und die nicht viablen Zellen entweder ihr Cytosol in den Extrazellulärraum freisetzen oder ihre begonnenen Strukturschäden weiter fortschreiten.

Durch die so entstehenden Gewichtsdifferenzen zwischen intakten Zellen und Zelltrümmern bzw. subzellulären Bestandteilen lassen sich die im Vergleich zu den intakten Zellen  leichteren Zelltrümmer bzw. subzelluläre Einheiten wie oben beschrieben durch Zentrifugation besser voneinander trennen.

Nach 30 min Inkubation bei 37°C wurde die Zellsuspension in vier 50 ml Röhrchen umgefüllt.

 

 

Zentrifugationszyklus 2

Um die viablen Hepatozyten von den sonstigen Bestandteilen der Zellsuspension zu trennen, wurde ein zweiter Zentrifugationszyklus angeschlossen.

Die vier Röhrchen mit der Zellsuspension wurden bei 500 UPM (50 g) 3 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Hepatozytenwaschpuffer (+4°C) aufgenommen und 3 x 3 min bei 500 UPM (50 g) zenrtifugiert. Nach jeder Zentrifugation wurde der Überstand dekantiert, das Zellpellet in HWP aufgenommen und durch leichtes Schwenken in Schwebe gebracht. Nach der dritten Zentrifugation wurde das Zellpellet in 50 ml Hepatozyteninkubationspuffer (Raumtemperatur) aufgenommen.

 

 

 

2.3.3   Viabilitätbestimmung

 

Zur Bestimmung der Zellviabilität wurde die Trypanblau-Ausschlußmethode verwendet (Seglen 1976; Goldenberg und Scheiber 1996). Das Trypanblau färbt das Zytosol der Zellen mit nicht mehr intakter Zellmembran blau und macht somit  eine Unterscheidung intakter Zellen von nicht mehr intakten Zellen bei Betrachtung durch ein Lichtmikroskop möglich.

 

Aus der gereinigten Zellsuspension wurde ein 20 µl Aliquot entnommen und in ein Eppendorf-Gefäß mit 100 µl Trypanblau 0,25%ig (0.4%ige Orginallösung;  1,6 : 1 mit NaCl  verdünnt) zupipettiert. Nach leichtem Schütteln der Lösung wurden 20 µl auf eine Neubauer-Zählkammer gebracht. Durch Auszählen der 4 x 16 Kammern unter dem Lichtmikroskop konnte die Gesamtzellzahl und der Anteil an viablen bzw. nicht-viablen Zellen bestimmt werden.

Je nach Zellausbeute wurde durch entsprechende Verdünnung der Suspension die Zellzahl auf 3-5 Millionen Hepatozyten/ ml  eingestellt.

 

 

 

2.3.4   Zellzahlbestimmung

 

Die genaue Bestimmung der Zellzahl in jedem der Inkubationsgefäße wurde durch ein elektronisches Zählgerät (Coulter-Counter) durchgeführt. Hierfür wurde nach dem Zupipettieren von jeweils 7,2 ml Zellsuspension pro Gefäß nach leichtem Schwenken der Gefäße wieder jeweils 200 µl Zellsuspension entnommen. In 20 ml Aqua dest. wurden 100 µl der Zellsuspension aufgenommen. Das Behältnis wurde mehrfach geschwenkt, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Unter optischer Kontrolle der Ansaugdüse wurden vom Coulter Counter für jede einzelne Messung 500 µl Zellsuspension angesogen und die Zellzahl bestimmt. Die Zählungen wurden für jedes Inkubationsgefäß vierfach durchgeführt und gemittelt. Bei der Berechnung der Zellzahl für jedes Inkubationsgefäß wurden Verdünnungsfaktoren sowie der Leerwert des Aqua dest. berücksichtigt.

 

 

 

2.4      Durchführung der Inkubation

 

Die frisch isolierten und gereinigten Hepatozyten wurden in einem Gesamtvolumen von 7 ml Hepatozyteninkubationspuffer (HIP) mit 3-5 Millionen Hepatozyten / ml bei 37°C im Schüttelwasserbad 20 min vorinkubiert. Die Inkubation der Hepatozyten mit den Eisenverbindungen und die Probengewinnung erfolgten nach einer Methode von Scheiber und Goldenberg (1996). Abb. 5 gibt einen Überblick über den Versuchsablauf.

Zu Beginn eines Versuches wurde die jeweilige radioaktiv markierte Eisenverbindung zugesetzt (t=0 min). Um die Aufnahme der Eisenverbindungen zu beenden, wurden nach entsprechenden Inkubationszeiten (1 Minute bis zu maximal 2 Stunden) Aliquots von 2 x 500 µl entnommen. Die  Aliquots wurden in vorbereitete Eppendorfgefäße mit 500 µl eiskaltem Hepatozyteninkubationspuffer (HIP) mit einem pH von 7.4 pipettiert. Die Eppendorfgefäße wurden danach für 1 min in einer Tischzentrifuge bei 15000 UPM zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und mit 500 µl Trennöl (80% Dibutylphthalat, 20% Diocytylphthalat; (w/w)) versetzt. Nach leichtem Schütteln des Eppendorfgefäßes wurde anschließend  erneut 1 min zentrifugiert und der Überstand wieder abgesaugt. Die Spitze des Eppendorfgefäßes mit dem darin enthaltenen Pellet wurde mit einem speziellen Schneider abgetrennt und in ein Countergefäß zur Radioaktivitätsbestimmung geeignetes Röhrchen) überführt.

 

 

Modifizierung des pH-Wertes

Es wurden Versuche mit pH-Werten von 5,0 bis zu 8,0 durchgeführt. Hierfür wurden Hepatozyteninkubationspuffer (HIP), wie in Kap. 2.1.2 beschrieben hergestellt. Danach wurde der pH-Wert unter pH-Meter-Kontrolle (Glaselektrode) mit 1 M NaOH bzw. 1 M  HCl auf die gewünschten Werte eingestellt. Bei den entsprechenden Versuchen wurden die Zellen am Ende des Zentrifugationszyklus 2 statt in HIP mit pH 7,4 in HIP mit dem gewünschten pH aufgenommen.

 

 

Modifizierung der Temperatur

Es wurden Versuche mit Temperaturen von 12° bis 36°C durchgefürt. Durch einen eingebauten Thermostat wurde die Wassertemperatur im Schüttelwasserbad konstant gehalten. Durch die Vorinkubation der Zellsuspension wurde gewährleistet, daß die Zellen zu Beginn eines Versuches die gewünschte Temperatur hatten.

 

 

Abbildung 5:           Schemazeichnung zum Versuchsablauf

 

 

Zusatz von Trypsin

Das Trypsin (1 mg/ ml) wurde den Zellen nach der Vorinkubation zugesetzt. Die Dauer der Trypsininkubation betrug 60 min. Die proteolytische Aktivität des Trypsins wurde durch den  Zusatz von Trypsininhibitor aus Sojabohnen (0,1 mg/ ml) beendet. Danach wurde der Versuch mit dem Zusatz der radioaktiv markierten Eisenverbindungen fortgesetzt.

 

 

Andere Zusätze

Bei allen Versuchen mit weiteren Zusätzen wie Metallsalzen, Zellgiften, diversen  Inhibitoren, Chelatoren usw. wurden die Zellen mit den Zusätzen weitere 15 min vorinkubiert. Erst danach wurden die radioaktiv markierten Eisenverbindung hinzugegeben.

 

 

 

2.5      Bestimmung der Radioaktivität

 

[59Fe]-Radioaktivitätsbestimmung

Die Spitze des Eppendorfgefäßes mit den vom Überstand getrennten Zellen wurde mit einem geeigneten Schneidegerät abgetrennt, in ein Reagenzröhrchen aus Plastik überführt, verschlossen und im Auto-Gamma-Szintillationsspektrometer (γ-Counter) gemessen.

 

Zur Radioaktivitätsbestimmung des [59Fe] wurde ein automatisierter γ -Counter (Auto-Gamma 5260, Packard) und der Hamburger 4p-Großraum-Radioaktivitätsdetektor (HAMCO) benutzt.

 

Die Bestimmung des  [59Fe]  in den Proben erfolgte über die Bestimmung der emitierten γ -Strahlung in dem für dieses Nuklid typischen Energiebereich mit den Energiemaxima bei ca. 1099 keV und 1292 keV (zusammen 99% der emitierten Energie).

 

Die Dauer der Messung im HAMCO betrug 10 x 10 sec. und im Auto-Gamma 10 Minuten für Proben mit hoher Radioaktivität und 30 Minuten für Proben mit niedriger Radioaktivität. Die Hintergrundstrahlung (=Leerwert) wurde jeweils mitbestimmt und vom Meßwert subtrahiert. Durch eine Standardlösung mit bekannter Radioaktivität wurde der Wirkungsgrad der Messung bestimmt. Dieser ging als Faktor in die Berechnung der Radioaktivität ein. Dadurch wurde ein direkter Vergleich der einzelnen Proben und die Angabe der Radioaktivität in Bq möglich.

Mit einer Halbwertszeit von t1/2 = 44,5  Tagen ist das [59Fe] ein relativ kurzlebiges Radionuklid mit schnellem Radioaktivitätsabfall, so daß für einige Messungen eine Radioaktivitätsabfallkorrektur notwendig wurde.

 

 

[55Fe]-Radioaktivitätsbestimmung

Nach Absaugen von Überstand und Trennöl wurde die Spitze des Eppendorfgefäßes mit dem darin enthaltenen Zellpellet abgetrennt und in ein großes Countergefäß transferiert. In das Countergefäß wurden 500 µl 0,5 M KOH mit 2% Triton X-100 pipettiert und das verschlossene Gefäß über Nacht auf einen Schüttler gestellt. Die Suspension  wurde am folgenden Tag mit 250 µl 1 N  HCl neutralisiert und mit 7 ml Szintilationsflüssigkeit (Ultima-Gold bzw. Insta-Gel von Packard) versetzt. Das Countergefäß wurde hochtourig  für ca 10 Sekunden `gevortext`, mit einem Antistatiktuch entladen und konnte danach im 4p-Counter von Minaxi (Tri-Carb, 4000 Series) gemessen werden.

Die Messung der Proben wurde automatisiert und jeweils in zwei Durchgängen mit je 10 x 10 sec. Meßdauer durchgeführt. Daraus wurde ein Mittelwert bestimmt, der als cpm (Counts per minute) angegeben wurde. Die Bestimmung des Leerwertes erfolgte regelmäßig. Als Standard wurde für jede Versuchsreihe eine Probe hergestellt, deren [55Fe]-Konzentration bekannt war. Der Wirkungsgrad der Messung (Efficiency) wurde über den Spektralindex der Probe (SIS) und den Spektralindex eines externen Standards (SIE), die nach entsprechender Einstellung mitgemessen wurden, überwacht.

 

Die Halbwertszeit des [55Fe] Nuklids beträgt 2,73 Jahre. Die Experimente mit [55Fe] wurden innerhalb von wenigen Wochen durchgeführt. Durch den relativ kurzen Zeitraum war eine Radioaktivitätsabfallkorrektur der Ergebnisse nicht notwendig.

 

 

 

2.6             Software und Statistik

 

Die Tabellen und Grafiken sind unter `Excel` und  `Slide-Write-Plus` angefertigt worden. Mittelwerte, Standardabweichungen und Signifikanzprüfungen wurden mit den in die Programme `Slide-Write-Plus` und `Excel` integrierten Funktionen berechnet. Das Testniveau wurde vor den Signifikanzprüfungen auf a=0,01 festgelegt.

Die Regressionskurven wurden mit Hilfe des Programmes Slide Write Plus erzeugt.

 

 

 

2.7      Material

 

Geräte und Zubehör mit Herstellerangabe

 

*  Feinwaage, Typ 1602 MP              : Sartorius GMBH, D-Göttingen

*  pH-Meter, Typ CG 822                   : Schott Geräte, D-Mainz

*  Perfusor, Typ MC 360                     : Ismatec SA, CH-Glattbrugg-Zürich

*  Mikroskop, Labovert FS                 : Leitz, Deutschland

*  Zentrifugen                                       : Microliter 2020 von Hettich Zentrifugen,

D-Tuttlingen und Labofuge 400 R von Haraeus Instruments, D-Hanau

*  b-Counter, Minaxi Tri-Carb 4000  : Packard Instruments, D-Frankfurt

*  g-Counter, Modumatic VI 5260      : Packard Instruments, D-Frankfurt

*  HAMCO                                            : Los Alamos National Laboratories und

*                                                             Packard Instruments, D-Frankfurt

*  Inkubationsgefäße                           : 50 ml und 750 ml Flaschen von Falcon,

                                                                       Becton Dickinson Labware, USA-New Jersey;

                                                                       Petrischalen von Greiner, D-Frickenhausen

*  Zentrifugationsröhrchen                  : 50 ml, Greiner, D-Frickenhausen

*  Warmwasserbad, Typ 1083           : GFL, D-Burgwedel

 

 

Chemikalien mit Herstellerangabe

 

*  Braun, D-Melsungen                       : Glucose 40%ig

*  Dupont, , B­-Mechelen                     : [55Fe]Cl3

*  Amersham, England                       : [59Fe]Cl3

*  Gibco, D-Eggenstein                      : Trypanblau, Hepes Lösung, PBS Dulbeco`s,

                                                                 DMEM

*  Serva, D-Heidelberg                       : EGTA, Kollagenase, Phtalic Acid

                                                                 Dibutylester

*  E. Merck, D-Darmstadt                   : Trypsin, Na-Azid, Kaliumhexacyanoferrat,

                                                                 ZnSO4, MnSO4, CoNO3,  EDTA, Ferrozen

*  Sigma, D-Deisenhofen                   : Trypsininhibitor aus Sojabohnen, Apo- und

                                                                 Holo-Transferrin

*  Fluka, CH-Buchs                             : DMSO, Tiron, CuSO4

*  Aldrich, D-Steinheim                       : Diocytylphthalat, 3,5,5,- Trimethylhexanal

*  Ciba-Geigy, D-Wehr                       : Desferal

*  Sanofi-Ceva, D-Hannover              : Nembutal

*  Packard Instruments, D-Frankfurt  : Insta-Gel, Ultima-Gold