H. ANHANG
Tabelle I: Vergleich der Kontrollen (ohne RA mit 1. Antikörper) mit den Leerwerten (ohne RA ohne 1. Antikörper) in allen Experimenten für die Neuroblastomzellinie SK-N-SH, die Medulloblastomzellinie TE671 und die Melanomzellinie Mel/JuSo. Die OD wurden im CD44 Mikro-ELISA ermittelt. In der Spalte Unterschied ist angegeben um wieviel mal höher die OD der Kontrollen gegenüber den OD der Leerwerte sind. Inkubationszeit: 8 Tage
Zellinie |
SK-N-SH |
TE671 |
Mel/JuSo |
Leerwert |
0,055 |
0,239 |
0,184 |
OD Kontrolle |
0,200 |
0,445 |
0,433 |
Unterschied |
3,67 |
1,86 |
2,35 |
[Leerwert * n] |
|
|
|
Tabelle II: Siehe Tabelle I. Es wurden die Gliomzellinien untersucht.
Zellinie |
87 HG-31 |
86 HG-39 |
85 HG-63 |
87 HG-14 |
85 HG-66/T6 |
87 HG-28 |
Leerwert |
0,115 |
0,119 |
0,146 |
0,114 |
0,099 |
0,109 |
OD Kontrolle |
0,353 |
0,356 |
0,503 |
0,434 |
0,353 |
0,501 |
Unterschied |
3,07 |
2,99 |
3,45 |
3,81 |
3,57 |
4,60 |
Tabelle III: Veränderung der Zellzahl unter Einfluß von 1% Alkohol als OD-Werte des BCA Protein-Assay. Es wurden die Mittwerte aus n Vertiefungen gebildet. Differenz, absolut gibt die Differenz zwischen Kontrolle und den Zellen, die in 1% Alkohol wuchsen, wieder. Veränderung in % ist zuletztgenannter Wert als Prozentwert von der Kontrolle. Die Messungen wurden im gleichen Experimentansatz wie die Untersuchung der CD44-Expression gemacht. Kulturdauer: 8 Tage. Die Zellen der Kontrolle wuchsen in reinem Medium.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Zellinie |
SK-N-SH |
N31-87 |
N39-86 |
N63-85 |
N66T6 |
N14-88 |
N28-87 |
Mel-JuSo |
TE671 |
Gesamt |
n |
12 |
14 |
12 |
14 |
13 |
13 |
12 |
14 |
13 |
117 |
Kontrolle |
0,230 |
0,316 |
0,307 |
0,426 |
0,342 |
0,301 |
0,276 |
0,365 |
0,480 |
0,341 |
1% Alkohol |
0,204 |
0,313 |
0,310 |
0,420 |
0,330 |
0,291 |
0,264 |
0,364 |
0,487 |
0,334 |
Differenz, absolut |
-0,026 |
-0,004 |
0,003 |
-0,006 |
-0,011 |
-0,011 |
-0,012 |
-0,001 |
0,007 |
-0,007 |
Veränderung in % |
-11,24 |
-1,15 |
0,95 |
-1,46 |
-3,36 |
-3,57 |
-4,35 |
-0,35 |
1,41 |
-1,95 |
Tabelle IV: Einfluß von 1% Alkohol auf die CD44-Expression, ermittelt aus den OD des CD44 Mikro-ELISA. Es wurden die Mittwerte aus n Vertiefungen gebildet. Differenz, absolut gibt die Differenz zwischen Kontrolle und den Zellen, die in 1% Alkohol wuchsen wieder. Veränderung in% ist zuletztgenannter Wert als Prozentwert von der Kontrolle. Die Messungen wurden im gleichen Experimentansatz wie die Untersuchung der CD44-Expression gemacht. Kulturdauer: 8 Tage. Die Zellen der Kontrolle wuchsen in reinem Medium
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Zellinie |
SK-N-SH |
N31-87 |
N39-86 |
N63-85 |
N66T6 |
N14-88 |
N28-87 |
Mel-JuSo |
TE671 |
Gesamt |
n |
12 |
14 |
12 |
14 |
13 |
13 |
12 |
14 |
14 |
118 |
Kontrolle |
0,307 |
0,519 |
0,389 |
0,600 |
0,406 |
0,463 |
0,576 |
0,493 |
0,524 |
0,479 |
1% Alkohol |
0,272 |
0,535 |
0,408 |
0,611 |
0,395 |
0,468 |
0,542 |
0,485 |
0,542 |
0,477 |
Differenz, absolut |
-0,035 |
0,016 |
0,019 |
0,011 |
-0,011 |
0,005 |
-0,034 |
-0,008 |
0,018 |
0,002 |
Veränderung in % |
-11,3 |
3,0 |
5,0 |
1,9 |
-2,6 |
1,1 |
-5,8 |
-1,7 |
3,6 |
0,42 |
Tabelle V: Alle OD-Werte aus dem CD44 Mikro-ELISA eines Versuches mit der Zellinie SK-N-SH nach 8 Tagen Inkubationszeit. Aus den Daten wurde eine Dosis-Wirkungskurve mit dem Korrelationskoeffizienten r = 0,81 bei 64 Beobachtungen (p =< 1E-15) errechenet, die unter 2.2.2. dargestellt ist.
|
|
|
|
|
|
RA [µM/l] |
0 |
0,01 |
0,1 |
1 |
10 |
|
|
|
|
|
|
Werte |
0,147 |
0,153 |
0,130 |
0,216 |
0,222 |
der |
0,124 |
0,137 |
0,183 |
0,240 |
0,257 |
optischen |
0,129 |
0,154 |
0,143 |
0,234 |
0,295 |
Dichte |
0,135 |
0,123 |
0,144 |
0,229 |
0,304 |
im |
0,151 |
0,159 |
0,163 |
0,242 |
0,288 |
CD44 |
0,135 |
0,156 |
0,122 |
0,260 |
0,262 |
Mikro-ELISA |
0,159 |
0,156 |
0,143 |
0,246 |
0,275 |
aus |
0,164 |
0,128 |
0,149 |
0,207 |
0,206 |
einem |
0,150 |
0,122 |
0,123 |
0,155 |
0,225 |
Versuch |
0,121 |
0,144 |
0,162 |
0,250 |
0,199 |
|
0,106 |
0,125 |
0,160 |
0,228 |
0,195 |
|
0,101 |
0,136 |
0,175 |
0,218 |
0,183 |
|
0,102 |
0,127 |
0,150 |
0,227 |
0,279 |
|
0,090 |
0,126 |
0,152 |
0,221 |
0,250 |
|
0,096 |
0,138 |
0,119 |
0,183 |
0,185 |
|
0,154 |
0,137 |
0,120 |
0,155 |
0,209 |
|
|
|
|
|
|
Mittelwert: |
0,129 |
0,139 |
0,146 |
0,219 |
0,240 |
Standartabw.: |
0,024 |
0,013 |
0,020 |
0,031 |
0,041 |
St. in % des MW |
18,79 |
9,51 |
13,46 |
14,15 |
17,27 |
Anstieg ggü.Null |
0,00 |
7,61 |
13,28 |
70,11 |
85,76 |
Tabelle VI: Der Einfluß von steigenden RA-Konzentrationen auf die CD44-Expression von Gliomzellen nach 8 Tagen als OD im CD44 Mikro-ELISA ohne Berücksichtigung der Zellzahl.
(n) gibt die Anzahl der Beobachtungen wieder, die bei der untersuchten RA-Konzentration pro Versuch gemacht wurde. Die optischen Dichten sind Mittelwerte aus drei Versuchen.
Zellinie |
Kontrolle |
0,01 µM/l RA |
0,1 µM/l RA |
1 µM/l RA |
10 µM/l RA |
(n) |
(11-14) |
(11-14) |
(11-14) |
(11-14) |
(11-14) |
85 HG-66/T6 |
0,361 |
0,381 |
0,334 |
0,32 |
0,317 |
86 HG-39 |
0,332 |
0,318 |
0,329 |
0,331 |
0,311 |
87 HG-31 |
0,435 |
0,418 |
0,405 |
0,346 |
0,329 |
87 HG-28 |
0,466 |
0,447 |
0,445 |
0,454 |
0,427 |
88 HG-14 |
0,434 |
0,419 |
0,404 |
0,439 |
0,46 |
85 HG-63 |
0,509 |
0,519 |
0,497 |
0,484 |
0,511 |
Tabelle VII: Der Einfluß von steigenden RA-Konzentrationen auf den Proteingehalt von Gliomzellen nach 8 Tagen als OD im BCA Protein-Assay ohne Berücksichtigung der Zellzahl. In µg/ml.
(n) gibt die Anzahl der Beobachtungen wieder, die bei der untersuchten RA-Konzentration pro Versuch gemacht wurde. Die optischen Dichten sind Mittelwerte aus drei Versuchen.
Zellinie |
Kontrolle |
0,01 µM/l RA |
0,1 µM/l RA |
1 µM/l RA |
10 µM/l RA |
(n) |
(11-14) |
(11-14) |
(11-14) |
(11-14) |
(11-14) |
85 HG-66/T6 |
1241 |
1307 |
1242 |
1053 |
824 |
86 HG-39 |
1013 |
998 |
781 |
763 |
643 |
87 HG-31 |
1302 |
1236 |
810 |
475 |
415 |
87 HG-28 |
1136 |
1090 |
1008 |
1080 |
1122 |
88 HG-14 |
1077 |
991 |
888 |
953 |
1030 |
85 HG-63 |
1648 |
1624 |
1361 |
1374 |
1172 |
Tabelle VIII:
Zellinie |
AusgangsZZ |
ZZ Kontrolle |
ZZ 10 µMRA |
% (K-RA) / K |
OD Kontrolle |
OD 10 µM/l RA |
% (K-RA) / K |
n |
SK-N-SH |
|
Formel: |
OD = 0,0017 |
ZZ + 0,0733 |
|
|
|
|
Versuch 1 |
20000 |
86294 |
99235 |
15,00 |
0,22 |
0,242 |
10,00 |
12 |
Versuch 2 |
15000 |
99235 |
111000 |
11,86 |
0,242 |
0,262 |
8,26 |
12 |
Versuch 3 |
15000 |
82175 |
93353 |
13,60 |
0,213 |
0,232 |
8,92 |
8 |
Mittelwert: |
16667 |
90117 |
102176 |
13,38 |
0,225 |
0,245 |
9,04 |
32 |
87 HG-31 |
|
Formel: |
OD = 0,002 |
ZZ + 0,1077 |
|
|
|
|
Versuch 1 |
5000 |
108650 |
56150 |
-48,32 |
0,325 |
0,22 |
-32,31 |
14 |
Versuch 2 |
4000 |
110150 |
35650 |
-67,64 |
0,328 |
0,179 |
-45,43 |
14 |
Versuch 3 |
4000 |
137650 |
42150 |
-69,38 |
0,383 |
0,192 |
-49,87 |
10 |
Mittelwert: |
4333 |
116834 |
44913 |
-61,56 |
0,345 |
0,197 |
-42,95 |
38 |
86 HG-39 |
|
Formel: |
OD = 0,0021 |
ZZ+ 0,1187 |
|
|
|
|
Versuch 1 |
4000 |
89190 |
65857 |
-26,16 |
0,306 |
0,257 |
-16,01 |
14 |
Versuch 2 |
5000 |
97762 |
66810 |
-31,66 |
0,324 |
0,259 |
-20,06 |
14 |
Versuch 3 |
5000 |
38238 |
20619 |
-46,08 |
0,199 |
0,162 |
-18,59 |
9 |
Mittelwert: |
4667 |
80040 |
55214 |
-31,02 |
0,276 |
0,226 |
-18,21 |
37 |
85 HG-63 |
|
Formel: |
OD = 0,0024 |
ZZ + 0,1168 |
|
|
|
|
Versuch 1 |
4000 |
98417 |
71750 |
-27,10 |
0,353 |
0,289 |
-18,13 |
14 |
Versuch 2 |
5000 |
163000 |
110917 |
-31,95 |
0,508 |
0,383 |
-24,61 |
14 |
Versuch 3 |
5000 |
65917 |
23833 |
-63,84 |
0,275 |
0,174 |
-36,73 |
14 |
Mittelwert: |
4667 |
109111 |
68833 |
-36,91 |
0,379 |
0,282 |
-25,53 |
42 |
85HG-66T6 |
|
Formel: |
OD = 0,002 |
ZZ + 0,1057 |
|
|
|
|
Versuch 1 |
5000 |
47650 |
38150 |
-19,94 |
0,201 |
0,182 |
-9,45 |
11 |
Versuch 2 |
5000 |
70150 |
54650 |
-22,10 |
0,246 |
0,215 |
-12,60 |
14 |
Versuch 3 |
4000 |
162150 |
95150 |
-41,32 |
0,43 |
0,296 |
-31,16 |
13 |
Mittelwert: |
4667 |
95111 |
63729 |
-32,99 |
0,292 |
0,231 |
-20,98 |
38 |
87 HG-28 |
|
Formel: |
OD = 0,002 |
ZZ + 0,1057 |
|
|
|
|
Versuch 1 |
5000 |
47650 |
33650 |
-29,38 |
0,201 |
0,173 |
-13,93 |
12 |
Versuch 2 |
15000 |
88150 |
83150 |
-5,67 |
0,282 |
0,272 |
-3,55 |
14 |
Versuch 3 |
5000 |
81650 |
75650 |
-7,35 |
0,269 |
0,257 |
-4,46 |
12 |
Versuch 4 |
6000 |
113650 |
121650 |
7,04 |
0,333 |
0,349 |
4,80 |
14 |
Mittelwert: |
7750 |
84169 |
80362 |
-4,52 |
0,271 |
0,26275 |
-3,13 |
52 |
88 HG-14 |
|
Formel: |
OD = 0,002 |
ZZ + 0,1057 |
|
|
|
|
Versuch 1 |
5000 |
97650 |
93150 |
-4,61 |
0,301 |
0,292 |
-2,99 |
12 |
Versuch 2 |
5000 |
104150 |
100150 |
-3,84 |
0,314 |
0,306 |
-2,55 |
14 |
Versuch 3 |
5000 |
84150 |
116650 |
38,62 |
0,274 |
0,339 |
23,72 |
14 |
Versuch 4 |
5000 |
66150 |
50650 |
-23,43 |
0,238 |
0,207 |
-13,03 |
7 |
Mittelwert: |
5000 |
90873 |
95905 |
5,54 |
0,282 |
0,286 |
1,51 |
47 |
TE 671 |
|
Formel: |
OD = 0,0016 |
ZZ + 0,1119 |
|
|
|
|
Versuch 1 |
5000 |
256313 |
160063 |
-37,55 |
0,522 |
0,368 |
-29,50 |
12 |
Versuch 2 |
4000 |
231313 |
191938 |
-17,02 |
0,482 |
0,419 |
-13,07 |
14 |
Versuch 3 |
3000 |
246313 |
223188 |
-9,39 |
0,506 |
0,469 |
-7,31 |
14 |
Mittelwert: |
4000 |
244646 |
191730 |
-21,32 |
0,503 |
0,419 |
-16,82 |
40 |
Mel/JuSo |
|
Formel: |
OD = 0,002 |
ZZ + 0,1057 |
|
|
|
|
Versuch 1 |
5000 |
110650 |
106650 |
-3,62 |
0,327 |
0,319 |
-2,45 |
12 |
Versuch 2 |
5000 |
140150 |
146650 |
4,64 |
0,386 |
0,399 |
3,37 |
14 |
Versuch 3 |
4000 |
127150 |
104650 |
-17,70 |
0,36 |
0,315 |
-12,50 |
14 |
Mittelwert: |
4667 |
126750 |
119950 |
-5,36 |
0,358 |
0,344 |
-3,73 |
40 |
Erklärung zu Tabelle VIII:
Die im BCA Protein-Assay gemessenen OD nach 8 Tagen mit und ohne RA wurden nach unter 1.4.5. ermittelten Geradengleichungen in Zellzahlen umgerechnet.
AusgangsZZ: Mit einer Neubauer-Zählkammer ermittelte pro Vertiefung ausgesäte Zellzahl am ersten Versuchstag
ZZKontrolle: Die nach 1.4.5. aus der im BCA Protein-Assay gemessenen OD errechnete Zellzahl am 8. Versuchstag ohne RA-Zusatz im Medium
ZZ 10 µMRA: Die nach 1.4.5. aus der im BCA Protein-Assay gemessenen OD errechnete Zellzahl am 8. Versuchstag mit 10 µM/l RA-Zusatz im Medium
%(K-RA) / K: (ZZKontrolle - ZZ 10 µMRA) / ZZKontrolle in Prozent der Kontrolle
oder: (OD Kontrolle - OD 10 µMRA) / OD Kontrolle in Prozent der Kontrolle
OD Kontrolle: Die im BCA Protein-Assay gemessene optische Dichte am 8. Versuchstag von Zellen ohne RA im Medium
OD 10 µM/l RA: Die im BCA Protein-Assay gemessene optische Dichte am 8. Versuchstag von Zellen in Medium mit Zusatz von 10 µM/l RA
n: Zahl der Beobachtungen
Tabelle IX
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
RA - Verhältniszahl |
|
OD CD44 pro µg Protein |
|
OD CD44 pro 1000 Zellen |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Zellinie |
Kontrolle |
10 µM/l RA |
% |
Kontrolle |
10 µM/l RA |
% |
Kontrolle |
10 µM/l RA |
% |
SK-N-SH |
1,018 |
1,411 |
42,2 |
3,90E-04 |
5,11E-04 |
31,2 |
0,00256 |
0,00336 |
34,8 |
87 HG-31 |
1,281 |
1,649 |
31,3 |
4,04E-04 |
8,79E-04 |
134,3 |
0,00374 |
0,00740 |
109,6 |
85 HG-63 |
1,497 |
2,086 |
35,0 |
2,97E-04 |
4,82E-04 |
58,3 |
0,00556 |
0,01183 |
81,4 |
86 HG-39 |
1,657 |
1,979 |
19,1 |
4,53E-04 |
6,77E-04 |
46,2 |
0,00731 |
0,01219 |
50,9 |
85 HG-66/T6 |
1,373 |
1,423 |
2,9 |
3,50E-04 |
4,31E-04 |
20,3 |
0,00500 |
0,00601 |
20,4 |
88 HG-14 |
1,460 |
1,471 |
0,9 |
4,02E-04 |
4,06E-04 |
0,0 |
0,00454 |
0,00451 |
-0,6 |
87 HG-28 |
2,295 |
2,250 |
-2,6 |
5,71E-04 |
6,00E-04 |
4,0 |
0,00870 |
0,00937 |
4,3 |
TE671 |
0,893 |
0,862 |
-4,6 |
1,86E-04 |
1,98E-04 |
5,1 |
0,00183 |
0,00188 |
1,4 |
Mel/JuSo |
1,196 |
1,137 |
-4,3 |
3,12E-04 |
3,11E-04 |
-0,4 |
0,00344 |
0,00324 |
-4,6 |
Tabelle X
|
|
|
|
|
|
|
|
OD CD44 |
|
|
Korrigierte OD CD44 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Zellinie |
Kontrolle |
10 µM/l RA |
% |
Kontrolle |
10 µM/l RA |
% |
SK-N-SH |
0,230 |
0,342 |
52,9 |
0,487 |
0,708 |
49,4 |
87 HG-31 |
0,425 |
0,329 |
-23,6 |
0,983 |
0,906 |
-8,1 |
85 HG-63 |
0,527 |
0,511 |
-1,8 |
1,239 |
1,377 |
10,4 |
86 HG-39 |
0,424 |
0,412 |
-3,2 |
1,216 |
1,308 |
5,9 |
85 HG-66/T6 |
0,347 |
0,311 |
-13,1 |
0,861 |
0,821 |
-7,7 |
88 HG-14 |
0,434 |
0,460 |
7,7 |
1,022 |
1,072 |
5,9 |
87 HG-28 |
0,581 |
0,516 |
-11,4 |
1,458 |
1,337 |
-8,5 |
TE671 |
0,445 |
0,353 |
-21,2 |
1,650 |
1,367 |
-17,8 |
Mel/JuSo |
0,433 |
0,390 |
-10,5 |
0,972 |
0,883 |
-9,5 |
Erklärung zu den Tabellen IX und X:
Zunahme oder Abnahme der im CD44 Mikro-ELISA ermittelten Extinktionswerte unter Einfluß von 10 µM/l RA nach 8 Tagen in % der Kontrolle auf die Ergebnisse des BCA Protein-Assay bezogen. Alle Ergebnisse sind Mittelwerte aus drei Experimenten.
RA-Verhältniszahl: Abb. 20; OD/OD
Die optische Dichte des CD44 Mikro-ELISA wurde direkt durch die OD im BCA Protein-Assay derselben Vertiefung dividiert.
OD CD44 pro µg Protein: Abb. 20; OD/µg
Wie RA-Verhältniszahl, wobei die OD der Proteinbestimmung anhand des Albumin Standarts nach Herstellerangaben in den Proteingehalt umgerechnet wurde.
OD CD44 pro 1000 Zellen: Abb.20; OD/Zelle
Wie RA-Verhältniszahl. Die OD des BCA Proetein-Assay wurde in die Zellzahl umgerechnet wie unter 1.4.5. beschrieben
OD CD44: Abb. 21; OD
Die im CD44 Mikro-ELISA experimentell ermittelten optischen Dichten mit Angabe der Zu- oder Abnahme in % der Kontrolle
Korrigierte OD CD44: Abb. 21; +/-% Korr.
Genannte OD CD44 durch den unter 2.5.2. beschriebenen Korrekturfaktor korrigiert