Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor

3             Ergebnisse

3.1       Optimierung des Klonierungssystems

 

Um eine möglichst hohe Ausbeute von Klonen mit dem Plasmidvektor pBluescript®II SK (im Weiteren nur noch als pSK bezeichnet) zu erhalten, wurde versucht das Klonierungssystem zu optimieren. Es wurden die Escherichia coli-Stämme DH5a und MC1061 auf ihr Transformationsverhalten mit dem pSK-Vektor untersucht. Mit der in der Arbeitsgruppe etablierten CaCl2-Methode zeigte der E. coli-Stamm MC1061 eine deutlich höhere Transformationseffizienz als der Stamm DH5a. Abhängig von der Wachstumsphase, in der die Zellen geerntet wurden, und der Dauer der Hitzeeinwirkung auf die kompetenten Zellen konnte eine maximale Transformationseffizienz von 0,5 bis 1 x 107 CFU/ng Vektor-DNA erreicht werden. Der optimale Zeitpunkt für die Ernte der Zellen lag bei einer OD578 von 0,3 bis 0,4. Bei einer Inkubation für 75 Sekunden in Glasreagenzröhrchen in einem 42 °C Wasserbad konnte, bei vorherigem strengen Arbeiten auf Eis, diese Transformationseffizienz erreicht werden.

 

Eine längerfristige Lagerung der kompetenten Zellen in der CaCl2-Lösung bei –80 °C ließ die Transformationseffizienz auf die Hälfte des Aussgangswertes oder auf noch geringere Werte sinken, so daß für sämtliche Transformationen die kompetenten Zellen frisch bereitet wurden.

 

Für die Klonierung wurde der Vektor mit einem bzw. zwei Restriktionsenzymen gespalten. Die Vektorpräparationen, welche nur durch ein Enzym gespalten wurden, mußten zusätzlich noch mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert werden, um eine Selbstligation des Vektors zu verhindern. Jede Vektorpräparation, sowie ein entsprechender Selbstligationsansatz wurde vor der Verwendung in E. coli transformiert, um den Rest an nicht gespaltenem bzw. nicht dephosphoryliertem Vektor zu bestimmen. Es wurden nur die Vektorpräparationen für die Ligationsreaktionen verwendet, welche eine minimale Anzahl von Klonen in diesen Versuchen aufwiesen.

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende

 

3.2       Klonierungsstrategien

 

Es wurden zunächst Klonierungsstrategien entwickelt, um geeignete Fragmente chromosomaler DNA der Mutanten in dem pSK-Vektorsystem zu klonieren. Diese Strategien wurden anhand der von Holger Rhode erstellten Kartierung der Transposoninsertionsstellen der Mutanten (unveröffentlichte Daten) und der Genkarte von Transposon Tn917 geplant (Shaw und Clewell, 1985).

 

Der pSK-Vektor trägt die genetische Information für eine Ampicillinresistenz (Short et al., 1988; Alting-Mees und Short, 1989), mit der auf die erfolgte Transformation der E. coli-Stämme untersucht werden konnte. Der E. coli-Empfängerstamm MC1061 ist im Gegensatz zu anderen Laborstämmen in der Lage die Erythromycinresistenz des Transposons Tn917 zu exprimieren (Gutierrez et al., 1996). Um eine einfache Selektion der erhaltenen Klone zu ermöglichen, mußten die chromosomalen DNA-Fragmente das gesamte Transposon Tn917 oder zumindest dessen für die Erythromycinresistenz kodierenden Anteil beinhalten. Gleichzeitig sollte das zu klonierende, chromosomale DNA-Fragment möglichst groß gewählt werden, um eventuelle Sequenzhomologien mit hoher Wahrscheinlichkeit zu finden. Da das Transposon Tn917 eine Größe von 5,2 kb besitzt und in dem Plasmidvektor pSK die Größe der klonierbaren Fragmente auf etwa 10 kb begrenzt ist, war die Auswahl der Restriktionsspaltungen für den Erfolg der Klonierungsversuche entscheidend. Grundvorraussetzung für die Auswahl der verwendeten Restriktionsenzyme war das Vorhandensein einer identischen bzw. korrespondierenden Spaltstelle innerhalb der „multiple cloning site“ des Plasmidvektors.

 

Bei der Klasse II-Mutante M12 ist die Tn917-Insertion auf einem 0,4 kb großen chromosomalen EcoRI-Fragment lokalisiert. Zusammen mit dem darin enthaltenen Transposon Tn917 ergab sich ein zu klonierendes Fragment von 5,6 kb. Die chromosomale DNA von M12 wurde mit EcoRI gespalten und über Nacht in einem Agarosegel aufgetrennt. Es wurden der Größenbereich von 5,7 bis 6,3 kb aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA mittels Geneclean® II aufgereinigt. Nach Bestimmung der erhaltenen DNA-Menge wurden drei Ligationsansätze mit den Vektor/DNA-Verhältnissen 1:4, 1:1 und 4:1 über Nacht ligiert. Die Hälfte der Ligationsansätze wurden in kompetente E. coli MC1061 transformiert und auf LB-Agar mit 150 µg/ml Ampicillin kultiviert. Die erhaltenen Klone wurden auf LB-Agar mit 300 µg/ml Erythromycin überimpft und weiter kultiviert. Es wurden drei Klone gefunden, die sich auf LB-Agar mit Erythromycin subkultivieren ließen. Die Klone wurden mit JK74.3, JK74.9 und JK74.24 bezeichnet. Die entsprechenden Plasmide wurden mit pSKJK und der dem Klon entsprechenden Numerierung bezeichnet (z.B. pSKJK74.9).

 

Die Transposoninsertionsstellen der Mutanten M15 und M19 lagen nach der vorgegebenen Kartierung auf identischen, chromosomalen EcoRI-, HindIII- und XbaI-Fragmenten. Für die Klonierung wurde ein für beide Mutanten identisches, 0,6 kb großes, chromosomales HindIII-Fragment gewählt, das das 5´-Ende des Transposons flankiert. Das Transposon Tn917 besitzt ebenfalls eine HindIII-Spaltstelle, durch welche am 5´-Ende ein 2,9 kb großes Fragment abgespalten wird. Dadurch ergab sich eine Gesamtgröße von 3,5 kb des zu klonierenden Fragments. Gleichzeitig wurde versucht, ein Fragment nach Doppelspaltung mit den Restriktionsenzymen HindIII und SalI zu klonieren. Durch eine doppelte Spaltung konnte aufgrund der asymmetrischen Ligation in dem Vektor auf die Dephosphorylierung des Vektors vor der Ligationsreaktion verzichtet werden. Gleichzeitig wurde das zu klonierende DNA-Fragment um 0,4 kb verkleinert. Die chromosomale DNA wurde nach Spaltung im Größenbereich der errechneten Fragmente aufgereinigt und in pSK ligiert. Es wurden für die Mutante M15 in der symmetrischen HindIII- und der asymmetrischen HindIII/SalI-Ligation mehrere Klone gefunden, welche auf LB-Agar mit Erythromycin subkultivierbar waren. Für die Mutante M19 wurden nur in der HindIII/SalI-Ligation mehrere unter Erythromycinselektion subkultivierbare Klone gefunden. Es wurden von jedem Ligationsansatz drei erythromycinresistente Klone weiter untersucht. Die weiter verwendeten Klone für die Mutante M15 wurden für die symmetrische Klonierung mit HindIII mit JK186.34, JK186.35 und JK186.36, sowie für die asymmetrische Klonierung mit HindIII und SalI mit JK186.41, JK186.42 und JK186.44 bezeichnet. Die für Mutante M19 untersuchten Klone wurden mit JK186.46, JK186.47 und JK186.48 bezeichnet.

 

Bei der Klasse IV-Mutante M17 ist die Tn917-Insertion in einem 4,2 kb großen, chromosomalen EcoRI-Fragment lokalisiert. Zusammen mit dem darin enthaltenen Transposon Tn917 ergab sich ein zu klonierendes Fragment von 9,4 kb. Nach vielfachen Versuchen mit insgesamt vier verschiedenen aufgereinigten DNA-Aliquots, die zu keinen erythromycinresistenten Klonen führten, wurde ein zweite Klonierungsstrategie angewendet. Um das Gesamtfragment zu verkleinern, wurde die chromosomale DNA zusätzlich mit dem im Transposon Tn917 spaltenden, Restriktionsenzym SalI behandelt. Dieses Enzym besitzt nach der vorgegebenen Kartierung keine Spaltstelle innerhalb des chromosomalen EcoRI-Fragments. Trotz des nun kleineren Fragments und der asymmetrischen Ligation konnte auch mit dieser Strategie nach mehrfachen Versuchen kein erythromycinresistenter Klon gefunden werden.

 

Für die Mutante M16 wurde ein 0,6 kb großes, das 5´-Ende des Transposons flankierendes, chromosomales HindIII-Fragment gewählt. Dieses wurde ebenso wie für die Mutanten M15 und M19 nur nach HindIII-Spaltung und nach Spaltung mit den Enzymen HindIII und SalI in pSK ligiert. Nur die asymmetrische Ligation brachte mehrere unter Erythromycinselektion kultivierbare Klone hervor. Es wurden drei Klone weiter untersucht, die mit JK186.19, JK186.20 und JK186.22 bezeichnet wurden.

 

Bei der Mutante M20 ist die Tn917-Insertion in einem 1,2 kb großen, chromosomalen EcoRI-Fragment lokalisiert. Die Gesamtgröße des zu klonierenden Fragments betrug zusammen mit dem Transposon Tn917 6,4 kb. Es zeigten sich nach der Transformation in E. coli MC1061 drei unter Erythromycinselektion subkultivierbare Klone, die mit JK30.28, JK30.29 und JK30.30 bezeichnet wurden.

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende

 

3.3       Nachweis der Identität der Klone

3.3.1     Kartierung der klonierten Plasmide

 

Es war gelungen von den Mutanten M12, M15, M19, M16 und M20 chromosomale DNA-Fragmente in E. coli zu klonieren, wobei die Klone phänotypisch eine Erythromycinresistenz aufwiesen. Nun mußte kontrolliert werden, ob die klonierten Fragmente tatsächlich das Transposon Tn917 bzw. Teile davon enthielten. Bei Klonen, welche das gesamte Transposon enthielten, sollte die relative Lage des Transposons innerhalb des klonierten Fragments sowie die relative Lage des Fragments innerhalb des Vektors bestimmt werden.

 

Das Transposon Tn917 enthält insgesamt vier AvaI-Restriktionsspaltstellen, so daß sich nach Spaltung mit diesem Enzym ein charakteristisches Bandenmuster in der Agarosegelelektrophorese finden läßt. Durch die Spaltung entsteht am 5´-Ende des Transposons ein Fragment von 1720 Basen mit der genetischen Information für die Erythromycinresistenz. Das mittlere Fragment umfaßt 1254 Basen und am 3´-Ende des Transposons entsteht ein 2270 Basen großes Fragment. Gleichzeitig besitzt die „multiple cloning site“ des Vektors zwei AvaI-Spaltstellen, welche alle zur Klonierung verwendeten Restriktionsspaltstellen umschließen (Bild 4). Da nach der zugrundegelegten Kartierung keine AvaI-Spaltstellen innerhalb der klonierten Fragmente vorhanden waren, eignete sich eine AvaI-Spaltung der Klone als Nachweis für das Vorhandensein des Transposons Tn917 in den klonierten chromosomalen DNA-Fragmenten.

 

 

Bild 4

 

Bild 4 Kartierung der „multiple cloning site“ des Vektors pBluescript® II SK in Orientierung des Plusstrangs nach Spaltung mit XbaI.

 

 

Für die Mutante M12 zeigten die Plasmide der drei erhaltenen Klone die gleichen Restriktionsspaltmuster, so daß im Folgenden nur noch das Plasmid pSKJK74.9 weiter untersucht wurde. In der EcoRI-Spaltung zeigte sich neben dem Vektor ein Fragment in der Größe von 5,8 kb (Bild 5, Spur 1). In der AvaI-Spaltung des Plasmids zeigten sich die drei  Tn917-Fragmente (1,25, 1,72 und 2,27 kb) sowie neben dem Vektor (2,96 kb) zwei kleine Fragmente, die erst nach Auftrennung in einem 1 %igem Agarosegel bei niedriger Spannung vermessen werden konnten (Bild 5, Spur 2 und 6). Die Größe der beiden Fragmente wurde rechnerisch mit 0,35 und 0,24 kb bestimmt. In der Spaltung mit SalI zeigte sich ein 3,2 kb großes Fragment und eine Doppelbande zweier 2,8 kb großer Fragmente (Bild 5, Spur 3). Die gleichzeitige Spaltung des Plasmids mit SalI und EcoRI verkleinerte das größere Fragment auf die Größe des Plasmidvektors. Das abgespaltene Fragment ist auf dem Gel nicht zu erkennen (Bild 5, Spur 4). Daraus ergibt sich, daß nach der Spaltung mit SalI ein ca. 0,2 kb großes Fragment den Vektor flankiert. Nachdem sowohl der Vektor als auch das Transposon Tn917 je nur eine Spaltstelle für dieses Enzym besitzen, mußte eine weitere Spaltstelle in dem klonierten chromosomalen DNA-Fragment vorhanden sein. Diese konnte in der Folge durch Sequenzierung nachgewiesen werden. Die SalI-Spaltstelle des Transposons Tn917 ist in dessen 1,3 kb großem AvaI-Fragment lokalisiert und spaltet dieses in zwei 0,78 und 0,47 kb große Fragmente. Das kleinere der beiden Fragment ist auf dem Gel nicht zu erkennen (Bild 5, Spur 5). Bei der SalI-Spaltung des ganzen Transposons entsteht am 5´-Ende ein 2,5 kb großes und am 3´-Ende ein 2,74 kb großes Fragment. Diesen Ergebnissen zu Folge muß das kleinere der beiden chromosomalen Fragmente, das die SalI-Spaltstelle enthält, das 3´-Ende des Transposons flankieren. Nur unter den vorgenannten Voraussetzungen die gefundene Doppelbande entstehen kann. Nach der Verteilung der EcoRI- und SalI-Spaltstellen in der „multiple cloning site“ des Vektors ergibt sich für das Transposon eine Orientierung entgegen des Plusstrangs des Vektors (Bild 4, Bild 6).


 

Bild 5

Bild 5 Restriktionsspaltungen des Plasmids pSKJK74.9 (M12). 1 EcoRI; 2 AvaI; 3 SalI; 4 EcoRI/SalI; 5 AvaI/SalI; 6 AvaI (in 1 %igem Agarosegel)

 

 

Bild 6

 

Bild 6 Kartierung der klonierten Fragmente der Mutanten. Die Orientierung des Transposons entspricht dem Plusstrang des pBluescript®II SK-Vektors. Eingezeichnet sind die für die Sequenzierung und die PCR eingesetzten Oligonukleotide (–20: M13‑20; rev: M13reverse).

 

 

Alle untersuchten, asymmetrisch in den Vektor ligierten Fragmente der Mutanten M15 und M19 verhielten sich nach Restriktionsspaltung identisch, ebenso wie die drei für M15 gewonnenen symmetrisch ligierten Plasmide. Für alle folgenden Untersuchungen wurden die Plasmide pSKJK186.41 (M15 HindIII/SalI) und pSKJK186.46 (M19 HindIII/SalI) verwendet, da durch die asymmetrische Klonierung die relative Lage des Transposons in dem Vektor bekannt war. Die Spaltung mit HindIII und SalI zeigte für beide Plasmide in der Gelelektrophorese neben dem Vektorfragment (2,96 kb) ein Fragment in der Größe von 3,7 kb (Bild 7, Spur 2 und 5). In der zusätzlichen Spaltung mit AvaI zeigte sich neben dem Vektor (2,96 kb) jeweils eine Bande in der Größe des AvaI-Fragments am 5´-Ende des Transposons (1,72 kb), sowie eine Bande in der Größe des durch SalI-Spaltung verkleinerten, mittleren AvaI-Fragments des Transposons (0,78 kb). Die zweite kleinere Bande war breiter als erwartet (Bild 7, Spur 3 und 6). Sie wurde als Doppelbande zweier fast identisch großer Restriktionsfragmente gedeutet. Damit ergibt sich eine Fragmentgröße der klonierten chromosomalen DNA von ca. 0,8 kb. Den zur Ligation verwendeten Restriktionsspaltstellen zu Folge liegt der Transposonanteil in Richtung des Plusstrangs des Vektors orientiert (Bild 6).

 

 

Bild 7

 

Bild 7 Restriktionsspaltungen der Plasmide pSKJK186.41 (M15), pSKJK186.36 (M19) und pSKJK186.19 (M16). 1 M15 ungespalten; 2 M15 HindIII/SalI; 3 M15 AvaI; 4 M19 ungespalten; 5 M19 HindIII/SalI; 6 M19 AvaI; 7 M16 ungespalten; 8 M16 HindIII/SalI; 9 M16 AvaI

 

 

Alle klonierten Plasmide der Mutante M16 zeigten identische Restriktionsmuster, so daß in der Folge nur das Plasmid pSKJK186.19 weiter untersucht wurde. Dieses zeigte in der Spaltung mit HindIII und SalI das Vektorfragment (2,96 kb) und ein weiteres Fragment in der Größe von 3,8 kb (Bild 7, Spur 8). In der AvaI-Spaltung zeigte sich neben dem Vektor und den beiden transposonspezifischen Banden (1,72 und 0,78 kb) eine nur geringfügig größere Bande, die sich von dem Tn917-Fragment kaum abgrenzen läßt (Bild 7, Spur 9). Für die klonierte chromosomale DNA ergibt sich somit eine Größe von 0,9 kb. Wie für die Plasmide pSKJK186.41 und pSKJK186.46 liegt der Transposonanteil in Richtung des Plusstrangs des Vektors orientiert (Bild 6).

 

Alle Klone der Mutante M20 ergaben identische Restriktionsfragmentmuster. In allen weiteren Untersuchungen wurde das Plasmid pSKJK30.30 verwendet. In der Spaltung mit EcoRI zeigte sich neben dem Vektorfragment (2,96 kb) ein 6,6 kb großes Fragment (Bild 8, Spur 2). In der Spaltung mit SalI zeigten sich zwei 3,9 und 5,4 kb große Fragmente (Bild 8, Spur 6). Die Spaltung mit EcoRI und SalI wies neben dem Vektorfragment (2,96 kb) ein 3,9 sowie ein 2,7 kb großes Fragment auf (Bild 8, Spur 5). In den Spaltungen mit AvaI zeigten sich, neben den Transposonfragmenten (1,25, 1,72 und 2,27 kb) drei statt der zwei postulierten Fragmente (Bild 8, Spur 4). Durch zusätzliche Spaltung mit dem Enzym SalI konnte das kleinste Tn917-AvaI-Fragment identifiziert werden (Bild 8, Spur 7). Es blieben die drei Fragmente der Größen 0,3, 1,3 und 1,5 kb als fraglich chromosomale DNA übrig. Durch die gleichzeitige Spaltung mit EcoRI und AvaI verkleinerte sich das gefundene 1,3 kb große Fragment reproduzierbar um ca. 30 Basen (Bild 8, Spur 3). Dies entspricht dem Abstand der EcoRI-Spaltstelle von der in Richtung des Plusstrangs gelegenen distalen AvaI-Spaltstelle (Bild 4). Die Summe der Fragmentgrößen der AvaI-Spaltung war mit 11,3 kb im Vergleich zu den Summen aller anderen Restriktionsenzymspaltungen um ca. 1,5 kb größer. Eine mögliche Ursache für das Erscheinen eines zusätzlichen Fragments in der Spaltung mit AvaI könnte die inkomplette Spaltung einer Spaltstelle für dieses Enzym innerhalb des klonierten chromosomalen DNA-Abschnitts sein.

 

 

Bild 8

 

Bild 8 Restriktionsspaltungen der Plasmids pSKJK30.30 (M20). 1 pSK-Vektor EcoRI-gespalten; 2 EcoRI; 3 EcoRI/AvaI; 4 AvaI; 5 EcoRI/SalI; 6 SalI; 7 AvaI/SalI

 

 

Das Enzym SalI spaltet das Transposon Tn917 in zwei Fragmente mit den Größen 2,5 kb am 5´-Ende und 2,74 kb am 3´-Ende. In der EcoRI/SalI-Spaltung fanden sich neben dem Vektor (2,96 kb) ein 2,7 und ein 3,9 kb großes Fragment. Demnach muß das in der AvaI-Spaltung entstandene 0,3 kb große Fragment chromosomalen Ursprungs sein und das 5´-Ende des Transposons flankieren. Das 3´-Ende des Transposons würde somit von einem 1,3 kb großen Fragment chromosomaler DNA flankiert (Bild 6). Das 5,4 kb große Fragment der SalI-Spaltung wird durch die zusätzliche Spaltung mit EcoRI in den Vektor (2,96 kb) und ein das 5´-Ende des Transposons enthaltendes Fragment gespalten. Die SalI-Spaltstelle in der „multiple cloning site“ des Vektor befindet sich in Leserichtung des Plusstrangs distal der EcoRI-Spaltstelle (Bild 4). Daraus ergibt sich, daß das Transposon innerhalb des Vektors in Richtung von dessen Plusstrang orientiert ist (Bild 6).

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende




3.3.2     Hybridisierungsuntersuchungen mit den klonierten Sonden

 

Als Bestätigung für die Identität der klonierten Fragmente wurde nun eine Hybridisierung chromosomaler DNA von S. epidermidis Wildtypstamm 1457 und seiner Mutanten mit den klonierten Fragmenten als Sonden durchgeführt. Die klonierten Fragmente wurden hierzu mit den für die Klonierung verwendeten Restriktionsenzymen aus dem Vektor gespalten, aufgereinigt und radioaktiv markiert. Es wurde jeweils das Hybridisierungsmuster von Restriktionsenzymspaltungen chromosomaler DNA des Wildtypstamms mit dem der entsprechenden Mutante verglichen. Als Kontrolle diente die Hybridisierung chromosomaler DNA mindestens einer weiteren Mutante. Mit diesem Verfahren kann die Identität des klonierten Fragments mit der Transposoninsertionsstelle der entsprechenden Mutante eindeutig nachgewiesen werden. Die Verschiebung eines chromosomalen Fragments des Wildtyps um die Größe des Transposons in der EcoRI-Spaltung bei der Mutante beweist eine Insertion in dem klonierten Fragment. Gleichzeitig beweist die Hybridisierung der das Transposon Tn917 enthaltenden Fragmente anderer Mutanten die Insertion von Tn917 innerhalb des klonierten Fragments. 

 

Für die Hybridisierung mit der Sonde der Mutante M12 wurde neben dem Wildtypstamm S. epidermidis 1457 die Mutante M20 als weitere Kontrolle verwendet. In der Spaltung der chromosomalen DNA mit XbaI wurden beim Wildtyp S. epidermidis 1457 und M20 ein 5,5 kb großes chromosomales DNA-Fragment markiert. Bei der Mutante M12 war dieses nicht sichtbar (Bild 9, Spur 4, 5 und 6; Tabelle 1). Die das Transposon Tn917 enthaltenden, markierten Fragmente sind in Tabelle 1 aufgelistet. Das hybridisierende chromosomale Wildtypfragment, sowie die das Transposon enthaltenden Fragmente waren rechnerisch etwas kleiner als die nach der vorliegenden Kartierung postulierten Fragmentgrößen. Die Größenverhältnisse der einzelnen Fragmente untereinander blieben jedoch gleich. Die vorgegebene Kartierung der Transposoninsertionstellen wurde mit transposonspezifischen Sonden durchgeführt. Durch die Eigengröße des Transposons von 5,2 kb waren die im Rahmen der Kartierung vermessenen Fragmente zum Teil relativ groß. In diesen Größenbereichen ist die Bestimmung der Fragmentgröße durch Gelelektrophorese weitaus schwieriger. Minimale Unterschiede in der Laufstrecke entsprechen relativ großen Unterschieden im Molekulargewicht der DNA. Die gefundenen Unterschiede lassen sich auf Meßungenauigkeiten im Vergleich zwischen der Kartierung und den hier durchgeführten Untersuchungen zurückführen. Durch die Hybridisierung mit den klonierten, spezifischen Sonden konnte die Größe der entsprechenden Fragmente nun genauer bestimmt werden. In der HindIII-Spaltung zeigten sich neben den durch das Transposon markierten Fragmenten (Tabelle 1) für den Wildtyp und die Mutante M20 ein 1,6 kb großes Fragment, welches bei der Mutante M12 fehlte (Bild 9, Spur 7, 8 und 9). In der EcoRI-Spaltung war für den Wildtypstamm und die Kontrollmutante das dem klonierten Fragment entsprechende 0,4 kb große Fragment aufgrund der geringen Größe nicht zu erkennen. Es zeigten sich jedoch für die Mutanten M12 und M20 die Banden chromosomaler DNA, die das Transposon Tn917 enthielten (Bild 9, Spur 1, 2 und 3; Tabelle 1). Dabei entspricht das markierte chromosomale DNA-Fragment der Mutante M12 mit einer Größe von 5,9 kb dem klonierten Fragment. Dem erhaltenen Hybridisierungsmuster zu Folge kann für das in dem Plasmid pSKJK74.9 enthaltene DNA-Fragment die Identität mit der Transposoninsertionsstelle und der das Transposon Tn917 flankierenden chromosomalen DNA der Mutante M12 angenommen werden.


 

 

Bild 9

 

Bild 9 Nachweis der Identität des klonierten Fragments der Mutante M12. Die Hybridisierung im Southernblot mit dem radioaktiv markierten Fragment. 1-3 S. epidermidis 1457, M12, M20 EcoRI; 4-6 S. epidermidis 1457, M12, M20 XbaI; 7-9 1457, M12, M20 HindIII

 


 

Tabelle 1
Fragmentgrößen der nach der gegebenen Kartierung erwarteten und der in der
Hybridisierung mit Sonde M12 erhalten Fragmente

 

Stamm

EcoRI

Kartierung

EcoRI

Hybr.

XbaI

Kartierung

XbaI

Hybr.

HindIII

Kartierung

HindIII

Hybr.

1457 wt

 

0,4

---

  7,0

5,5

  1,7

  1,6

1457 M12

 

 

 

6,0

5,9

  1,2

11,4

1,1

9,3

  1,3

  2,3

  3,7

  1,4

  2,1

  3,5

1457 M20

0,4

6,8

---

6,6

  5,7

  7,0

25,1

5,3

5,5

20,2

  1,3

  1,6

  1,8

13,8

  1,4

  1,6

  1,7

12,0

     Größe in kb; Die markierten Fragmente, die Anteile von Tn917 enthalten, sind hervorgehoben.

    

    

Für die Untersuchungen mit der Sonde der Mutanten M15 wurde die chromosomale DNA der Mutanten M15 und M19 zusammen mit der DNA des Wildtypstamms S. epidermidis 1457 und der DNA der Mutante M16 hybridisiert. Für diese Mutante wurde nur ein Teil des Transposons kloniert. Deshalb hybridisierten in den Restriktionsspaltungen mit Enzymen, die das Transposon spalten nur die das 5´-Ende des Transposons enthaltenden Fragmente. In der XbaI-Spaltung zeigte sich für den Wildtyp S. epidermidis 1457 und die Kontrollmutante M16 ein 14,4 kb großes chromosomales DNA-Fragment, sowie das den Transposonanteil beinhaltende Fragment der Mutante M16 (Bild 10, Spur 5 und 8; Tabelle 2). Die Mutanten M15 und M19 zeigten nur ein 8,7 kb großes Fragment. In der HindIII-Spaltung zeigte sich ein 1,1 kb großes Fragment nur für den Wildtyp und die Mutante M16 neben dem Tn917-Fragment der Mutante M16 (Bild 10, Spur 9 und 12; Tabelle 2). Für die Mutanten M15 und M19 wurde nur ein 3,5 kb großes Fragment markiert. (Bild 10, Spur 10 und 11; Tabelle 2)

 

 

Bild 10

 

Bild 10 Nachweis der Identität des klonierten Fragments der Mutante M15. Die Hybridisierung im Southernblot mit dem radioaktiv markiertem Fragment. Die Pfeile markieren die schwer erkennbaren Banden. 1-4 1457, M15, M19, M16 EcoRI; 5-8 1457, M15, M19, M16 XbaI; 9-12 1457, M15, M19, M16 HindIII

 


 

Tabelle 2
Fragmentgrößen der nach der gegebenen Kartierung erwarteten und der in der
Hybridisierung mit Sonde M15 erhaltenen Fragmente

 

Stamm

EcoRI

Kartierung

EcoRI

Hybr.

XbaI

Kartierung

XbaI

Hybr.

HindIII

Kartierung

HindIII

Hybr.

1457 wt

 

  8,9

  5,9

13,6

14,4

1,8

1,1

1457 M15

 

 

14,5

  5,9

14,1

10,5

  8,7

3,6

3,5

1457 M19

 

 

14,5

  5,9

14,1

11,0

  8,7

3,6

3,5

1457 M 16

  8,9

20,0

  5,9

20,4

  4,5

13,6

  4,9

14,4

1,8

4,5

1,1

3,5

         Größe in kb; Die markierten Fragmente, die Anteile von Tn917 enthalten, sind hervorgehoben.

 

 

 

In der EcoRI-Spaltung zeigte sich in der chromosomalen DNA des Wildtyps und der Mutante M16 ein 5,9 kb großes Fragment, sowie das den Transposonanteil enthaltende Fragment der Mutante M16 (Bild 10, Spur 1 und 4; Tabelle 2). Die Mutanten M15 und M19 wiesen ein ähnlich großes Fragment mit nahezu identischer Laufeigenschaft auf (Bild 10, Spur 2, 3, Tabelle 2). Durch nachträglich durchgeführte Restriktionsspaltung konnte gezeigt werden, daß die klonierte chromosomale DNA eine EcoRI-Spaltstelle enthielt (ohne Bild). Diese konnte auch später in der Nukleotidsequenz nachvollzogen werden (siehe Kapitel 3.5.2, Bild 22). Es wurde angenommen, daß hierdurch ein zweites, chromosomales EcoRI-Fragment des Wildtyps und der Mutanten markiert wurde. Dieses hat eine nahezu identische Größe zu dem die Transposoninsertionsstelle beinhaltenden Wildtypfragment. Für alle Mutanten wurden zusätzlich die erwarteten Tn917 enthaltenden chromosomalen DNA-Fragmente nachgewiesen (Tabelle 2). Die Hybridisierung mit der Sonde der Mutante M19 zeigte ein identisches Fragmentmuster (ohne Bild). Mit diesen Ergebnissen wurde für die Plasmide pSKJK186.41 (M15) und pSKJK186.46 (M19) ebenfalls die Identität mit der Transposoninsertionsstelle und der das Transposon Tn917 flankierenden chromosomalen DNA der Mutanten gezeigt. Die nach der vorliegenden Kartierung erwarteten geringfügigen Unterschiede in der XbaI-Spaltung konnten nicht nachvollzogen werden (Tabelle 2). Dies deutet darauf hin, daß die Transposoninsertionen der beiden Mutanten sehr nahe benachbart sind.

 

Für die Untersuchung mit der aus Mutante M16 gewonnenen Sonde wurden neben dem Wildtyp die Mutanten M15 und M19 als Kontrolle verwendet. Auch für diese Mutante wurde nur ein Teil des Transposons Tn917 kloniert, so daß ebenfalls nur die das 5´-Ende des Transposons enthaltenden Fragmente chromosomaler DNA markiert wurden. In der EcoRI-Spaltung zeigte sich für den Wildtyp und die Mutanten M15 und M19 ein 8,7 kb großes chromosomales DNA-Fragment (Bild 11, Spur 1, 2, 3). In der Hybridisierung von Mutante M16 wurde dieses nicht markiert. Es konnten für alle Mutanten ein das Transposon Tn917 enthaltendes chromosomales DNA-Fragment markiert werden (Bild 11, Spur 2, 3, 4; Tabelle 3). Die XbaI-Spaltung zeigte ebenfalls für alle Mutanten je ein Tn917-Fragment (Bild 11, Spur 5, 6, 7; Tabelle 3). Für den Wildtyp und die Mutanten M15 und M19 wurde ein 3,0 kb großes Fragment chromosomaler DNA nachgewiesen, das bei der Mutante M16 nicht hybridisierte. In der HindIII-Spaltung wurde beim Wildtyp und den Mutanten M15 und M19 jeweils ein 2,3 kb großes chromosomales DNA-Fragment markiert, das bei der Mutante M16 nicht hybridisierte (Bild 11, Spur 9, 10 und 11). Für alle untersuchten Mutanten konnte ein das 5´-Ende von Tn917 enthaltendes Fragment markiert werden (Bild 11, Spur 10, 11 und 12 Tabelle 3). Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß die Identität des klonierten DNA-Fragments der Mutante M16 mit der Transposoninsertionsstelle und der das Transposon Tn917 flankierenden chromosomalen DNA gegeben ist.

 

 

Bild 11

 

Bild 11 Nachweis der Identität des klonierten Fragments der Mutante M16. Die Hybridisierung im Southernblot mit dem radioaktiv markiertem Fragment. 1-4 1457, M15, M19, M16 EcoRI; 5-8 1457, M15, M19, M16 XbaI; 9-12 1457, M15, M19, M16 HindIII


 

Tabelle 3
Fragmentgrößen der nach der gegebenen Kartierung erwarteten und der in der
Hybridisierung mit Sonde M16 erhaltenen Fragmente

 

Stamm

EcoRI

Kartierung

EcoRI

Hybr.

XbaI

Kartierung

XbaI

Hybr.

HindIII

Kartierung

HindIII

Hybr.

1457 wt

 

14,4

  8,7

  3,1

3,0

1,8

2,3

1457 M 15

 

 

14,4

14,5

  8,7

11,8

  3,1

10,5

3,0

8,3

1,8

3,6

2,3

3,6

1457 M 19

 

 

14,4

14,5

  8,7

11,8

  3,1

11,0

3,0

8,3

1,8

3,6

2,3

3,6

1457 M 16

20,0

17,6

  5,7

5,2

4,5

3,3

        Größe in kb; Die markierten Fragmente, die Anteile von Tn917 enthalten, sind hervorgehoben.

 

 

 

Für die Untersuchung mit der Sonde aus M20 wurden neben dem Wildtyp die Mutanten M12 und M17 als Kontrolle eingesetzt. In der EcoRI-Spaltung wurde für den Wildtyp und die beiden Kontrollmutanten ein 1,4 kb großes Fragment chromosomaler DNA markiert (Bild 12, Spur 1, 2 und 3). Dieses hybridisierte nicht mit der EcoRI-gespaltenen chromosomalen DNA der Mutante M20. Für die Mutante M20 wurde nur ein 6,4 kb großes Fragment markiert (Bild 12, Spur 4). Dies entspricht dem um die Größe des Transposons Tn917 verschobenen chromosomalen DNA-Fragment des Wildtyps. Alle das Transposon Tn917 enthaltenden Fragmente sind in Tabelle 4 verzeichnet. In der HindIII-Spaltung hybridiserte bei den Mutanten M12 und M17 ein 7,1 kb großes Fragment chromosomaler DNA, das bei der Mutante M20 nicht markiert wurde (Bild 12, Spur 9-12). In der chromosomalen DNA des Wildtypstamms S. epidermidis 1457 konnte dieses Fragment ebenfalls nicht markiert werden. Bei weiteren Hybridisierungsuntersuchungen konnte in der Folge aber ein 7,1 kb großes, mit dieser Sonde hybridisierendes, Fragment chromosomaler DNA in der HindIII-Spaltung bei S. epidermidis 1457 nachgewiesen werden (Siehe Kapitel 3.4, Bild 17). In der Spaltung mit dem Enzym XbaI zeigte sich für den Wildtyp S. epidermidis 1457 nicht das erwartete Bild. Das markierte Fragment wies nur eine Größe von 4,2 kb auf, im Gegensatz zu dem bei den Mutanten M12 und M17 hybridisierenden 20,2 kb großen chromosomalen DNA-Fragmenten. Die Fragmentgrößen aller untersuchten Mutanten hingegen entsprachen in der Größenordnung der vorgegebenen Kartierung (Bild 12, Spur 6, 7 und 8; Tabelle 4). Weitere Untersuchungen, die zur Klärung des Restriktionsverhaltens des Wildtypstamms führen, stehen noch aus. Nachdem die Ergebnisse der Untersuchungen bis auf diese Ausnahme den geforderten Kriterien entsprachen, wird auch für diese Mutante die Identität des klonierten Fragments mit der Transposoninsertionsstelle angenommen.


 

 

Bild 12

 

Bild 12 Nachweis der Identität des klonierten Fragments der Mutante M20. Die Hybridisierung im Southernblot mit dem radioaktiv markiertem Fragment. 1-4 1457, M12, M17, M20 EcoRI; 5-8 1457, M12, M17, M20 XbaI; 9-12 1457, M12, M17, M20 HindIII

 

 


 

Tabelle 4
 Fragmentgrößen der nach der gegebenen Kartierung erwarteten und der in der
Hybridisierung mit Sonde M20 erhaltenen Fragmente

 

Stamm

EcoRI

Kartierung

EcoRI

Hybr.

XbaI

Kartierung

XbaI

Hybr.

HindIII

Kartierung

HindIII

Hybr.

1457 wt

 

1,2

1,4

28,2

4,2

11,1

 

1457 M12

 

 

 

 

1,2

6,0

1,4

5,5

1,15

11,4

28,2

 

0,9

8,7

20,2

1,3

2,3

3,7

11,1

1,1

2,1

3,2

7,1

1457 M17

 

 

 

 

1,2

9,8

1,4

9,5

2,5

8,6

28,2

1,9

7,8

20,2

1,3

1,6

6,0

11,1

1,1

1,5

5,4

7,1

1457 M20

6,8

6,4

5,7

25,1

4,8

20,2

1,3

1,6

13,8

1,1

1,4

11,5

         Größe in kb; Die markierten Fragmente, die Anteile von Tn917 enthalten, sind hervorgehoben.

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende

 

 

3.4       Untersuchung von Wildtypstämmen mit den erhaltenen Sonden

 

Nach dem Nachweis der Identität der klonierten chromosomalen DNA-Fragmente standen diese nun als Sonden für weitere Untersuchungen bereit. Von Interesse war das Vorkommen der durch die Transposoninsertionen inaktivierten Gene bei S. epidermidis Stämmen mit unterschiedlicher phänotypischer Ausprägung von Biofilm- und Mukoidbildung. Für diese Untersuchungen wurden aus einer Stammsammlung zu dem Stamm S. epidermidis 1457 zwölf weitere S. epidermidis Wildtypstämme gefügt. Bei 10 dieser Stämme war das icaADBC-Operon mittels Hybridisierung mit spezifischen Sonden und durch PCR nachgewiesen worden (Tabelle 5). Innerhalb dieser icaADBC-positiven Wildtypstämme zeigte sich eine Variation des Phänotyps von sehr starker bis zu fehlender Biofilmbildung. Die Ausprägung von mukoidem Wachstum auf mit N-Acetylglucosamin supplementiertem Purple-Agar korrelierte mit der Biofilmbildung der Stämme (Tabelle 5). In zwei der Wildtypstämme konnte das icaADBC-Operon nicht nachgewiesen werden. Diese beiden Stämme zeigten einen biofilm- und mukoidnegativen Phänotyp (Tabelle 5).

 

Tabelle 5
Geno- und phänotypische Charakterisierung
der untersuchten Wildtypstämme

 

Stamm

IcaADBC- PCR

 

Biofilmbildung

in TSBBBL

OD570

Mukoider Phänotyp

1457

+

2,500

+++

 

RP62A

+

2,446

++

 

ZK 1815

+

2,170

+

 

SE5

+

1,800

+++

 

BK 521

+

1,643

++

 

BK 1057

+

0,798

-

 

BK 939

+

0,724

+

 

BK 1535

+

0,237

-

 

BK 10333

+

0,035

-

 

BK 5179

+

0,014

-

 

BK 7837

+

0,009

-

 

BK 9225

-

0,004

-

 

BK 9896

-

0,027

-

 

 

 

Es wurde die chromosomale DNA aller Wildtypstämme nach Spaltung mit Restriktionsenzymen und Auftrennung der Fragment in einem Agarosegel mit den radioaktiv markierten Sonden der einzelnen Mutanten unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Es wurden jeweils die gesamten, das Transposon Tn917 bzw. dessen Anteile enthaltenden, klonierten Fragmente zur Hybridisierung verwendet.

 

In der HindIII-Spaltung der chromosomalen DNA der Wildtypstämme hybridisierte mit dem Fragment des Plasmids pSKJK74.9 (M12) bei fast allen Wildtypstämmen ein 1,7 kb großes Fragment. Im Gegensatz dazu zeigte der biofilmnegative S. epidermidis Stamm BK9896 ein Fragment der Größe von 5,0 kb (Bild 13). In der EcoRI-Spaltung der chromosomalen DNA konnte bei allen Stämmen ein identisches, 0,4 kb großes Fragment nachgewiesen werden (ohne Bild).

 

 

Bild 13

 

Bild 13 Hybridisierung einer HindIII-Spaltung chromosomaler DNA der Wildtypstämme mit der Sonde aus Plasmid pSKJK74.9 (M12). 1 ZK 1815; 2 SE5; 3 BK 521; 4 BK 1057; 5 BK 1535; 6 BK 7837; 7 1457; 8 RP62A; 9 BK 939; 10 BK 10333; 11 BK 5179; 12 BK 9225; 13 BK 9896.

 

 

In der Hybridisierung einer EcoRI-Spaltung der Wildtypstämme mit dem klonierten Fragment von Plasmid pSKJK186.41 (M15) zeigten fast alle Stämme ein identisches 6,3 kb großes Fragment. Einzige Ausnahme bildete hier wiederum der biofilmnegative Stamm BK9896, bei dem ein 3,0 kb großes Fragment hybridisierte (Bild 14).

 

 

Bild 14

 

Bild 14 Hybridisierung einer EcoRI-Spaltung chromosomaler DNA der Wildtypstämme mit der Sonde aus Plasmid pSKJK186.41 (M15). 1 ZK 1815; 2 SE5; 3 BK 521; 4 BK 1057; 5 BK 1535; 6 BK 7837; 7 1457; 8 RP62A; 9 BK 939; 10 BK 10333; 11 BK 5179; 12 BK 9225; 13 BK 9896.

 

 

Mit dem markierten Fragment der Mutante M16 konnte für alle Wildtypstämme ein identisches 8,3 kb großes Fragment in der EcoRI-Spaltung nachgewiesen werden (Bild 15).

 

 

Bild 15

 

Bild 15 Hybridisierung einer EcoRI-Spaltung chromosomaler DNA der Wildtypstämme mit der Sonde aus Plasmid pSKJK186.19 (M16). 1 ZK 1815; 2 SE5; 3 BK 521; 4 BK 1057; 5 BK 1535; 6 BK 7837; 7 1457; 8 RP62A; 9 BK 939; 10 BK 10333; 11 BK 5179; 12 BK 9225; 13 BK 9896.

 

 

Mit der Sonde der Mutante M20 zeigte der Wildtypstamm S. epidermidis 1457 ein von allen anderen Stämmen abweichendes Hybridisierungsmuster in der EcoRI-Spaltung. Es wurde ein deutlich markiertes chromosomales DNA-Fragment der Größe 1,6 kb gefunden. Daneben hybridisierten drei schwächer markierte chromosomale DNA-Fragmente der Größen 1,2, 2,9 und 5,9 kb (Bild 16, Spur 7). Alle anderen Wildtypstämme zeigten ein 9,2 kb großes Fragment chromosomaler DNA in der Hybridisierung. Zusätzlich hybridisierende chromosomale DNA-Fragmente wiesen die Stämme BK 521 (4,5 kb), BK 939 (1,2 kb) und BK 9896 (2,1 und 3,2 kb) auf (Bild 16, Spur 3, 8, 13).

 

 

Bild 16

 

Bild 16 Hybridisierung einer EcoRI-Spaltung chromosomaler DNA der Wildtypstämme mit der Sonde der Mutante M20. 1 ZK 1815; 2 SE5; 3 BK 521; 4 BK 1057; 5 BK 1535; 6 BK 7837; 7 1457; 8 RP62A; 9 BK 939; 10 BK 10333; 11 BK 5179; 12 BK 9225; 13 BK 9896.

 

 

Nach diesem Ergebnis wurde mit der Sonde von Mutante M20 eine weitere Restriktionsspaltung der chromosomalen DNA der S. epidermidis Wildtypstämme mit dem Enzym HindIII untersucht. Hier fand sich wiederum ein deutlicher Polymorphismus der Restriktionsfragmentlängen. Die Stämme ZK 1815, SE5, BK 521, BK 1057, BK 1535, BK 7837, BK 10333 und BK 939 zeigten ein chromosomales DNA-Fragment von 1,9 kb Größe (Bild 17, Spur 1-6, 9, 10). Der Stamm S. epidermidis 1457 zeigte ein 7,1 kb großes chromosomales DNA-Fragment. Daneben wurden drei weitere Fragmente chromosomaler DNA der Größen 1,6, 1,9 und 4,3 kb schwach markiert (Bild 17, Spur 7). Von den Stämmen RP62A, BK5179 und BK9896 hybridisierte ein 4,3 kb großes Fragment chromosomaler DNA (Bild 17, Spur 8, 11, 13). Der Stamm BK 9225 wies ein 3,2 kb großes chromosomales DNA-Fragment auf (Bild 17, Spur 12).

 

 

Bild 17

 

Bild 17 Hybridisierung einer HindIII-Spaltung chromosomaler DNA der Wildtypstämme mit der Sonde aus Plasmid pSKJK30.30 (M20). 1 ZK 1815; 2 SE5; 3 BK 521; 4 BK 1057; 5 BK 1535; 6 BK 7837; 7 1457; 8 RP62A; 9 BK 939; 10 BK 10333; 11 BK 5179; 12 BK 9225; 13 BK 9896.

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende

3.5       Sequenzierung der klonierten Fragmente

3.5.1     Kurzstreckige Sequenzierung mit S35-markierten Nukleotiden

 

Der Nachweis der durch das Transposon Tn917 getroffenen chromosomalen Abschnitte der einzelnen Mutantenklassen in allen Wildtypstämmen zeigt, daß die inaktivierten Genorte auch unabhängig von dem icaADBC-Operon in S. epidermidis-Stämmen auftreten. Um näheren Aufschluß über die Natur der durch die Transposoninsertionen inaktivierten Gene zu erhalten, wurden die klonierten Fragmente ansequenziert. Die Fragmente der Mutanten M12 und M20 wurden mit den beiden aus dem Transposon Tn917 am 5´- und 3´-Ende herauslesenden Oligonukleotiden 5L und 3R sequenziert (Bild 6). Für die Klone der Mutanten M15, M19 und M16 wurde nur aus dem die Erythromycinresistenz tragenden Abschnitt des Transposons mit dem Oligonukleotid 5L sequenziert.

 

Mittels Sequenzvergleich von Tn917 mit den erhaltenen Sequenzen im Bestfit-Programm des HUSAR (Heidelberg Unix Sequenz Analysis Resources) wurde die Insertionsstelle des Transposons bestimmt. Die so ermittelte, das Transposon flankierende Sequenz wurde mit dem Suchinstrument BLASTN auf Homologien mit bereits bekannten Genen untersucht. Dazu wurden die erhaltenen Sequenzen im FASTA Format mit Email an das National Center for Biotechnology Information (NCBI) gesandt, von deren Server automatisch das Ergebnis übermittelt wurde. Alle weiteren Arbeitsschritte zur Verarbeitung der erhaltenen Sequenzdaten wurden mit Programmen des HUSAR, auf dem Genius-server des Deutschen Krebsforschungszentrums in Heidelberg durchgeführt.

 

Für die Insertion der Mutante M12 konnte die für die Insertion des Transposon Tn917 typische Verdoppelung von fünf Basen nachgewiesen werden (Tabelle 6). Die beiden erhaltenen Sequenzen wurden nach Herausnahme der verdoppelten Basen zusammengefügt und weiter untersucht. Eine Homologie mit bekannten Sequenzen konnte für die untersuchte Gesamtsequenz von 97 Basen nicht gefunden werden.



Tabelle 6
 
Flankierende Nukleotidsequenzen der Transposoninsertionsstellen

 

Mutante

Flankierende Nukleotidsequenz

M12

CTG GTT CCA CTT Tn917 CAC TTT AAT CTT

M15

AAT TCA CAA AAA Tn917

M19

AAT TCA CAA AAA Tn917

M16

AAC TGT CAT ACC Tn917

M20

AAA TGC ATT TAA Tn917 TTT AAA TGC ATT

  Die gefundenen Basenverdoppelungen von je fünf Basen sind hervorgehoben.                                    

 

 

Bei der Sequenzierung der das 5´-Ende von Tn917 flankierenden Fragmente der Mutanten M15 und M19 wurde festgestellt, daß das Transposon an identischer Stelle inseriert hat (Tabelle 6). In der Folge wurde nur noch mit dem Plasmid pSKJK186.41 (M15) gearbeitet. Die Sequenz von 50 Basen zeigte keine Homologie zu bereits bekannten Genen. Die 53 Basen lange Sequenz der Mutante M16 wies ebenfalls keine Homologie zu bekannten Genen in der BLASTN-Suche auf.

 

Für die Mutante M20 konnte ebenfalls eine Verdoppelung von fünf Basen bei der Transposoninsertion nachgewiesen werden (Tabelle 6). Die gefundene Gesamtsequenz von 108 Basen Länge zeigte ebenso keine Homologie zu bekannten Genen auf.

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende

 

 

3.5.2     Langstreckige automatische Sequenzierung

 

Nachdem die kurzstreckige Ansequenzierung der klonierten, chromosomalen DNA für keine Mutante eine Homologie zu bekannten Genen ergab, sollten nun längere Sequenzabschnitte untersucht werden. Hierzu wurden die gewonnenen Fragmente mit dem automatischen Sequenziergerät AbiPrism 310 sequenziert. Es wurde ebenfalls mit den Oligonukleotiden 3R und 5L aus dem Transposon Tn917 herausgelesen. Gleichzeitig wurde mit den die „multiple cloning site“ des Vektors pSK flankierenden Oligonukleotiden M13-20 und M13reverse in die klonierten Fragmente gelesen (Bild 4). Die auf diese Weise erhaltenen Sequenzen von einer Länge bis zu 600 Basen wurden wiederum mittels Bestfit mit den Sequenzen des Transposons bzw. des Vektors verglichen. Die Transposon- und Vektoranteile wurden herausgenommen. Die verbleibende Sequenz der chromosomalen DNA wurde erneut zur Homologiesuche mit Email an das NCBI gesandt.

 

Die beiden kurzen, das Transposon flankierenden Bereiche von pSKJK74.9 (M12) konnten vollständig für beide DNA-Stränge, jeweils vom Vektor und dem Transposon aus, sequenziert werden. Nach dem Zusammenfügen der beiden Teilsequenzen unter Entfernung der Basenverdoppelung ergab sich die in Bild 18 dargestellte Gesamtsequenz von 468 Basenpaaren. Bei einer BLASTN-Suche fand sich für die vollständige Sequenz keine Homologie zu bekannten Genomabschnitten. Es zeigten sich aber zwei potentielle offene Leseraster, die durch genau ein Stopcodon voneinander getrennt waren. Die Aminosäuresequenzen der beiden Leseraster wurden einzeln mittels BLASTP mit bekannten Proteinen verglichen. Dabei ergab sich für den ersten Leserahmen eine Homologie mit dem das pur-Operon von Bacillus subtilis regulierenden Repressorprotein PurR (Weng et al., 1995). Die potentielle Aminosäuresequenz des zweiten Leserahmens zeigte eine Homologie zu einem Protein unbekannter Funktion. Das Gen für dieses Protein ist im Genom von B. subtilis direkt hinter dem Gen für PurR lokalisiert. Innerhalb der Aminosäuresequenz von PurR befindet sich eine Bindestelle für 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat (PRPP), die der Konsensussequenz für PRPP-Bindungsstellen entspricht (Weng et al., 1995). In der zu PurR homologen potentiellen Aminosäuresequenz der Mutante M12 konnte ebenfalls eine dieser Konsensussequenz entsprechende Sequenz gefunden werden (Bild 19).


      GAATTCTAATGTCCTCGTAGTAGACGATTTTATGAGGGCTGGTGGCTCAA

   1  ---------+---------+---------+---------+---------+   50

       N  S  N  V  L  V  V  D  D  F  M  R  A  G  G  S  I

      TTAATGGAGTAATGAATTTAATGAATGAGTTTAAAGCCCATGTAAAAGGG

  51  ---------+---------+---------+---------+---------+   100

        N  G  V  M  N  L  M  N  E  F  K  A  H  V  K  G

 

      GTATCAGTACTTGTAGAATCAAAAGAAGTAAAACAAAGATTAATTGAAGA

 101  ---------+---------+---------+---------+---------+   150

      V  S  V  L  V  E  S  K  E  V  K  Q  R  L  I  E  D

 

      TTATACTTCCTTAGTCAGATTGTCAGATGTCGACGAGTACAACCAAGAAT

 151  ---------+---------+---------+---------+---------+   200

       Y  T  S  L  V  R  L  S  D  V  D  E  Y  N  Q  E  F

         WTn917

      TTAAAGTGGAACCAGGCAACAGTTTGTCTAAATTTTCTTAAAAAAGGAGT

 201  ---------+---------+---------+---------+---------+   250

        K  V  E  P  G  N  S  L  S  K  F  S  *  K  R  S

 

      GZCAAATTCATCATGAAAATAATCAACTCAGATAAGGTACCCGAAGCACT

 251  ---------+---------+---------+---------+---------+   300

      X  K  F  I  M  K  I  I  N  S  D  K  V  P  E  A  L

 

      AGGCCCATATTCGCATGCAACTGTTATAAACGGTTTTGTCTTTACATCAG

 301  ---------+---------+---------+---------+---------+   350

       G  P  Y  S  H  A  T  V  I  N  G  F  V  F  T  S  G

 

      GTCAAATTCCACTCACACTTGATGGAACAATTGTTAGCGATGATGTTCAA

 351  ---------+---------+---------+---------+---------+   400

        Q  I  P  L  T  L  D  G  T  I  V  S  D  D  V  Q

 

      GAACAAACTAAGCAAGTTTTAGAAAATTTAACTGTGGTATTAAAAGAAGC

 401  ---------+---------+---------+---------+---------+   450

      E  Q  T  K  Q  V  L  E  N  L  T  V  V  L  K  E  A

 

      AGATTCTGCTTTGAATTC

 451  ---------+--------  468

       D  S  A  L  N

 

 

Bild 18 Nukleotidsequenz des klonierten, chromosomalen DNA-Abschnitts von Mutante M12 mit den Aminosäuresequenzen der beiden offenen Leserahmen. Das Transposon Tn917 ist nach Base 203 lokalisiert. Die SalI-Spaltstelle ist unterstrichen.



 

M12            VLVVDDFMRAGGS

PurR           VLIIDDFMKAGGT

APRT-hs    VVVVDDLLATGGT

APRT-ec    VLVVDDLLATGGT

APRT-sc    VVVVDDVLATGGT

GPAT         VVMVDDSIVRGTT

OPRT         VMLVDDVITAGTA

HGPRT      VLIVEDIIDTGKT

 

Bild 19 Vergleich der Aminosäurefolge der PRPP-Bindestellenmotive des ersten offenen Leserahmens in der Mutante M12 mit dem purR-Gen in B. subtilis, der Adenin-Phosphoribosyltransferasen des Menschen (APRT-hs), von E. coli (APRT-ec) und S. cerevisiae (APRT-sc), sowie der Glutamin-PRPP-Amidotransferase (GPAT), der Orotat-Phosphoribosyltransferase (OPRT) und der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) (Weng et al., 1995). Aminosäuren, die in sieben von acht Proteinen konserviert vorliegen sind hervorgehoben.

 

 

Nach Feststellung der möglichen Übereinstimmung der Aminosäuresequenzen wurden nun gezielt die Nukleotidsequenzen des purR-Gens und des diesem folgenden offenen Leserahmens mit der ermittelten Sequenz verglichen. Es zeigten sich für beide offenen Leseraster jeweils 59,6 % identische Nukleotide zu den entsprechenden Genen (Bild 20, 21). Das die beiden offenen Leserahmen trennende Stopcodon liegt innerhalb der ermittelten Sequenz 25 Basen proximal des entsprechenden für B. subtilis beschriebenen Stopcodons (Bild 20; Weng et al., 1995).


 

              .         .         .         .         .

 588 TTCAAACGTACTCATTATTGATGACTTTATGAAAGCAGGCGGCACCATTA 637

     ||| || || ||| |  | || || |||||||  || || ||| | ||||

   4 TTCTAATGTCCTCGTAGTAGACGATTTTATGAGGGCTGGTGGCTCAATTA 53

              .         .         .         .         .

 638 ATGGTATGATTAACCTGTTGGATGAGTTTAACGCAAATGTGGCGGGAATC 687

     ||||  | || ||  |  || |||||||||| ||  ||||    ||  |

  54 ATGGAGTAATGAATTTAATGAATGAGTTTAAAGCCCATGTAAAAGGGGTA 103

              .         .         .         .         .

 688 GGCGTCTTAGTTGAAGCCGAAGGAGTAGATGAACGTCTTGTTGACGAATA 737

        ||  | || ||| |  ||| |||| |  || |  |  |||| || ||

 104 TCAGTACTTGTAGAATCAAAAGAAGTAAAACAAAGATTAATTGAAGATTA 153

              .         .         .         .         .

 738 TATGTCACTTCTTACTCTTTCAACCATCAACATGAAAGAGAAGTCCATTG 787

     ||  ||  |  | |   | |||    || ||  | |  |  |     ||

 154 TACTTCCTTAGTCAGATTGTCAGATGTCGACGAGTACAACCAAGAATTTA 203

              .         .         .         .         .

 788 AAATTCAGAATGGCAATTTTCTGCGTTTTTTTAAAGACAATCTTTTAAAG 837

     || |  |    |||||        |||| | ||     ||| || | ||

 204 AAGTGGAACCAGGCAA......CAGTTTGTCTA.....AATTTTCTTAAA 242

              .         .

 838 AATGGAGAGACAGAATCATGA 858

     || |||| | || | |||| |

 243 AAAGGAGTGZCAAATTCATCA 263

 

Bild 20 Bestfit-Vergleich der Nukleotidsequenz des chromosomalen DNA-Abschnitts der Mutante M12 mit dem purR-Gen von B. subtilis (obere Zeile; Weng et al., 1995). Sequenzlücken innerhalb der homologen Sequenz sind durch Punkte gekennzeichnet. Das Stopcodon ist unterstrichen (vergleiche Bild 18).


 

                .         .         .         .         .

     1 ATGACAAAAGCAGTCCACACAAAACATGCCCCAGCGGCAATCGGGCCTTA 50

       || |  |||  | || || || |  | |  || |  ||| | || || ||

   260 ATCATGAAAATAATCAACTCAGATAAGGTACCCGAAGCACTAGGCCCATA 309

                .         .         .         .         .

    51 TTCACAAGGGATTATCGTCAACAATATGTTTTACAGCTCAGGCCAAATCC 100

       ||| || |  | | |  | |||  | |  | |  |  ||||| ||||| |

   310 TTCGCATGCAACTGTTATAAACGGTTTTGTCTTTACATCAGGTCAAATTC 359

                .         .         .         .         .

   101 CTTTGACTCCTTCAGGCGAAATGGTGAATGGCGATATTAAGGAGCAGACT 150

       |  | || | |   ||   ||| || |  |  ||| || | || || |||

   360 CACTCACACTTGATGGAACAATTGTTAGCGATGATGTTCAAGAACAAACT 409

                .         .         .         .         .

   151 CATCAAGTATTCAGCAATTTAAAGGCGGTTCTGGAAGAAGCGGGTGCTTC 200

        | ||||| ||    |||||||  | |||  |  ||||||| | | || |

   410 AAGCAAGTTTTAGAAAATTTAACTGTGGTATTAAAAGAAGCAGATTCTGC 459

 

   201 TTT 203

       |||

   460 TTT 462

 

Bild 21 Bestfit-Vergleich der Nukleotidsequenz des chromosomalen DNA-Abschnitts der Mutante M12 mit dem hinter dem purR-Gen lokalisierten offenen Leserahmen von B. subtilis (obere Zeile; Weng et al., 1995).

 

 

Das klonierte Fragment von Mutante M15 wurde mit den Oligonukleotiden 5L und M13reverse von Seiten des Transposons und des Vektors sequenziert. Für die 430 Basen lange Sequenz mit dem Oligonukleotid 5L und die 390 Basen lange Sequenz mit dem Oligonukleotid M13reverse konnte keine Überlappung gefunden werden. Die in der Kartierung vermessene Größe von 0,8 kb des klonierten chromosomalen DNA-Anteils läßt jedoch vermuten, daß die Enden der beiden Sequenzen nahe beieinander liegen. Mit der aus dem Transposon herausgelesenen Sequenz wurden in der BLASTN-Suche keine ausreichend wahrscheinliche Homologie mit bekannten Genomabschnitten gefunden. Die aus dem Vektor mit dem Oligonukleotid M13reverse gelesene Sequenz zeigte jedoch mit 80,9 % identischen Nukleotiden (Bild 22) eine hohe Homologie zu einem offenen Leserahmen von S. aureus, der unmittelbar vor dem Operon für den alternativen Sigmafaktor sB lokalisiert ist (Kullik et al., 1997; Wu et al., 1996). Es wurde nun gezielt ein Bestfit-Vergleich mit der von Seiten des Transposons sequenzierten Nukleotidsequenz durchgeführt (Bild 23). Hierbei zeigte sich mit 67,6 % identischen Nukleotiden eine Homologie zu dem nicht kodierenden Bereich zwischen dem oben genannten offenen Leserahmen und rsbU, dem ersten Gen des vier Gene umfassenden  sB-Operons von S. aureus (Wu et al., 1996). In dem Vergleich der beiden Sequenzen zeigten sich Verschiebungen der Nukleotidsequenzen. Innerhalb der Sequenz von M15 läßt sich ein purinreicher Bereich als potentielle Shine-Dalgarno-Sequenz finden. Des weiteren lassen sich in passenden Abständen potentielle ‑10 und ‑35-Promotorstellen finden (Bild 23). Von diesen Bereichen ausgehend würde die Translation der mRNA des Gens rsbU 20 Nukleotide vom 5´-Ende der Tn917-Insertion von M15 entfernt beginnen (Wu et al., 1996). Das Startcodon wäre hierfür GTG wie in dem rsbU-Gen von S. aureus (Bild 23). Die dem Startcodon folgende, kurze, potentielle Aminosäuresequenz von 6 Aminosäuren ist in den ersten vier Aminosäuren identisch mit dem Genprodukt RsbU in S. aureus (ohne Bild). Innerhalb der Nukleotidsequenz konnte die bereits durch Restriktionsspaltung nachgewiesene EcoRI-Spaltstelle gefunden werden (siehe Seite 51; Bild 23).


 


 

               .         .         .         .         .

   22 AAGCATGCGATTGCAACGAAACATATTTATCTTCTAATTCAACGAATGAA 71

      |||| || |||||||| ||| || |||||   |||||||||| |||||||

    1 AAGCTTGTGATTGCAATGAATCACATTTAATATCTAATTCAAAGAATGAA 50

               .         .         .         .         .

   72 TGATTAGACGAGGAGATGTTTATTTAGCAGATTTATCACCAGTACAGGGA 121

      |||||||| ||||||||||:|||||||| |||||||||||||| || ||

   51 TGATTAGAAGAGGAGATGTNTATTTAGCGGATTTATCACCAGTTCAAGGG 100

               .         .         .         .         .

  122 TCTGAACAAGGGGGAGTCAGACCTGTAGTCATAATTCAAAATGATACTGG 171

      ||||||||||||||||| ||||||||||| || |||||||||||||||||

  101 TCTGAACAAGGGGGAGTAAGACCTGTAGTTATCATTCAAAATGATACTGG 150

               .         .         .         .         .

  172 TAATAAATATAGTCCTACAGTTATTGTTGCGGCAATAACTGGTAGGATTA 221

      ||||||||||||||| || || ||||| || || || |||| ::||||||

  151 TAATAAATATAGTCCAACTGTAATTGTAGCTGCGATTACTGANNGGATTA 200

               .         .         .         .         .

  222 ATAAAGCGAAAATACCGACACATGTAGAGATTGAAAAGAAAAAGTATAAG 271

      |||||||||||||||| || || ||||| ||||||||||||||||||||

  201 ATAAAGCGAAAATACCAACCCACGTAGAAATTGAAAAGAAAAAGTATAAA 250

               .         .         .         .         .

  272 TT.GGATAAAGACTCAGTTATATTATTAGAACAAATTCGTACACTTGATA 320

      ||  || ||||| ||||||||  |  | ||||||||| | ||||| ||||

  251 TTAAGACAAAGATTCAGTTATTCTTCTTGAACAAATTAGAACACTAGATA 300

               .         .         .         .         .

  321 AAAAACGATTGAAAGAAAAACTGACGTACTTATCCGATGATAAAATGAAA 370

      |||| || || |||||:||: | || |  |||||  |   || |     |

  301 AAAAGCGTTTAAAAGANAARTTAACATTTTTATCACACAGTAGAGATGTA 350

               .         .         .         .

  371 GAAGTAGATAATGCACTAATGATTAGTTTAGGGCTGAATGC 411

      || || |||| ||| |||:  ||||| || ||  | ||| |

  351 GAGGTCGATACTGC.CTANATATTAGCTTGGGAATAAATAC 390

 

Bild 22 Bestfit-Vergleich der aus dem Vektor mit Oligonukleotid M20reverse gelesenen Sequenz von Plasmid pSKJK186.41 (M15) mit dem vor dem sB-Operon gelegenen offenen Leserahmen in S. aureus (obere Zeile; Wu et al., 1996). Sequenzlücken innerhalb der homologen Sequenz sind durch Punkte gekennzeichnet.


               .         .         .         .         .

  374 GTAGATAATGCACTAATGATTAGTTTAGGGCTGAAT.GCAGTAGCTCAAC 422

      :| ::||||||  ||   || ||||| ||  |:|||  |  | | || |

  441 XTGXXTAATGCTTTAGATATAAGTTTGGGATTXAATAACCTTTGTTCGAT 392

               .         .         .         .         .

  423 CAGAAAAATTAGGCGTCTATTATATGTATTTTTCAG.....AGATAAATA 467

      |||  || |      | |||   || |||    |||     |  |   |

  391 CAGTGAATT.....CTTTATCTAATTTATAAGCCAGTAAACATTTGGGTG 347

               .         .         .         .         .

  468 AAATATTGATATAAAAGACAATAAC.TTTATAATAATTATAACTATTTCT 516

       | |||||| ||| ||| ||||||| |||||||||||:  |    :||

  346 CACTATTGAAATAGAAGGCAATAACTTTTATAATAATXTAAGTGTXTTAA 297

               .         .         .         .         .

  517 AAATTCTGTACG.......AAGAATTTTCTTATAAACAAAGAT....... 552

          | | || |       :|: | |||  ||||:     |||

  296 GTGATATTTAGGATATTTAXAXCACTTTACTATAXTTGTCGATATGTCCC 247

               .         .         .         .         .

  553 ............TTTAGCAAATACCAGTTATGATATT....CATATTTTT 586

                  ||||     || || |   | ||||     |   | ||

  246 TTTCATATTTGATTTAAGGCGTATCACTATAGTTATTATGAAAATGTATT 197

               .         .         .         .         .

  587 TATTATAAAAGGATGTCTTAAGTTTTTTAGGCTTTAGGTATTCCA.TCCT 635

      ||||||:|||||||||||| |||:||| |||||||||||  |||| ||||

  196 TATTATWAAAGGATGTCTTGAGTYTTTAAGGCTTTAGGTTATCCATTCCT 147

               .         .         .         .         .

  636 AAAGTTTTTTGTAGCT....TAAAAGTATCATCTACAGCAAAATTGCAAA 681

      ||||| |||| |||||      ||||| | | |  ||  ||   ||| |

  146 AAAGTCTTTTTTAGCTATCAACAAAGTTTTAACACCAAAAATTATGCTAT 97

               .         .         .         . -35      .

  682 CGACAAAATTGATAAGTGCAATTAAATAAATGTTAGTAAGTGAATCATAA 731

         ||            : || |||||||| |||    | ||  | ||||

   96 TCGCA............KAAAGTAAATAAAGGTTTCATATTG..TTATAA 61

               .         .         .         .     –10  .

  732 TTATCCTTGCTTAAGCATTTGCTTTGTAAGGGAAGTGAGGAGGCAACTAA 781

        ||  | |  ||          ||| |  |||||| |||||||  |

   60 AAATGATGGGATA..........TTGAAGTGGAAGTAAGGAGGC.GCATT 22

               .                          S.D.

  782 TCGTGGAAGAATTTA 796

      ||||||||||||| |

   21 TCGTGGAAGAATTCA 7

 

Bild 23 Bestfit-Vergleich der aus dem Transposon Tn917 mit dem Oligonukleotid 5L gelesenen Sequenz von Plasmid pSKJK186.41 (M15) mit der nicht kodierenden, vor dem sB-Operon gelegenen Nukleotidsequenz in S. aureus (obere Zeile; Wu et al., 1996). Sequenzlücken innerhalb der homologen Sequenz sind durch Punkte gekennzeichnet. Unterstrichen sind die potentiellen –35 und –10-Promotorregionen, sowie die potentielle Shine-Dalgarno-Sequenz (S.D.). Das Startcodon ist doppelt unterstrichen. Die EcoRI-Spaltstelle ist unterbrochen unterstrichen.

 

 

Für die beiden aus dem Transposon und dem Vektor gelesenen Sequenzen von 401 und 540 Basen des Plasmids pSKJK186.19 (M16) konnte ebenfalls keine Überlappung gefunden werden. Dies entspricht der durchgeführten Kartierung, nach der das klonierte chromosomale DNA-Fragment von Mutante M16 eine Größe von 1,0 kb hat. Für die gefundenen Sequenzen ergab sich eine Homologie zu einem Antiterminatorgen von S. carnosus. Dieses wirkt möglicherweise regulatorisch auf die Expression von Genen des Phosphotransferasesystems dieses Bakteriums. Die aus dem Vektor gelesen Sequenz weist auf einer Länge von 378 Basen 66,8 % identische Nukleotide zu diesem Gen auf. Die aus dem Transposon gelesene Sequenz weist hierzu auf einer Länge von 364 Basen 64,3 % identische Nukleotide auf. Das Plasmid pSKJK186.19 (M16) wurde für weitergehende Untersuchungen Frau K. Kiel zur Verfügung gestellt, welche sich mit der näheren Charakterisierung der isoliert mukoid-negativen Transposonmutanten beschäftigt.

 

Das klonierte Fragment von Mutante M20 enthält das komplette Transposon Tn917, so daß beide das Transposon flankierenden Seiten für die Sequenzierung zur Verfügung standen. Die aus dem 5´-Ende des Transposons gewonnene Sequenz reichte bis in die Nukleotidsequenz des Vektors. Durch die Sequenzierung mit dem Oligonukleotid M13reverse konnte die Sequenz vervollständigt werden. Die Gesamtlänge dieses Teilstücks betrug 247 Basen. Dieses Ergebnis bestätigt auch die in der Restriktionsspaltung bestimmte Orientierung des Transposons innerhalb des Vektors. Die mit dem Oligonukleotid 3R gewonnene Sequenz von 470 Basen Länge überlappte nicht mit der 410 Basen langen Sequenz welche mit dem Oligonukleotid M13-20 aus dem Vektor gelesen wurde, so daß die Länge der das 3´-Ende des Transposons flankierenden DNA mindestens 0,9 kb beträgt. Eine XbaI-Spaltstelle konnte in dieser Sequenz noch nicht gefunden werden. Die vollständige Sequenzierung des Fragments steht noch aus. Die nach Herausnahme der Basenverdoppelung erhaltene Gesamtsequenz zeigte einen offenen Leserahmen, der eine Homologie zu einem, dem Phosphotransferasesystem von S. carnosus zugehörigen Gen, aufweist. Das kleinere chromosomale Fragment weist hierzu 80,4 % identische Nukleotide auf. Die mit dem Oligonukleotid 3R gefundene Sequenz zeigt auf einer Länge von 406 Basen 74,4 % identische Nukleotide. Das Plasmid pSKJK30.30 (M20) wurde ebenfalls Frau K. Kiel für weitergehende Untersuchungen zur Verfügung gestellt.

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende

 

3.6       Amplifikation von sigB

 

Die Ergebnisse der Sequenzierung des klonierten chromosomalen DNA-Fragments der Mutante M15 wiesen auf eine hohe Homologie mit dem sB-Operon von S. aureus hin. Es wurden deshalb PCR-Untersuchungen mit für das sB-Operon von S. aureus spezifischen Oligonukleotiden durchgeführt (Bild 24). Zunächst wurden die Funktionsfähigkeit der gewählten Oligonukleotide an den klinischen S. aureus-Isolaten VA 35005 und VA 35043 getestet. Für das Gen rsbU wurden ein sense- (JKMK1) und zwei antisense-Oligonukleotide (JKMK2, JKMK3) getestet. Für das Gen sigB wurden ebenfalls ein sense- (JKMK4) und zwei antisense-Oligonukleotide (JKMK5, JKMK6) getestet. In den S. aureus-Stämmen konnten für alle passenden Oligonukleotidpaare Amplifikate in den erwarteten Größe gefunden werden. Mit dem sigB-spezifischen Oligonukleotidpaar JKMK4 und JKMK6 zeigte sich für S. epidermidis 1457 und die Mutanten M15 und M19 ein 0,7 kb großes Amplifikat (ohne Bild). Dies entspricht der Größe des entsprechenden Amplifikats in S. aureus. Mit dem Oligonukleotidpaar JKMK4 und JKMK5 zeigte sich kein Amplifikat in den S. epidermidis-Stämmen. Die PCR mit rsbU-spezifischen Oligonukleotiden in S. epidermidis 1457 und der Mutante M15 zeigte keine Amplifikate. Es wurde versucht durch PCR-Untersuchungen mit dem Oligonukleotid 5L und den antisense-Oligonukleotiden für rsbU (JKMK2, JKMK3) die Transposoninsertion bei den Mutanten M15 und M19 in dem Gen rsbU direkt nachzuweisen. Es zeigten sich jedoch ebenfalls keine Amplifikate mit diesen Oligonukleotiden. Alle Amplifikate wurde mit dem TOPO-cloning Vektor in E. coli TOP 10 subkloniert.


 

 

Bild 24

 

Bild 24 Die Kartierung des sB-Operons von S. aureus. Dargestellt sind die offenen Leserahmen mit ihrer Leserichtung. Die potentiellen Promotorstellen sind markiert (nach Wu et. al, 1996). Eingezeichnet sind die zur Amplifikation verwendeten Oligonukleotide mit der jeweiligen Orientierung in der PCR. PA sA-Promotor; PB sB-Promotor; 1 JKMK1; 2 JKMK2; 3 JKMK3; 4 JKMK4; 5 JKMK5; 6 JKMK6

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende

 

 

3.7       Sequenzierung des sigB-Amplifikats

 

Das subklonierte sigB-Amplifikat von S. epidermidis 1457 wurde mit den Oligonukleotiden M13reverse und M13-20 von beiden Seiten ansequenziert. Es zeigte sich dabei eine Überlappung der beiden 420 und 400 Basen langen Sequenzen mit einer Länge von 124 Basen. Es ergibt sich somit eine vorläufige Gesamtsequenz von 696 Basen. Diese Sequenz zeigt mit 82,7 % identischen Basen ein hohe Homologie zu dem sigB-Gen in S. aureus (Bild 25). In der erhaltenen Sequenz läßt sich am proximalen und am distalen Ende ein offener Leserahmen finden, der in der potentiellen Aminosäurefolge hoch homolog zu dem Beginn und dem Ende des Genprodukts von sigB in S. aureus ist. Unterbrochen wird dieser Leserahmen in den weiter von dem Startpunkt für die Sequenzierung entfernten Sequenzabschnitten.

 

 

      2724 CTGAGCAAATTAACCAATGGATTAAAGAACACCAAGAAAATAAGAATACA 2773

           |||||||||||||||||||||||||| |||| ||||||||  |  |||

         1 CTGAGCAAATTAACCAATGGATTAAACAACATCAAGAAAACGAAGATAGC 50

                    .         .         .         .         .

      2774 GATGCACAGGATAAGTTAGTTAAACATTACCAAAAACTAATTGAGTCATT 2823

            | || || ||||| ||||| |||||||| |  || || ||||| || ||

        51 CAAGCTCAAGATAAATTAGTAAAACATTATCGTAAGCTGATTGAATCTTT 100

                    .         .         .         .         .

      2824 GGCATATAAATATTCTAAAGGACAATCACATCACGAAGATTTAGTTCAAG 2873

            || ||||  || ||||| |||||||||||||  ||||||||||||||||

       101 AGCTTATAGGTACTCTAAGGGACAATCACATCGTGAAGATTTAGTTCAAG 150

                    .         .         .         .         .

      2874 TTGGTATGGTTGGTTTAATAGGTGCCATAAATAGATTCGATATGTCCTTT 2923

           |||||||||:|||| |||||||||| || |||||||| ||| | || |||

       151 TTGGTATGGNTGGTCTAATAGGTGCTATTAATAGATTTGATTTATCATTT 200

                    .         .         .         .         .

      2924 GAACGGAAGTTTGAAGCCTTTTTAGTACCTACTGTAATCGGTGAAATCAA 2973

           || || |||||||||||||| ||||| || || || || ||||| || ||

       201 GATCGTAAGTTTGAAGCCTTCTTAGT.CCAACAGTTATTGGTGAGATTAA 249

                    .         .         .         .         .

      2974 AAGATATCTACGAGATAA.AACTTGGAG..TGTACATGTTCCGAGACGT. 3019

           ||||||| ||||||||:| ||| |||||    | ||||| || ||||||

       250 AAGATATTTACGAGATNACAACATGGAGGTGTTCCATGTACCTAGACGTT 299

                    .         .         .         .         .

      3020 .ATTAAAGAAATTGGGCCAAGAATCAAAAAA.GTGAGCGATGAACTAACC 3067

             | ||||||||||| ||||||||||||||| || || |||||| | |||

       300 ATTAAAAGAAATTGGTCCAAGAATCAAAAAAGGTTAGTGATGAA.TTACC 348

                    .         .         .         .         .

      3068 GCTGAATTAGAGCGTTCACCTTCTATCA.GTGAAATAGCTGATCGATTAG 3116

             |||| | || |||||||| ||||| | ||||||| ||  | || ||||

       349 AATGAACTTGAACGTTCACCATCTATTAGGTGAAATCGCACAACGCTTAG 398

                    .         .         .         .         .

      3117 AAGTCTCAGAAGAAGAAGTGTTAGAAGCAATGGAAATGGGACAAAGTTAT 3166

           |||| ||||| |||||||| || ||||| ||||| ||||| || |||||

       399 AAGTTTCAGATGAAGAAGTTTTGGAAGCGATGGAGATGGGGCAGAGTTAC 448

                    .         .         .         .         .

      3167 AATGCGTTAAGTGTTGATCATTCCATTGAAGCTGATAAAGATGGTTCAAC 3216

           |||||  | ||||| ||||| || || ||||| |||||||||||||| ||

       449 AATGCCCTGAGTGTGGATCACTCTATAGAAGCAGATAAAGATGGTTCGAC 498

                    .         .         .         .         .

      3217 TGTTACGCTATTAGATATTATGGGGCAACAAGATGACCATTATGACTTAA 3266

            |||||  |||||||||||||||| |||||||||||  ||||||| ||||

       499 AGTTACATTATTAGATATTATGGGACAACAAGATGATAATTATGATTTAA 548

                    .         .         .         .         .

      3267 CTGAAAAACGTATGATTTTAGAAAAAATATTACCTATATTATCTGATCGC 3316

           | |||||||||||||| ||||||   || |||||||  || || ||  |

       549 CGGAAAAACGTATGATATTAGAATGTATTTTACCTACTTTGTCAGAGAGA 598

                    .         .         .         .         .

      3317 GAACGAGAAATCATACAATGTACGTTTATTGAAGGATTGAGTCAAAAAGA 3366

           ||| || |||||||||||||||| |||||||||||  | || ||||||||

       599 GAAAGACAAATCATACAATGTACTTTTATTGAAGGTCTTAGCCAAAAAGA 648

                    .         .         .         .

      3367 GACAGGTGAGCGTATCGGTTTAAGTCAAATGCATGTATCACGACTTCA 3414

           ||| |||||  | || ||| | ||||||||||||||||||||||||||

       649 GACTGGTGAAAGAATTGGTCTTAGTCAAATGCATGTATCACGACTTCA 696

 

Bild 25 Bestfit-Vergleich der Nukleotidsequenz der mit sigB-spezifischen Oligonukleotiden amplifizierten DNA von S. epidermidis mit dem sigB-Gen von S. aureus (obere Zeile; Wu et al., 1995).

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende

 

 

3.8       Hybridisierung mit sB-spezifischen Sonden

 

Die subklonierten Amplifikate der PCR-Untersuchungen standen als spezifische Sonden für Hybridisierungen zur Verfügung. Mit der aus S. epidermidis gewonnenen Sonde für sigB wurde eine Hybridisierung der chromosomalen DNA des S. epidermidis-Wildtyps 1457, der Mutanten M15, M19 und M12 und der S. aureus-Stämme VA 35005 und VA 35043 durchgeführt. In der EcoRI-Spaltung der chromosomalen DNA zeigte sich für S. epidermidis 1457 und M12 ein 6,3 kb großes Fragment (Bild 26, Spur 3, 6). Bei den Mutanten M 15 und M 19 wurde ein 12,7 kb großes Fragment markiert (Bild 26, Spur 4, 5). In der XbaI-Spaltung der chromosomalen DNA zeigte sich für den Wildtyp S. epidermidis 1457 und die Mutante M12 ein 14,2 kb großes Fragment (Bild 26, Spur 9, 12). Bei den Mutanten M15 und M19 wurde ein 11,1 kb großes Fragment markiert (Bild 26, Spur 10, 11). In dieser Hybridisierungsuntersuchung konnte in der chromosomalen DNA der S. aureus-Stämme unter stringenten Bedingungen kein Fragment markiert werden (Bild 26, Spur 1, 2, 7 und 8).


 

 

Bild 26

 

Bild 26 Hybridisierung einer EcoRI- und XbaI-Spaltung chromosomaler DNA der S. aureus-Stämme VA 35005 und VA 35043 und der S. epidermidis-Stämme 1457, M15, M19 und M12 mit dem sigB-Amplifikat von S. epidermidis. 1-6 EcoRI-Spaltung: 1 VA 35005; 2 VA 35043; 3 1457; 4 M15; 5 M19; 6 M12; 7-12 XbaI-Spaltung: 7 VA 35005; 8 VA 35043; 9 1457; 10 M15; 11 M19; 12 M12

 

 

Die durch die sigB-Sonde markierten Fragmente entsprachen den Fragmenten der Hybridisierung zum Nachweis der Identität Transposoninsertionsstelle von M15 (Tabelle 2). Dies beweist die Lokalisierung des zu sigB von S. aureus homologen Gens in dem das Transposons Tn917 flankierenden chromosomalen EcoRI-Fragment in Mutante M15. Da sich unmittelbar proximal der Tn917-Insertion eine EcoRI-Spaltstelle in der chromosomalen DNA befindet, die durch Sequenzierung bestätigt wurde (Bild 23), muß sich das homologe Gen distal der Transposoninsertion befinden.

 

In einer Hybridisierung mit dem rsbU-Amplifikat von S. aureus VA 35005 konnten unter stringenten Bedingungen in der gespaltenen chromosomalen DNA der S. epidermidis-Stämme, im Gegensatz zu S. aureus keine Fragmente markiert werden (ohne Bild).

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende

3.9        Weitergehende phänotypische Untersuchungen

3.9.1     Biofilmbildung in NaCl-supplementiertem Medium

 

Die Inaktivierung des Gens rsbU und damit die potentielle Inaktivierung des alternativen Sigmafaktors sB war Anlaß für Untersuchung des Verhaltens von Wildtyp S. epidermidis 1457 und seiner Mutanten unter Streßbedingungen. Für B. subtilis sind verschiedenste Streßfaktoren beschrieben, welche die Expression von sB beeinflussen (Boylan et al. 1992; Völcker et al. 1994). Da für Untersuchungen auf Transkriptionsebene entsprechende Sonden fehlten, wurden zunächst phänotypische Untersuchungen durchgeführt. Es wurde das Wachstum in Medien mit subinhibitorischen Mengen an Streßfaktoren, die für B. subtilis bekannt sind, untersucht. Zunächst wurde der Streßfaktor erhöhter Osmolarität gewählt. Für S. epidermidis 1457 und seine Mutanten wurde ein Biofilmtest in TSBBBL–Medium mit zusätzlich zugefügten NaCl-Anteilen von 1, 2 und 4 % durchgeführt. Der Wildtyp S. epidermidis 1457 zeigte eine für das Auge erkennbare Zunahme der Biofilmbildung. Aufgrund der starken Biofilmbildung lagen jedoch alle gemessenen Werte oberhalb des Meßbereichs des verwendeten Photometers. Die Mutanten M10, M13, M24, M12 und M15 zeigten in den verschiedenen Medien keine Unterschiede und blieben phänotypisch biofilmnegativ. Die Mutante M17 zeigte eine deutliche Verstärkung der Biofilmbildung mit steigender Salzkonzentration im Medium. Auch für die Mutanten M16 und M20 war mit dem Auge eine vermehrte Biofilmbildung erkennbar, die jedoch wie für den Wildtyp S. epidermidis 1457 vom Photometer nicht erfaßt werden konnte (Tabelle 7).


Tabelle 7

Biofilmbildung von S. epidermidis Wildtypstämmen und Transposonmutanten
 in TSBBBL und TSBBBL mit NaCl-Supplementation

 

Stamm

Klasse

icaADBC

0%

1%

2%

4%

1457

wt

+

2,500

2,500

2,500

2,500

1457-M10

I

+

0,023

0,011

0,006

0,008

M13

I

+

0,013

0,010

0,006

0,004

M24

I

+

0,018

0,018

0,015

0,009

M12

II

+

0,013

0,008

0,010

0,009

M15

III

+

0,031

0,007

0,003

0,001

M17

IV

+

1,422

2,151

2,285

2,500

M16

V

+

2,500

2,500

2,500

2,500

M20

VI

+

2,500

2,500

2,500

2,500

BK 1535

Wt

+

0,237

1,145

1,558

1,428

BK 7837

Wt

+

0,009

0,212

0,541

1,782

BK 939

wt

+

0,724

2,365

2,415

1,518

BK 10333

wt

+

0,035

0,010

0,021

0,005

BK 5179

wt

+

0,014

0,009

0,015

0,002

BK 9225

wt

-

0,004

0,004

0,004

0,001

               Werte in OD570; Die Prozentzahlen geben den zusätzlichen Anteil von NaCl im Medium an.

               wt Wildtypstamm

 

 

Weil der Wildtyp S. epidermidis 1457 in dem unsupplementierten Medium Ausgangsmeßwerte zeigte, die oberhalb des Meßbereichs des Photometers lagen, wurden zusätzlich noch fünf weitere icaADBC-positive Wildtypstämme mit geringer oder fehlender Biofilmbildung unter den gleichen Bedingungen untersucht. Als Kontrolle wurde ein icaADBC-negativer S. epidermidis-Stamm mitgeführt. Bei den drei icaADBC-positiven Wildtypstämmen BK 1535, BK 7837 und BK 939 ließ sich durch steigende NaCl-Konzentrationen im Medium eine Steigerung der Biofilmexpression feststellen. Die Stämme BK 10333 und BK 5179 blieben unverändert biofilmnegativ, ebenso wie der icaADBC-negative Stamm BK 9225 (Tabelle 7).

 

Kapitelanfang Einen Absatz zurück Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor Einen Absatz vor Kapitelende

 

3.9.2     Biofilmbildung in Ethanol-supplementiertem Medium

 

Als weiterer Streßfaktor, welcher bei B. subtilis auf die Expression von sB einwirkt, ist Ethanol beschrieben (Boylan et al. 1992; Völcker et al. 1994) . Es wurden die bereits mit NaCl-Supplementierung untersuchten S. epidermidis-Stämme einem Biofilmtest in TSBBBL–Medium mit aufsteigender Konzentration an Ethanol (1, 2 und 4 %) unterzogen. Der Wildtyp S. epidermidis 1457 zeigte auch hier keine meßbare Änderung in seinem Biofilmverhalten. Die Mutanten M10, M13, M24 und M12 blieben phänotypisch biofilmnegativ. Die Mutante M15 zeigte mit der Ethanolsupplementierung nun aber ebenso wie die Mutante M17 eine Steigerung der Biofilmbildung bis über die Meßgrenze des Photometers. Bei den untersuchten Wildtypstämmen zeigte sich ein vergleichbares Ergebnis mit den Untersuchungen unter erhöhter Osmolarität. Auch in diesem Test zeigten die Wildtypstämme BK1535, BK 7837 und BK 939 eine Steigerung der Biofilmbildung mit zunehmender Ethanolkonzentration im Medium. Die Stämme BK 1033, BK 5179 und BK 9225 zeigten auch hier einen biofilmnegativen Phänotyp (Tabelle 8).

 

 

Tabelle 8

Biofilmbildung von S. epidermidis Wildtypstämmen und Transposonmutanten
 in TSBBBL und TSBBBL mit Ethanol-Supplementation

 

 

Stamm

Klasse

icaADBC

0%

1%

2%

4%

1457

wt

+

2,500

2,500

2,500

2,500

1457-M10

I

+

0,008

0,011

0,014

0,018

M13

I

+

0,005

0,013

0,013

0,010

M24

I

+

0,007

0,011

0,019

0,045

M12

II

+

0,013

0,013

0,011

0,032

M15

III

+

0,031

0,156

0,818

2,500

M17

IV

+

1,422

1,376

2,500

1,418

M16

V

+

2,500

2,457

2,449

2,479

M20

VI

+

2,500

2,409

2,451

2,457

BK 1535

wt

+

0,237

2,406

2,500

2,216

BK 7837

wt

+

0,009

0,322

0,970

1,359

BK 939

wt

+

0,724

2,500

2,500

2,500

BK 10333

wt

+

0,035

0,017

0,015

0,028

BK 5179

wt

+

0,014

0,019

0,013

0,030

BK 9225

Wt

-

0,004

0,007

0,004

0,008

             Werte in OD570; Die Prozentzahlen geben den zusätzlichen Anteil von Ethanol im Medium an.

             wt Wildtypstamm

 

Ein Kapitel zurück Ein Kapitel vor