H. ANHANG



Tabelle I: Vergleich der Kontrollen (ohne RA mit 1. Antikörper) mit den Leerwerten (ohne RA ohne 1. Antikörper) in allen Experimenten für die Neuroblastomzellinie SK-N-SH, die Medulloblastomzellinie TE671 und die Melanomzellinie Mel/JuSo. Die OD wurden im CD44 Mikro-ELISA ermittelt. In der Spalte „Unterschied“ ist angegeben um wieviel mal höher die OD der Kontrollen gegenüber den OD der Leerwerte sind. Inkubationszeit: 8 Tage


Zellinie

SK-N-SH

TE671

Mel/JuSo

Leerwert

0,055

0,239

0,184

OD Kontrolle

0,200

0,445

0,433

Unterschied

3,67

1,86

2,35

[Leerwert * n]








Tabelle II: Siehe Tabelle I. Es wurden die Gliomzellinien untersucht.


Zellinie

87 HG-31

86 HG-39

85 HG-63

87 HG-14

85 HG-66/T6

87 HG-28

Leerwert

0,115

0,119

0,146

0,114

0,099

0,109

OD Kontrolle

0,353

0,356

0,503

0,434

0,353

0,501

Unterschied

3,07

2,99

3,45

3,81

3,57

4,60




Tabelle III: Veränderung der Zellzahl unter Einfluß von 1% Alkohol als OD-Werte des BCA Protein-Assay. Es wurden die Mittwerte aus n Vertiefungen gebildet. Differenz, absolut gibt die Differenz zwischen Kontrolle und den Zellen, die in 1% Alkohol wuchsen, wieder. Veränderung in % ist zuletztgenannter Wert als Prozentwert von der Kontrolle. Die Messungen wurden im gleichen Experimentansatz wie die Untersuchung der CD44-Expression gemacht. Kulturdauer: 8 Tage. Die Zellen der Kontrolle wuchsen in reinem Medium.














Zellinie


SK-N-SH


N31-87


N39-86


N63-85


N66T6


N14-88


N28-87


Mel-JuSo


TE671


Gesamt

n

12

14

12

14

13

13

12

14

13

117

Kontrolle

0,230

0,316

0,307

0,426

0,342

0,301

0,276

0,365

0,480

0,341

1% Alkohol

0,204

0,313

0,310

0,420

0,330

0,291

0,264

0,364

0,487

0,334

Differenz, absolut

-0,026

-0,004

0,003

-0,006

-0,011

-0,011

-0,012

-0,001

0,007

-0,007

Veränderung in %

-11,24

-1,15

0,95

-1,46

-3,36

-3,57

-4,35

-0,35

1,41

-1,95




Tabelle IV: Einfluß von 1% Alkohol auf die CD44-Expression, ermittelt aus den OD des CD44 Mikro-ELISA. Es wurden die Mittwerte aus n Vertiefungen gebildet. Differenz, absolut gibt die Differenz zwischen Kontrolle und den Zellen, die in 1% Alkohol wuchsen wieder. Veränderung in% ist zuletztgenannter Wert als Prozentwert von der Kontrolle. Die Messungen wurden im gleichen Experimentansatz wie die Untersuchung der CD44-Expression gemacht. Kulturdauer: 8 Tage. Die Zellen der Kontrolle wuchsen in reinem Medium














Zellinie


SK-N-SH


N31-87


N39-86


N63-85


N66T6


N14-88


N28-87


Mel-JuSo


TE671


Gesamt

n

12

14

12

14

13

13

12

14

14

118

Kontrolle

0,307

0,519

0,389

0,600

0,406

0,463

0,576

0,493

0,524

0,479

1% Alkohol

0,272

0,535

0,408

0,611

0,395

0,468

0,542

0,485

0,542

0,477

Differenz, absolut

-0,035

0,016

0,019

0,011

-0,011

0,005

-0,034

-0,008

0,018

0,002

Veränderung in %

-11,3

3,0

5,0

1,9

-2,6

1,1

-5,8

-1,7

3,6

0,42



Tabelle V: Alle OD-Werte aus dem CD44 Mikro-ELISA eines Versuches mit der Zellinie SK-N-SH nach 8 Tagen Inkubationszeit. Aus den Daten wurde eine Dosis-Wirkungskurve mit dem Korrelationskoeffizienten r = 0,81 bei 64 Beobachtungen (p =< 1E-15) errechenet, die unter 2.2.2. dargestellt ist.








RA [µM/l]

0

0,01

0,1

1

10







Werte

0,147

0,153

0,130

0,216

0,222

der

0,124

0,137

0,183

0,240

0,257

optischen

0,129

0,154

0,143

0,234

0,295

Dichte

0,135

0,123

0,144

0,229

0,304

im

0,151

0,159

0,163

0,242

0,288

CD44

0,135

0,156

0,122

0,260

0,262

Mikro-ELISA

0,159

0,156

0,143

0,246

0,275

aus

0,164

0,128

0,149

0,207

0,206

einem

0,150

0,122

0,123

0,155

0,225

Versuch

0,121

0,144

0,162

0,250

0,199


0,106

0,125

0,160

0,228

0,195


0,101

0,136

0,175

0,218

0,183


0,102

0,127

0,150

0,227

0,279


0,090

0,126

0,152

0,221

0,250


0,096

0,138

0,119

0,183

0,185


0,154

0,137

0,120

0,155

0,209







Mittelwert:

0,129

0,139

0,146

0,219

0,240

Standartabw.:

0,024

0,013

0,020

0,031

0,041

St. in % des MW

18,79

9,51

13,46

14,15

17,27

Anstieg ggü.Null

0,00

7,61

13,28

70,11

85,76





Tabelle VI: Der Einfluß von steigenden RA-Konzentrationen auf die CD44-Expression von Gliomzellen nach 8 Tagen als OD im CD44 Mikro-ELISA ohne Berücksichtigung der Zellzahl.

(n) gibt die Anzahl der Beobachtungen wieder, die bei der untersuchten RA-Konzentration pro Versuch gemacht wurde. Die optischen Dichten sind Mittelwerte aus drei Versuchen.


Zellinie

Kontrolle

0,01 µM/l RA

0,1 µM/l RA

1 µM/l RA

10 µM/l RA

(n)

(11-14)

(11-14)

(11-14)

(11-14)

(11-14)

85 HG-66/T6

0,361

0,381

0,334

0,32

0,317

86 HG-39

0,332

0,318

0,329

0,331

0,311

87 HG-31

0,435

0,418

0,405

0,346

0,329

87 HG-28

0,466

0,447

0,445

0,454

0,427

88 HG-14

0,434

0,419

0,404

0,439

0,46

85 HG-63

0,509

0,519

0,497

0,484

0,511






Tabelle VII: Der Einfluß von steigenden RA-Konzentrationen auf den Proteingehalt von Gliomzellen nach 8 Tagen als OD im BCA Protein-Assay ohne Berücksichtigung der Zellzahl. In µg/ml.

(n) gibt die Anzahl der Beobachtungen wieder, die bei der untersuchten RA-Konzentration pro Versuch gemacht wurde. Die optischen Dichten sind Mittelwerte aus drei Versuchen.



Zellinie

Kontrolle

0,01 µM/l RA

0,1 µM/l RA

1 µM/l RA

10 µM/l RA

(n)

(11-14)

(11-14)

(11-14)

(11-14)

(11-14)

85 HG-66/T6

1241

1307

1242

1053

824

86 HG-39

1013

998

781

763

643

87 HG-31

1302

1236

810

475

415

87 HG-28

1136

1090

1008

1080

1122

88 HG-14

1077

991

888

953

1030

85 HG-63

1648

1624

1361

1374

1172




Tabelle VIII:


Zellinie

AusgangsZZ

ZZ Kontrolle

ZZ 10 µMRA

% (K-RA) / K

OD Kontrolle

OD 10 µM/l RA

% (K-RA) / K

n

SK-N-SH


Formel:

OD = 0,0017

ZZ + 0,0733





Versuch 1

20000

86294

99235

15,00

0,22

0,242

10,00

12

Versuch 2

15000

99235

111000

11,86

0,242

0,262

8,26

12

Versuch 3

15000

82175

93353

13,60

0,213

0,232

8,92

8

Mittelwert:

16667

90117

102176

13,38

0,225

0,245

9,04

32

87 HG-31


Formel:

OD = 0,002

ZZ + 0,1077





Versuch 1

5000

108650

56150

-48,32

0,325

0,22

-32,31

14

Versuch 2

4000

110150

35650

-67,64

0,328

0,179

-45,43

14

Versuch 3

4000

137650

42150

-69,38

0,383

0,192

-49,87

10

Mittelwert:

4333

116834

44913

-61,56

0,345

0,197

-42,95

38

86 HG-39


Formel:

OD = 0,0021

ZZ+ 0,1187





Versuch 1

4000

89190

65857

-26,16

0,306

0,257

-16,01

14

Versuch 2

5000

97762

66810

-31,66

0,324

0,259

-20,06

14

Versuch 3

5000

38238

20619

-46,08

0,199

0,162

-18,59

9

Mittelwert:

4667

80040

55214

-31,02

0,276

0,226

-18,21

37

85 HG-63


Formel:

OD = 0,0024

ZZ + 0,1168





Versuch 1

4000

98417

71750

-27,10

0,353

0,289

-18,13

14

Versuch 2

5000

163000

110917

-31,95

0,508

0,383

-24,61

14

Versuch 3

5000

65917

23833

-63,84

0,275

0,174

-36,73

14

Mittelwert:

4667

109111

68833

-36,91

0,379

0,282

-25,53

42

85HG-66T6


Formel:

OD = 0,002

ZZ + 0,1057





Versuch 1

5000

47650

38150

-19,94

0,201

0,182

-9,45

11

Versuch 2

5000

70150

54650

-22,10

0,246

0,215

-12,60

14

Versuch 3

4000

162150

95150

-41,32

0,43

0,296

-31,16

13

Mittelwert:

4667

95111

63729

-32,99

0,292

0,231

-20,98

38

87 HG-28


Formel:

OD = 0,002

ZZ + 0,1057





Versuch 1

5000

47650

33650

-29,38

0,201

0,173

-13,93

12

Versuch 2

15000

88150

83150

-5,67

0,282

0,272

-3,55

14

Versuch 3

5000

81650

75650

-7,35

0,269

0,257

-4,46

12

Versuch 4

6000

113650

121650

7,04

0,333

0,349

4,80

14

Mittelwert:

7750

84169

80362

-4,52

0,271

0,26275

-3,13

52

88 HG-14


Formel:

OD = 0,002

ZZ + 0,1057





Versuch 1

5000

97650

93150

-4,61

0,301

0,292

-2,99

12

Versuch 2

5000

104150

100150

-3,84

0,314

0,306

-2,55

14

Versuch 3

5000

84150

116650

38,62

0,274

0,339

23,72

14

Versuch 4

5000

66150

50650

-23,43

0,238

0,207

-13,03

7

Mittelwert:

5000

90873

95905

5,54

0,282

0,286

1,51

47

TE 671


Formel:

OD = 0,0016

ZZ + 0,1119





Versuch 1

5000

256313

160063

-37,55

0,522

0,368

-29,50

12

Versuch 2

4000

231313

191938

-17,02

0,482

0,419

-13,07

14

Versuch 3

3000

246313

223188

-9,39

0,506

0,469

-7,31

14

Mittelwert:

4000

244646

191730

-21,32

0,503

0,419

-16,82

40

Mel/JuSo


Formel:

OD = 0,002

ZZ + 0,1057





Versuch 1

5000

110650

106650

-3,62

0,327

0,319

-2,45

12

Versuch 2

5000

140150

146650

4,64

0,386

0,399

3,37

14

Versuch 3

4000

127150

104650

-17,70

0,36

0,315

-12,50

14

Mittelwert:

4667

126750

119950

-5,36

0,358

0,344

-3,73

40





Erklärung zu Tabelle VIII:


Die im BCA Protein-Assay gemessenen OD nach 8 Tagen mit und ohne RA wurden nach unter 1.4.5. ermittelten Geradengleichungen in Zellzahlen umgerechnet.


AusgangsZZ: Mit einer Neubauer-Zählkammer ermittelte pro Vertiefung ausgesäte Zellzahl am ersten Versuchstag


ZZKontrolle: Die nach 1.4.5. aus der im BCA Protein-Assay gemessenen OD errechnete Zellzahl am 8. Versuchstag ohne RA-Zusatz im Medium


ZZ 10 µMRA: Die nach 1.4.5. aus der im BCA Protein-Assay gemessenen OD errechnete Zellzahl am 8. Versuchstag mit 10 µM/l RA-Zusatz im Medium


%(K-RA) / K: (ZZKontrolle - ZZ 10 µMRA) / ZZKontrolle in Prozent der Kontrolle


oder: (OD Kontrolle - OD 10 µMRA) / OD Kontrolle in Prozent der Kontrolle


OD Kontrolle: Die im BCA Protein-Assay gemessene optische Dichte am 8. Versuchstag von Zellen ohne RA im Medium


OD 10 µM/l RA: Die im BCA Protein-Assay gemessene optische Dichte am 8. Versuchstag von Zellen in Medium mit Zusatz von 10 µM/l RA


n: Zahl der Beobachtungen




Tabelle IX













RA - Verhältniszahl


OD CD44 pro µg Protein


OD CD44 pro 1000 Zellen












Zellinie

Kontrolle

10 µM/l RA

%

Kontrolle

10 µM/l RA

%

Kontrolle

10 µM/l RA

%

SK-N-SH

1,018

1,411

42,2

3,90E-04

5,11E-04

31,2

0,00256

0,00336

34,8

87 HG-31

1,281

1,649

31,3

4,04E-04

8,79E-04

134,3

0,00374

0,00740

109,6

85 HG-63

1,497

2,086

35,0

2,97E-04

4,82E-04

58,3

0,00556

0,01183

81,4

86 HG-39

1,657

1,979

19,1

4,53E-04

6,77E-04

46,2

0,00731

0,01219

50,9

85 HG-66/T6

1,373

1,423

2,9

3,50E-04

4,31E-04

20,3

0,00500

0,00601

20,4

88 HG-14

1,460

1,471

0,9

4,02E-04

4,06E-04

0,0

0,00454

0,00451

-0,6

87 HG-28

2,295

2,250

-2,6

5,71E-04

6,00E-04

4,0

0,00870

0,00937

4,3

TE671

0,893

0,862

-4,6

1,86E-04

1,98E-04

5,1

0,00183

0,00188

1,4

Mel/JuSo

1,196

1,137

-4,3

3,12E-04

3,11E-04

-0,4

0,00344

0,00324

-4,6


Tabelle X











OD CD44



Korrigierte OD CD44









Zellinie

Kontrolle

10 µM/l RA

%

Kontrolle

10 µM/l RA

%

SK-N-SH

0,230

0,342

52,9

0,487

0,708

49,4

87 HG-31

0,425

0,329

-23,6

0,983

0,906

-8,1

85 HG-63

0,527

0,511

-1,8

1,239

1,377

10,4

86 HG-39

0,424

0,412

-3,2

1,216

1,308

5,9

85 HG-66/T6

0,347

0,311

-13,1

0,861

0,821

-7,7

88 HG-14

0,434

0,460

7,7

1,022

1,072

5,9

87 HG-28

0,581

0,516

-11,4

1,458

1,337

-8,5

TE671

0,445

0,353

-21,2

1,650

1,367

-17,8

Mel/JuSo

0,433

0,390

-10,5

0,972

0,883

-9,5



Erklärung zu den Tabellen IX und X:


Zunahme oder Abnahme der im CD44 Mikro-ELISA ermittelten Extinktionswerte unter Einfluß von 10 µM/l RA nach 8 Tagen in % der Kontrolle auf die Ergebnisse des BCA Protein-Assay bezogen. Alle Ergebnisse sind Mittelwerte aus drei Experimenten.


RA-Verhältniszahl: Abb. 20; OD/OD


Die optische Dichte des CD44 Mikro-ELISA wurde direkt durch die OD im BCA Protein-Assay derselben Vertiefung dividiert.


OD CD44 pro µg Protein: Abb. 20; OD/µg


Wie „RA-Verhältniszahl“, wobei die OD der Proteinbestimmung anhand des Albumin Standarts nach Herstellerangaben in den Proteingehalt umgerechnet wurde.


OD CD44 pro 1000 Zellen: Abb.20; OD/Zelle


Wie „RA-Verhältniszahl“. Die OD des BCA Proetein-Assay wurde in die Zellzahl umgerechnet wie unter 1.4.5. beschrieben


OD CD44: Abb. 21; OD


Die im CD44 Mikro-ELISA experimentell ermittelten optischen Dichten mit Angabe der Zu- oder Abnahme in % der Kontrolle


Korrigierte OD CD44: Abb. 21; +/-% Korr.


Genannte „OD CD44“ durch den unter 2.5.2. beschriebenen Korrekturfaktor korrigiert