III. Experimenteller Teil


III. Experimenteller Teil

1. Material und Geräte

Restriktionsenzyme, DNA- und Protein-Größenmarker wurden von der Firma Pharmacia bezogen. Für andere DNA- und RNA-modifizierende Enzyme ist die jeweilige Bezugsquelle angegeben. Feinchemikalien stammten von den Firmen Boehringer Mannheim, Merck, Sigma, Serva und Fluka. Die Geräte wurden bei den angegeben Herstellern erworben.

 

1.2 Zusammensetzung von Medien, Standardlösungen und Puffern

Medien
 
LB-Medium 1% (w/v) Bacto Trypton (Difco), 0.5 % (w/v) Hefeextrakt (Difco), 1.0 % NaCl, pH 7.2
LB-Agar LB-Medium, 1.5 % (w/v) Bacto-Agar (Difco)
LB-Top-Agar LB-Medium, 0.7 % (w/v) Agarose
NZY Broth Medium 0.5 % (w/v) NaCl, 0.2 % (w/v) MgSO4*7H2O, 0.5 % (w/v) Hefeextrakt, 1 % (w/v) NZ Amine, pH 7.5
Zellkulturmedien  
Dulbecco Minimum Eagle Medium (Gibco BRL), 8 % Basal-Medium-Supplement (BMS, Seromed) 
L15 Leibovitz Medium (Gibco BRL), 20 mM HEPES (Seromed)
 

Standardlösungen und Puffer
 
Denaturierungslösung 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH
Depurinationslösung 0.25 N HCl
50x Denhardt's 1 % (w/v) BSA, 1 % (w/v) Ficoll® 400, 1 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon
10xDNA-Ligasepuffer 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 10 mM Dithioerythit, 10 mM ATP, pH 7.5
Guanidin-HCl 7.8 M Guanidin-HCl, 2.5 mM Natriumcitrat, 10 mM DTT, pH 7.0
Guanidinthiocyanat 4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, 1.8 M N-Lauryl Sarcosine, pH 7.0, 8 % (w/v) Mercaptoethanol
Hank's Lösung 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.4 mMgSO4*7H2O, 0.5 mM MgCl2*6H2O, 0.35 mM Na2HPO4*2H2O, 0.44 mM KH2PO4 , 2 mM HEPES (Seromed), pH 7.4
2x HeBS 0.28 M NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4, 42 mM HEPES (Seromed), 2 % Glukose, pH 7.05
H2O/DEPC H2O, 0.1 % (v/v) Diethylpyrocarbonat
Luciferinlösung   25 mM Gly-Gly, pH 7.8, 10 mM DTT, 2.0 mM Firefly- Luciferase 
 
Luciferinassaypuffer 25 mM Gly-Gly, pH 7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 15 mM K-PO4-Puffer
Lysierungspuffer (K-PO4) 9.8 mM K2HPO4, 0.92 mM KH2PO4, pH 7.8, 0.2 % Triton X-100, 1 mM DTT
Neutralisierungslösung 1.0 M Tris, 2.0 M NaCl, pH 5.0
PBS-Puffer 4 mM KH2PO4, 6 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl
1x PCR-Puffer 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, pH 9.0 
Prehybridisierungslösung 5x SSPE, 5x Denhardt's, 50 % Formamid, 1.0 % (v/v) SDS, 100 ug/ml tRNA
6x Probenpuffer (DNA/RNA) 50 % Glycerol, 1 mM EDTA, 0.4 % Bromphenolblau, 0.4 % Xylencyanol
Qiagenpuffer  
Puffer P1 100 ug/ml RNase A, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mMEDTA
Puffer P2 20 mM NaOH, 1 % SDS
Puffer P3 3.0 mM Kaliumacetat, pH 5.5
Puffer QBT 750 mM NaCl, 50 mM MOPS, 15 % Ethanol, pH 7.0, 0.15 % Triton X-100
Puffer QC 1.0 M NaCl, 50 mM MOPS, 15 % Ethanol, pH 7.0
Puffer QF 1.25 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 15 % Ethanol, pH 8.5
Run-Off-Lösungen  
Aufschlußpuffer A 40 % Glycerin, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, pH 7.4, 0.01 % PMSF/AEBSF
Aufschlußpuffer B 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2.1 M Saccharose, 0.01 % PMSF/AEBSF
Glycerin-Storage-Puffer 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 40 % Glycerin, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA
Prehybridisierungslösung 50 % TES Puffer, 50 % TES/NaCl Puffer, 100 ug/ml tRNA
TES-Puffer 10 mM TES, 10 mM EDTA, 0.2 % SDS
TES/NaCl-Puffer 10 mM TES, 10 mM EDTA, 0.2 % SDS, 0.6 M NaCl
2x Reaktionspuffer/Hybridisierungslösung 10 mM Tris, pH 8, 5 mM MgCl2, 0.3 M Kcl, 10 mM dNT's (ohne UTP), 5 mM DTT, 10 mM Kreatinphosphat, 0.4 mg/ml Kreatinkinase, 150 U/ml RNasin, 125 uCi 32P-[dUTP]
HSB Puffer  0.5 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM Tris pH 7.4
SDS/Tris Puffer 5 % SDS, 0.5 M Tris, pH 7.4, 0.125 M EDTA
DNase Puffer 20 mM HEPES (Seromed), 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 
Elutionspuffer 1 % SDS, 10 mM Tris, pH 7.5, 5 mM EDTA
10x RNA-Laufpuffer 200 mM MOPS, 50 mM Natriumacetat, 5 mM EDTA, pH 7.0
Probenpuffer  2 % SDS, 62.5 mM Tris-HCl,10 % Glycerol, 5 % Mercaptoethanol, 0.01 % Bromphenolblau, pH 6.8
Sequenzgellösung 8 M Harnstoff (BRL), 6.0 % (w/v) Acrylamid, 0.3 % (w/v) Bisacrylamid in 1x TBE, 0.1 % (w/v) TEMED, 0.04 % (w/v) APS
SM-Puffer 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4*4H2O, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.01 % (w/v) Gelatine 
20x SSPE 3.6 M NaCl, 200 mM Natriumphosphat, 0.02 M EDTA, pH 7.7
20x SSC 3.0 M NaCl, 0.3 M Natriumcitrat, pH 7.0
1x TBE 89 mM Tris-HCl, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8.3
1x TE 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4
SDS-PAGE-Gelpuffer / Western-Blot  
Anodenpuffer I 30 mM Tris, 20 % Methanol
Anodenpuffer II 300 mM Tris, 20 % Methanol
Blockierungspuffer 5 % (w/v) Milchpulver in 1x PBS
Kathodenpuffer 25 mM Tris, 40 mM Aminocapronsäure, 20 % Methanol
1x Laufpuffer 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0.1 % SDS
Probenpuffer 2 % SDS, 62.5 mM Tris-HCl, 10 % Glycerol, 5 % Mercaptoethanol, 0.01 % Bromphenolblau, pH 6.8
1x Sammelgelpuffer 125 mM Tris-HCl, 0.1 % SDS, pH 6.8
1x Trenngelpuffer 375 mM Tris-HCl, 0.1 % SDS, pH 8.8
Waschpuffer 1.0 % Tween 20 in 1x PBS
 
 

2. Präparation und Kultur primärer Hepatozyten

Die Isolierung und Kultivierung der Hepatozyten erfolgte nach der Methode von Süßmuth et al. (1984). Die Auslösung der Zellen aus dem Zellverband erfolgte hierbei durch Collagenaseperfusion. Die Zellen wurden in einer Dichte von 1.1x106 ausplattiert. In den ersten 3 Stunden der Kultivierung wurden Dexamethason und Insulin (Insulin Zn-Komplex) dem serumhaltigen Dulbecco Minimum Eagle Kulturmedium zugegeben. Nach 24 Stunden wurde ein weiterer Mediumwechsel durchgeführt, wobei die Zellen in serumfreien Medium kultiviert wurden. Für die transienten Transfektionen nach der Calcium-Phosphat-Methode wurden die Zellen 48 Stunden lang in Kulturmedium mit Serum BMS (Seromed) inkubiert.

 

3. Konfokale Laser-Mikroskopie

Die konfokale Laser-Mikroskopie der primären Hepatocyten mit dem mitochondrialen Floureszenzmarker Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) erfolgte nach einer Methode von Goossens et al. (1996). Prinzip dieser Methode ist die Möglichkeit zur Quantifizierung und Messung der angereicherten mitochondrialen, reaktiven Sauerstoff-Zwischenstufen (ROI = reactive oxygen intermediates) in permanenten bzw. primären Zellkulturen mit Hilfe eines konfokalen Laser-Scanning Mikroskopes (CLSM= confocal laser scanning microscopy; LEICA Fluoreszenzmikroskop DM IRBE uns LEICA Laser TCSNT).

Durchführung: die 24 Stunden alten primären Hepatozyten, ausplattiert auf 2 cm2-Schalen (Greiner) mit einer Zelldichte von 1x105, wurden entsprechend den Versuchsbedingungen stimuliert. 30 min vor Beendigung der Inkubationszeit wurde der Fluoreszenzmarker DHR 123 in einer Endkonzentration von 1 uM zu den Zellen gegeben und bei 37deg.C in einem Begasungsschrank (Heraeus) bei 95 % Luft und 5 % CO2 inkubiert. Die Anreicherung der ROI's konnte im Anschluß an eine Anregung des Präparates bei 488 nm und schließlich bei einer Wellenlänge zwischen 515 bis 565 nm detektiert werden.
 
 

4. Run-Off Transkriptionsmessungen

Prinzip: die Run-Off Transkriptionsmessung ist eine Methodik zur Untersuchung der Transkriptionsaktivität in isolierten Zellkernen (aus primären Hepatozyten). Die erhaltenen Transkripte können anschließend daraufhin überprüft werden, ob sie gegen ein isoliertes DNA-Fragment hybridisieren oder nicht. Da bei derartigen Versuchen weder der Transkriptionsstartpunkt noch der Terminationspunkt bekannt sind oder bekannt sein müssen, liefert die Technik nur Aufschlüsse darüber, ob der analysierte DNA-Bereich überhaupt transkriptionsaktiv ist.

Durchführung: für die Durchführung eines Run-Off Transkriptionsversuches wurden zunächst Zellkernextrakte aus primären Hepatozyten gewonnen und die entsprechenden DNA-Fragmente durch eine Nukleinsäure-Kapillar-Technik auf einer Trägermembran fixiert.
Nach der Zellkernpräparation wurden die Run-Off Transkriptionsversuche nach Ausubel et al. (Current Protocols) durchgeführt.

 

4.1 Zellkernextrakte

Prinzip ist die Gewinnung von Zellkernen aus permanenten oder primären Kulturen nach Palmiter et al. (19981) für weiterführende Versuche wie zum Beispiel Run-Off Assays oder EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays).

Durchführung: die Hepatozyten wurden mit 30 mL Aufschlußpuffer A (mit Triton X-100) geerntet und in Kälte mit sechs Hüben bei 1200-1500 rpm im Potter-Elvehjem Homogenisator homogenisiert. Anschließend wurden die Präparate 15 min bei -4deg.C in einer Sorvall Zentrifuge RC 5B (Du Pont Instruments) bei 4124 g pelletiert. Nach zweimaligem Waschen der Pellets mit Aufschlußpuffer A ohne Triton X-100 (Zentrifugation wie gehabt), wurden die Pellets sukzessiv in 30 mL Puffer B resuspendiert und in einem 40 mL Douncer (Braun Melsungen) gleichmäßig durch zweimaliges Auf- und Abführen des Pistills homogenisiert. Die Proben wurden anschließend in einer Ultrazentrifuge Centrikon T-1160 (Kontron Instruments) in einem RP30 Rotor bei 30000 rpm und 4deg.C für 120 min zentrifugiert. Die Kerne wurden in 1 mL Glycerin-Storage-Puffer resuspendiert. Die optische Dichte von 10 uL Zellkernextrakt wurde bei 260 nm in 1 % SDS detektiert. Die Präparate wurden bei -70deg.C gelagert oder direkt für den Run-Off Transkriptionsansatz eingesetzt.

 

4.2 Nukleinsäure-Kapillar-Transfer

Prinzip: bei dieser Methode werden im Untersuchungsmaterial befindliche Moleküle, wie zum Beispiel Nukleinsäuren, mit Hilfe einer Schlitzlochplatte (slot blot) als Maske auf eine Nitrozellulose- oder Nylon-Trägermembran aufgetragen. Dieses Verfahren ist weniger aufwendig als eine Elektrophorese. Der DNA Kapillar-Transfer wird angewendet, um den qualitativen Nachweis bestimmter Moleküle in unterschiedlichen Untersuchungsproben zu detektieren.

Durchführung: die Nitrozellulose Membran BA 85SB (Schleicher & Schuell) wurde zuerst in H2O/DEPC und anschließend in 1 M Ammoniumacetat-Lösung eingeweicht. Die benötigten Nukleinsäuren, ca. 2.5 ug, wurden in 0.1 N NaOH in einem Endvolumen von 50 uL 5 min bei 95deg.C denaturiert und auf Eis abgekühlt. 50 uL einer 2 M Ammoniumacetat-Lösung wurde dazugegeben, kurz anzentrifugiert und auf die Schlitzlochplatte Minifold II SRC072/0 eines Mehrfach-Filtrationsgerätes für Mikroproben (Schleicher & Schuell) aufgetragen. Nach dem Transfer wurden die Nukleinsäuren in einem UV Stratalinker® (Stratagene) auf der Membran fixiert und 2 Stunden in Prehydridisierungslösung prehybridisiert.
 
 

5. Methoden zur RNA-Analysierung

Molekularbiologische Standardmethoden, wie zum Beispiel RNA-Gelelektrophorese und Ethanol-Präzipitationen, wurden nach Maniatis et al. (1982) durchgeführt.

 

5.1 RNA-Isolierung nach der Guanidinthiocyanat-Methode

Prinzip dieser Methode ist die Gewinnung von Gesamt-RNA aus Zellen mittels einer Guanidinthiocyanat-Lösung (8 % Mercaptoethanol), die lysierend auf den Zellrasen wirkt. In den folgenden Waschschritten mit jeweils unterschiedlichen Volumenanteilen einer Guanidin-HCl-Lösung werden Zellproteine und DNA ausgefällt. Die endgültige Isolierung der Gesamt-RNA erfolgt mit einer H2O/DEPC-Extraktion. Der Nachteil dieser Methode ist ein hoher zeitlicher und präparativer Aufwand.

Durchführung: die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 3 mL Guanidinthiocyanat-Lösung auf eine 63 cm2-Schale gegeben, die Zellen geerntet und unter mechanischem Rühren mit 0.075 mL 1 M Essigsäure und 2.250 mL absolutem Ethanol versetzt und über Nacht bei -20deg.C gefällt. In den folgenden zwei Tagen wurden die Präparate jeweils mit 1.5 mL Guanidin-HCl, 0.038 mL Essigsäure, 0.75 mL Ethanol und 0.75 mL Guanidin-HCl, 0.019 mL Essigsäure und 0.375 mL Ethanol über Nacht bei -20deg.C präzipitiert. Zentrifugation der Proben erfolgte bei 7093 g, 10 min bei -10deg.C in einer Sorvall RC-5B Zentrifuge (Du Pont Instruments). Nach der letzten Fällung wurden die Pellets bei Raumtemperatur getrocknet und zweimal mit 0.3 mL H2O/DEPC 10 min bei 58deg.C extrahiert. Zentrifugation erfolgte bei 14470 g und 10deg.C in der oben genannten Zentrifuge. Von der resuspendierten Gesamt-RNA wurden optische Dichte und Reinheit in einem Photometer (Pharmacia LKB Ultrospec III) bei 260/280 nm gemessen.
 
 

5.2 RNA-Isolierung nach RNA CLEAN

Prinzip dieser Methode ist die schnelle, molekularbiologische Isolierung von Gesamt-RNA aus primären oder permanenten Zellen mit einem hohen Reinheitsgrad. Durch Zugabe des RNA-CLEAN Isolations-Solvent (AGS) werden die Zellen lysiert und gleichzeitig RNasen inaktiviert. Das Zellysat wird durch Ausschütteln mit Chloroform von DNA und Proteinen getrennt und anschließend mit 2-Propanol gefällt.

Durchführung: die Zellen auf der Zellkulturschale (10 cm2) wurden zweimal mit PBS gespült, dann mit 0.5 mL RNA-CLEAN Solvent versetzt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber geerntet und mit 0.05 mL Chloroform 15 sec unter mechanischem Rühren geschüttelt, 5 min auf Eis inkubiert und anschließend bei 4deg.C in einer Eppendorf Tischzentrifuge (Eppendorf 5402) bei 15800 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde dekantiert und mit derselben Menge 2-Propanol entweder über Nacht oder 30 min bei 4 deg.C gefällt. Zentrifugation der präzipitierten RNA und der Waschschritt mit 70 % Ethanol erfolgte in einer Eppendorf Kühlzentrifuge (siehe oben) bei 15800 g für 50 min. Die Pellets wurden bei Raumtemperatur getrocknet und in H2O/DEPC resuspendiert. Ausbeute und Reinheitsgrad der Gesamt-RNA wurden in einem Pharmacia Photometer (Pharmacia LKB Ultrospec III) bei 260/280 nm detektiert.

 

5.3 Northern-Transfer von RNA und Hybridisierung

Prinzip: bei dem Northern-Blot wird die RNA zunächst elektrophoretisch über ein formaldehydhaltiges Agarosegel aufgetrennt und anschließend auf eine Trägermembran (Nylon oder Nitrozellulose) transferiert. Die Hybridisierung der RNA mit einer markierten cDNA-Sonde erfolgt dann auf dieser Membran.

Durchführung: 10 ug Gesamt-RNA (in 50 % deionisiertem Formamid, 5.9 % Formaldehyd, 1x RNA Laufpuffer und 2 uL 6x Probenpuffer) wurden 15 min bei 65deg.C denaturiert. Anschließend wurden die Proben in einem denaturierenden Agarosegel bestehend aus 1 % Agarose, 5.9 % Formaldehyd in 1x Laufpuffer bei konstant 120 V in einer Pharmacia GNA 200 Apparatur aufgetrennt. Der Transfer auf die QIABRANE Nylonmembran (Qiagen) erfolgte mit einer Pharmacia Vacublot® Apparatur mit 20x SSC bei 40 mbar für 1.5 Stunden. Nach dem Transfer wurde die RNA im UV Stratalinker® (Stratagene) auf der Membran fixiert. Die Membran wurde in 2x SSC gespült und 2 Stunden in Prehybridisierungslösung prehybridisiert. Anschließend wurde die markierte cDNA-Sonde hinzugegeben und über Nacht bei 42deg.C hybridisiert. Die hybridisierte Membran wurde zweimal für 30 min bei Raumtemperatur mit 2x SSC, 0.5 % SDS gewaschen. Falls nötig, wurden stringentere Bedingungen gewählt, wie 1x SSC, 0.1 % SDS bei 65deg.C. Im Anschluß wurde die Membran ein bis vier Tage lang bei -70deg.C auf einem Röntgenfilm (Fuji X-Ray 100) exponiert.

 

5.4 Radioaktive Markierung von cDNA-Sonden

Prinzip der Markierung von cDNA Sonden ist der Einbau radioaktiver Nukleotide in doppelsträngige DNA-Fragmente. Die zu markierende DNA wird zunächst durch Aufkochen denaturiert und mit Hexadesoxyribonukleotiden zufälliger Sequenz gemischt, die dem Klenow-Fragment der E.coli Polymerase I als Starter für die DNA Synthese dienen. In Anwesenheit eines radioaktiven Nukleotides, wie z.B. [a-32P] dCTP entsteht markierte DNA.

Durchführung: für sämtliche Markierungen wurde der Oligolabeling Kit (Pharmacia) verwendet. Nach Vorschrift des Herstellers wurden 25-50 ng DNA mit 25-50 uCi [a-32P] dCTP markiert.

 

6. Methoden zur DNA-Analysierung und Präparation

Die molekularbiologischen Standardmethoden, wie DNA-Elektrophorese, DNA-Restriktionsverdau und Ethanol-Fällung wurden nach Maniatis et al. (1982) durchgeführt.

 

6.1 Plasmidpräparation

Prinzip dieser Methode ist die Reinigung von Plasmiden aus transformierten Bakterien an geeigneten Säulenmaterialien. Nach alkalischer Lysierung und RNase A-Behandlung wird durch Qiagen Säulen, die ein spezielles Anionenaustauscherharz enthalten, die Trennung von RNA, chromosomaler Bakterien-DNA und Plasmiden ermöglicht.

Durchführung: eine entsprechende Bakterieneinzelkolonie wurde zunächst in 10 mL antibiotikahaltigem (25 ug/mL Tetrazyklin und 50 ug/mL Ampicillin) LB-Medium bis zur Sättigung angezogen. Die Mini-Kultur wurde in 100 mL (für eine Midi-) oder in 250-500 mL (für eine Maxi-Kultur) Amp/Tet-LB-Medium überführt und über Nacht bei 37deg.C im Luftinkubator angezogen. Die Bakteriensuspension wurde 10 min bei 6000 g pelletiert und in 10 mL Puffer P1 resuspendiert. Nach Zugabe von 10 mL Puffer P2 wurde 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, 10 mL Puffer P3 zugegeben, 15 min auf Eis inkubiert und 30 min bei 30000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine mit Puffer QBT äquilibrierte Säule gegeben. Nach Waschen mit 60 mL QC Puffer wurde mit 15 mL QF Puffer eluiert und die DNA mit 0.7 Volumenanteilen 2-Propanol gefällt.
 
 

6.2 DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode mit [a-35S] dATP

Die Kettenabbruchmethode nach Sanger basiert im wesentlichen auf der enzymatischen Kopierung des zu sequenzierenden DNA-Stranges mit einer DNA-Polymerase. Hierbei wird von einem Primer aus der Gegenstrang zu einzelsträngiger DNA synthetisiert. In vier getrennten Ansätzen befindet sich zusätzlich zu den vier Nukleotiden jeweils eines der vier ddNTP's (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Durch einen zufälligen Einbau dieser ddNTP's an den jeweiligen Positionen der Sequenz bricht die DNA Synthese ab und es entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge. Durch Auftrennung dieser radioaktiv markierten Reaktionsprodukte in einem denaturierenden Polyacrylamidgel wird die DNA Basensequenz bestimmt. Die Sequenzierung doppelsträngiger Plasmid DNA erfolgt nach vorheriger Alkalidenaturierung.

Durchführung: sämtliche Sequenzierungen waren Doppelstrangsequenzierungen und wurden mit dem Sequenase 2.0 Kit (USB) durchgeführt.
 
(i) Alkalidenaturierung doppelsträngiger Template: 
5 ug des Plasmides wurden 5 min bei Raumtemperatur in 0.2 M NaOH denaturiert, anschließend mit Ethanol 20 min bei -20deg.C oder wahlweise über Nacht bei -20deg.C gefällt. Nach Zentrifugieren und Waschen wurde die DNA in 7 uL H2O aufgenommen.
(ii) Sequenzierung: 
Die Sequenzierung wurde nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt (USB).
(iii)  Gelelektrophorese: 
Die Sequenzreaktionen wurden in einem 5 %igen denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Elektrophorese wurde in 1x TBE bei konstant 50 W durchgeführt. Nach dem Lauf wurde das Gel auf Whatman 3M-Papier transferiert, getrocknet in einem Slab Dryer 483 (Bio-Rad) und über Nacht auf einem Röntgenfilm (Fuji RX-100) exponiert.
 
 

6.3 Gelelektrophoretische Trennung von DNA- und PCR-Produkten sowie der genomischen DNA, Southern Transfer und Hybridisierung

Prinzip ist die gelelektrophoretische Trennung von DNA Fragmenten oder PCR Produkten in einer horizontalen Gelelektrophoreseapparatur Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad).

Durchführung: die zu analysierende DNA wurde nach Zugabe von 1/4 Volumenprozent 6x DNA Probenpuffer in 0.7 bis 1.5 %igen Agarosegelen, die 0.25 ug/mL Ethidiumbromid enthielten, aufgetrennt. Die Elektrophorese erfolgte bei konstant 10 V/cm in 0.5x TBE.
Anschließend zu isolierende DNA, wie z.B. PCR Produkte oder andere DNA Fragmente, erfolgte nach Vorschrift des Herstellers mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
Bei der gelelektrophoretischen Trennung von genomischer DNA (Probenvorbereitung wie oben) in einer Pharmacia GNA 200 Apparatur, wurde das Präparat zuvor mit entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten. Mindestens 1 ug der geschnittenen DNA wurde auf ein 0.7 %iges Agarosegel aufgetragen und anschließend auf eine Trägermembran (Nylon) transferiert. Die Hybridisierung der genomischen DNA mit einer markierten DNA-Sonde erfolgte dann auf dieser Membran. Der Transfer auf die QIABRANE Nylonmembran (Qiagen) erfolgte mit einer Vacublot Apparatur (Pharmacia) bei konstant 40 mbar.
 
(i) Depurination: 
das Gel wurde für 7 min mit der Depurinationslösung beschichtet. Nach Absaugen der Lösung erfolgte die Denaturierung.
(ii)  Denaturierung: 
des Gels für ebenfalls 7 min mit der Denaturierungslösung.
(iii) Neutralisation:  
wurde mit der Neutralisierungs-Lösung (für 7 min) durchgeführt.
(iiii)  Transfer:  
der anschließende Transfer erfolgte mit 20x SSC für 1.5 Stunden.
Im Anschluß wurde die DNA auf der Membran im UV Stratalinker (Stratagene) fixiert, mit 2x SSC gewaschen und 2 Stunden bei 42deg.C mit der Prehybridisierungslösung prehybridisiert (Hybridisierung siehe 5.3 und Markierung der Sonde 5.4).

 

7. PCR (Polymerase-Kettenreaktion) Methode

Prinzip der PCR ist die selektive und hocheffiziente Anreicherung in vitro amplifizierter DNA definierter Länge und Sequenz. In einem zyklischen Prozeß aus Denaturierung, Annealing und Elongation synthetisiert die thermostabile Taq DNA Polymerase in einem exponentiellen Reaktionsverlauf DNA Fragmente, die von spezifischen Oligonukleotidprimern flankiert sind (siehe Anhang I und Anhang II).

Durchführung: die 50 uL PCR Ansätze enthielten in 1x PCR Puffer: 200 nM Primer (je), 200 uM dNTP's (Mix aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 500 ng DNA Template und 2.5 U Taq Polymerase (Pharmacia). Die Ansätze wurden mit 50 uL Mineralöl überschichtet und im OmniGene Thermocycler (Hybaid) mit folgendem Temperaturprogramm ("Tube-control" Modus) inkubiert: 3 min bei 95deg.C, die entsprechende Annealingtemperatur der Primer für 30 sec, 1 min bei 72deg.C, 30 sec bei 94deg.C - 30 Zyklen.

 

7.1 PCR Screening von Bakterienkulturen

Prinzip: durch die PCR Amplifikation mit geeigneten Primern wird überprüft, ob ein Plasmidvektor das gewünschte Insert enthält. Als PCR Template kann direkt eine bakterielle Einzelkolonie eingesetzt werden.

Durchführung: eine Einzelkolonie wurde mit einer Impfschlinge in 25 uL 1x PCR Puffer überführt und 10 min bei 95deg.C denaturiert. Der PCR Ansatz wurde auf 50 uL aufgefüllt, siehe oben und die PCR im bereits angegebenen Programm gefahren.

 

7.2 A/T-Klonierung von PCR-Produkten

Prinzip: durch die Extendase Aktivität der Taq DNA Polymerase entsteht an den 3'Enden von PCR Amplifikaten ein überhängendes Nukleotid, ein dA. Hierdurch wird die Ligation in einen Vektor ermöglicht, der ein überhängendes dT besitzt, wie z.B der pT7 T-Vector (Novagen). Anschließend kann die Transformation in transformationskompetente E.coli Bakterien erfolgen.

Durchführung: für sämtliche PCR Klonierungen wurde der pT7 T-Vector Kit (Novagen) verwendet.
 
(i) Ligation: 
0.2 pmol des gereinigten PCR Produktes und 50 ng (0.03 pmol) des pT7 Vektors wurden in 1x DNase Puffer mit 1 U T4 DNA Ligase (Gibco BRL) über Nacht bei 14deg.C ligiert.
(ii)  Transformation:  
1 uL (ca.20 ng) des Ligationsansatzes wurden zu 20 uL kompetenten NovaBlue (Novagen) Zellen gegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Nach 2 min Erhitzen auf 42deg.C und 2 min auf Eis wurden 80 uL SOC Medium (Novagen) zugegeben und 1 Stunde bei 37deg.C inkubiert. Nach Zugabe von 40 uL X-Gal (50 mg/mL) und 20 uL IPTG (23.8 mg/mL) wurde der Ansatz auf LB Agar Platten, die 50 ug/mL Ampicillin und 15 ug/mL Tetrazyklin enthielten, ausplattiert und über Nacht bei 37deg.C inkubiert. Weiße Kolonien wurden mittels PCR auf Anwesenheit des Inserts überprüft. 
 

8. Transiente Transfektion von primären Hepatozyten

8.1 Calcium-Phosphat Methode

Prinzip: die DNA wird in der Form von feinkörnigen Calciumphosphat-Präzipitaten auf die Zellen gebracht und von diesen durch Endozytose aufgenommen. Das Präzipitat wird erhalten durch Mischen einer DNA/Calciumchlorid-Lösung mit einer Lösung, die Phosphat-Ionen enthält (hier 2x HeBS Puffer). Durch eine kurzfristige Behandlung der Hepatozyten mit einer Glycerol-Lösung werden die Zellen für die Aufnahme von DNA-Molekülen empfänglich gemacht.
Bei Cotransfektionen werden gleichzeitig mehrere Gene in eine geeignete Wirtszelle eingeschleust. Bei einem dieser Gene handelt es sich um ein Reportergen, dessen Anwesenheit in der Zelle leicht nachgewiesen werden kann ([beta]-Galaktosidase/Cytomegalovirus (CMV) Promotor) und eine Aussage über die Transfektionseffizienz liefert.

Durchführung: erfolgte nach der Methode von Graunitz et al. (1996) 2.5 ug/10cm2 des Transfektionskonstruktes und 250 mM CaCl in einem Endvolumen von 0.5 mL, wurden tropfenweise, durch gleichzeitiges "Aufblubbern" der Lösung mit einer Pasteurpipette, in 0.5 mL 2x HeBS Puffer gegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Unter Schwenken wurden die DNA/Calciumphosphat-Präzipitate auf die primären Zellkulturen getropft und mindestens 5.5 bis 6 Stunden in einem Feuchtinkubator (Heraeus) mit 5% CO2 und 95% Luft inkubiert. Im Anschluß erfolgte für 2 min ein Glycerol-Schock und eine dreistündige Inkubation mit den entsprechenden Induktoren. Nach einem Mediumwechsel wurden die Hepatozyten über Nacht inkubiert und geerntet. Die Zellen wurden in 0.1 mL Lysispuffer (1 mM DTT) aufgenommen und 2 min in einer Eppendorf Tischzentrifuge 5402 (Eppendorf) bei 12000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Für die Luciferase-Messung wurde die Hälfte der Zellsuspension in 0.18 mL Luciferase-Bestimmungspuffer gegeben und in einem Luminometer Lumat LB9501 (Berthold) unter Injektion von 0.1 mL Luciferinlösung (Firefly Luciferase) gemessen.
Für die Bestimmung der Transfektionseffizienz wurde das [beta]-Galactosidaseplasmid PCH110 mit dem Galacto-Light Plustm Kit (Tropix) nach Angaben des Herstellers bestimmt.
Bei Verwendung des Luciferase-Reportergens Cytomegalovirus CMV (Renilla Luciferase) wurde ebenfalls nach Angaben des Herstellers Dual-Luciferasetm Reporter Kit (Promega) verfahren.
 
 

8.2 Liposomen Methode

Prinzip der Liposomen Methode ist die Bindung von negativ geladenen Nukleinsäuren an synthetisch hergestellte, positiv geladene Phospholipidvesikel definierter Größe. Dieser Komplex wird auf die Zellen gebracht und fusioniert mit der Zellmembran, so daß ihr Inhalt durch Endozytose in das Zellinnere gelangt.

Durchführung: die Liposomen-Methode wurde mit dem DOTAP Kit (Boehringer Mannheim) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Dabei wurden 3 ug/10cm2 des Transfektionsplasmides in einem Verhältnis von 1: 5 mit der Liposomensuspension in ein Endvolumen von 0.5 mL tropfenweise, durch gleichzeitiges "Aufblubbern" in 0.5 mL HEPES Puffer gegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die weitere Durchführung der Transfektion (Inkubationszeit der Kristalle, Induktion, Ernte und Messung) gleicht dem Protokoll der Calcium-Phosphat-Methode (8.1).
 
 

9. Durchmusterung einer [lambda]-Phagen-DNA-Bibliothek

Prinzip: die DNA-Bibliothek ist die Bezeichnung für eine Sammlung von willkürlich klonierten DNA-Fragmenten, die zusammengenommen das vollständige Genom eines Organismus repräsentieren. Sind die Klonierungsvektoren Bakteriophagen, so entspricht eine Genbank einer Phagenpopulation, in der jeder einzelne Phage ein eingebautes DNA-Fragment aus dem Genom des Organismus enthält. Vorteil der Verwendung derartiger Klonierungsvektoren liegt darin, daß eine derartige Kollektion durch Aufzucht der Phagen unbegrenzt vermehrt werden kann.

Durchführung: die Anzucht der Bakterienkulturen, die Phagentiterbestimmung und Anreicherung, sowie die Durchmusterungsansätze und Fixierung der Phagen-DNA auf Nitrozellulose erfolgte nach Angaben des Herstellers Lambda DASH® II Libary (Stratagene).
Die Markierung der DNA-Sonde erfolgte zum einem mit der "Oligolabeling"-Methode (siehe 5.4) oder mit dem DIG DNA Labeling and Detection Kit (Boehringer Mannheim).

 

9.1 Präparation von [lambda]-DNA

Prinzip der Präparation von [lambda]-DNA ist die Reinigung von genomischer DNA aus Bakterien an geeigneten Säulenmaterialien. Nach alkalischer Lysierung und RNase A-Behandlung wird durch Qiagen Säulen, die ein spezielles Anionenaustauscherharz enthalten, die Trennung von RNA und chromosomaler Bakterien-DNA ermöglicht.

Durchführung: 0.1 mL eines als "positiv" nachgewiesenen DNA-Phagen-Aliquots wurde mit 1 mL Bakteriensuspension 20 min bei 37deg.C inkubiert. Diese Suspension wurde anschließend in LB-Medium mit 10 mM MgSO4 (wahlweise 100, 250 oder 500 mL) gegeben und 5 bis 8 Stunden über Tag bis zur vollständigen Lysierung der Bakterien inkubiert. Die anschließende Präparation der DNA erfolgte mit einem Lambda DNA Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers. Für weitere Identifizierungsuntersuchungen wurden mit der genomischen DNA Southern-Transfer-Versuche (siehe 6.3) bzw. DNA-Sequenzierungen (siehe 6.2) durchgeführt.
 
 

10. Proteinchemische Methoden

10.1 Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung nach Bradford basiert auf einer spezifischen Farbreaktion, bei der Coomassie Brilliantblau G250 verwendet wird. Dieser Farbstoff reagiert mit den Proteinen und bildet Komplexe, die ein Absorptionsmaximum bei 595 nm aufweisen, während der ungebundene Farbstoff ein Absorptionsmaximum bei 465 nm zeigt. Das Verfahren eignet sich am besten, um Proteinmengen im Bereich von 1-10 ug zu bestimmen.

Durchführung: die Proteinbestimmung erfolgte mit dem BioRad® Proteinassay. Als Standard diente Rinderserumalbumin.
Zur Bestimmung des Gesamt-Proteins wurden die Hepatozyten in 0.5 mL PBS aufgenommen. 1/100 der Zellsuspension wurde zu der Bestimmung in den Assay-Puffer gegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Proben in einem Photometer (Pharmacia LKB Ultrospec III) gemessen. Als Referenz zur Berechnung der [Delta]OD-Werte diente ein substratfreier Ansatz.

 

10.2 SDS-PAGE und Western Transfer

Prinzip: bei der SDS-PAGE Methode nach Lämmli werden Proteine unter denaturierenden Bedingungen aufgrund ihres unterschiedlichen Molekulargewichts elektrophoretisch getrennt. Anschließend kann im elektrischen Feld ein Transfer auf Trägermaterialien wie Nitrozellulose erfolgen.

Durchführung: die Auftrennung erfolgte in Trenngelen von 12 % Acrylamid in 1x Trenngelpuffer. Die Sammelgelkonzentration betrug 3 % Acrylamid in 1x Sammelgelpuffer. Die Elektrophorese wurde in 1x Laufpuffer bei konstanter Spannung (100 V für Minigele, BioRad) durchgeführt. Vor dem Auftragen wurden die Proteine in Probenpuffer 10 min bei 95deg.C denaturiert. Anschließend wurden die Zelltrümmer 10 min in einer Eppendorf Tischzentrifuge 5415C bei 14000 rpm abzentrifugiert. Für analytische Gele wurden 5 ng Gesamt-Protein aufgetragen. Als Längenstandard wurde Low-Molekular-Weight Proteinmarker (LMW, Pharmacia) oder das rekombinant hergestellte Rat Heme Oxygenase Protein SPP730 (Biomol) benutzt. Das analytische Gel wurde nach dem Lauf 30 min bei Raumtemperatur in Kathodenpuffer äquilibriert. Der Transfer auf Nitrozellulose (45 um, Schleicher & Schuell) erfolgte in einer "semi-dry" Blotapparatur (Phase) über 50 min bei 0.8 mA/cm2 Gelfläche im diskontinuierlichem Puffersystem. Anschließend wurde die Nitrozellulosemembran 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem Blockpuffer unter Schütteln äquilibriert. Über Nacht wurde die Membran mit dem Antikörper Anti-Heme Oxygenase OSA150 (Biomol) bei 4deg.C inkubiert. Nach häufigem Waschpufferwechsel (1-1.5 Stunden) wurde der zweite Antikörper, Amersham NA934, Anti Rabbit Ig (Amersham), für die folgende Protein-Detektion mit dem ECL-Detektion Kit (Amersham) hinzugegeben. Die Anwendung des ECL-Detektion Kit erfolgte nach Vorschrift des Herstellers.

 

11. ATP-Messung

Prinzip der Methode ist die Messung des Gesamt-APT-Gehaltes einer Zellsuspension. In diesem Fall wurde die Zellsuspension von primären Hepatozyten verwendet. Als interne Kontrolle dient ein entsprechender ATP-Standard.

Durchführung: die primären Hepatozyten, je nach Versuchsbedingungen stimuliert, wurden dreimal mit PBS gewaschen und anschließend in 1 mL PBS aufgenommen. Die Messung des Gesamt-ATP-Gehaltes erfolgte mit 50 uL der Zellsuspension mit dem ATP Assay Kit (Sigma) nach Angaben des Herstellers in einem Luminometer Lumat LB9501 (Berthold).

 

12. Computersoftware zur Protein- und DNA-Analyse

Zur Protein- und DNA-Analyse wurde das Computerprogramm GeneWorks® (IntelliGenetics, Version 2.45) verwendet. Für sämtliche Analysen wurden die vorgegebenen Standardparameter benutzt.

 

13. Statistik

Bei den Ergebnissen des Northern Transfers, der transienten Transfektionen und der konfokalen Laser Mikroskopie sind jeweils die Mittelwerte aus mehreren Experimenten angegeben (+/- Standardabweichung der Mittelwerte (SEM)).