Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, am Beispiel der Leber die bisher unverstandene Regulation der HO-1 unter oxidativen Situationen sowie die Schilddrüsenhormonwirkung auf der Ebene des HO-1-Promotors näher zu charakterisieren. Für die Untersuchungen wurde das in vivo-nahe primäre Hepatozytenkultursystem gewählt, zudem wurden gängige moderne molekularbiologische Methoden (z.B. Northern und Western Transfer Analysen, Run-Off Transkriptionsmessungen und transiente Transfektionen) angewandt. Zur Kontrolle dienten Befunde aus den permanenten Leberzellinien Hep3B und HepG2. Die Messung der Sauerstoffradikalbildung erfolgte mit der konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie (confocal laser scanning microscopy; CLSM).
Durch die eingesetzten Induktoren (den Schwermetallverbindungen
Cadmium- und Kobaltchlorid, dem eigenen Substrat Häm sowie t-Butylhydrochinon)
konnte eine Stimulierung der HO-1-Expression auf der mRNA- und der Proteinebene
in primären Hepatozyten verifiziert werden. Ferner konnte demonstriert
werden, daß die unterschiedlichen Induktoren der HO-1 in primären
Hepatozytenkulturen oxidativen Streß durch die Bildung reaktiver
Sauerstoffzwischenstufen (reactive oxygen intermediates; ROIs) erzeugen.
Durch Untersuchungen auf Promotorebene des HO-1-Enzyms konnten für
die Induktoren unterschiedliche Angriffspunkte dargestellt werden: die
Konsequenz war jedoch stets die Stimulierung der HO-1 mRNA und die Synthese
des Proteins. Mit Hilfe der transienten Transfektionsexperimente in primären
Hepatozyten konnte für ein bereits sequenziertes 830 bp HO-1-Promotorfragment
eine Stimulierung der HO-1-Expression durch die Induktoren Häm, Cadmium-
und Kobaltchlorid sowie t-Butylhydrochinon dargestellt werden. Diese Ergebnisse
zeigen die Anwesenheit eines DNA-Bindungselementes, das als ein "oxidativer
Sensor" für die Aktivierung der HO-1-Genexpression und der damit verbundenen
Bildung des Antioxidanten Biliverdin wirkt.
Was die Stimulierung und Genexpression des Enzyms
durch T3 betrifft, ist festzustellen, daß sie gleichfalls in dem
830 bp langen HO-1-Promotorfragment erfolgt. In dem bisher sequenzierten
HO-1-Promotor der Ratte konnte jedoch überraschenderweise kein funktionelles
Schilddrüsenhormon-responsives Element (thyroidhormone-responsive
element, TRE) identifiziert werden.
Die gezeigten Ergebnisse machen erstmals deutlich,
daß unter Verwendung der in vivo-nahen primären Hepatozytenkulturen
die unterschiedlichen Induktoren der HO-1 (Cadmium- und Kobaltchlorid,
Häm und t-Butylhydrochinon) eine Veränderung des oxidativen Zustandes
(Anreicherung von ROIs) in diesen Zellen bewirken und erläutern einen
der zellulären Abwehrmechanismen auf die toxischen Metalle Cadmium
und Kobalt.
Darüberhinaus konnte erstmalig ein induzierender
Effekt der Induktoren auf die HO-1-Proteinsynthese dargestellt werden.
Durch Resultate einer spezifische Versuchsanordnung kann für die Induktoren
der HO-1 von unterschiedlichen Wirkungsmechanismen ausgegangen werden,
die als Konsequenz immer eine Aktivierung der HO-1-Expression bewirken.
Zum erstenmal konnte für den Induktor t-Butylhydrochinon während
einer HO-1-Stimulierung gleichzeitig die Aktivierung eines AP1 Transkriptionsfaktors
in Form eines c-Jun homodimeren Genproduktes verifiziert werden.
Mit transienten Transfektionsexperimenten konnte
der entscheidende regulatorische Bereich des HO-1-Promotors in Bezug auf
die Wirkung der oxidativen Induktoren und der Schilddrüsehormonwirkung
eindeutig eingegrenzt werden. Dieser regulatorische Bereich befindet sich
in einem bereits sequenzierten 830 bp HO-1-Promotorfragment. In dieser
Region kommt ein putatives DNA-Element in Frage, das eine Aktivierung der
HO-1-Expression durch oxidativen Streß bewirken könnte: das
Metall-responsive Element (metal-responsive Element; MRE). Dalton et al.
(1996) beschrieben eine Regulation des Metallothioneins-Gens durch t-Butylhydrochinon
über ein MRE. Diese Ergebnisse lassen die Vermutung zu, daß
das putative MRE in dem HO-1-Promotor bei einer Stimulierung durch t-Butylhydrochinon
und anderer oxidativer Streß-Induktoren (Häm, Cadmium- und Kobaltchlorid)
funktionsfähig ist.
Für die Aktivierung der HO-1 durch T3 ist
davon auszugehen, daß die vermittelte Regulation gleichfalls über
das genannte DNA-Bindungselement erfolgt. Da in den bisherigen Sequenzen
kein TRE identifiziert werden konnte, ist jedoch davon auszugehen, daß
die T3-vermittelte HO-1 mRNA-Expression über einen indirekten Mechanismus
aktiviert wird. Als Grundlage dieser Regulation wird die T3-vermittelte
Steigerung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauches postuliert, die gleichzeitig
mit einer Steigerung reaktiver Sauerstoffmetabolite verbunden ist.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse lassen sich
zukünftige regulatorische Studien des HO-1-Promotors deutlich eingrenzen
und die Verifizierung eines lang gesuchten "Sauerstoff-sensitiven Elementes"
in dem 830 bp Fragment zu ermöglichen. Dies wird dann dazu beitragen,
noch besser zu verstehen wie die Erhöhung der ROIs bei z.B. Entzündungen,
extremen körperlichen Anstrengungen, Vitaminmangelzuständen mit
einer Erhöhung der HO-1 Aktivität einhergeht.
The aim of this work was to analyse the regulation of the HO 1 in liver under oxidative stress situations and to characterise the action of thyroid hormone at the HO 1 promoter level. The investigations were carried out using primary hepatocyte culture and modern molecular biology methods (northern and western blotting, run-off transcription assays and transient transfection experiments), as well as measurement of reactive oxygen intermediates (ROIs) by confocal laser scanning microscopy (CLSM). Results from Hep3B and HepG2 permanent cell lines were taken as controls.
For induction of HO-1 mRNA and protein expression
in primary hepatocytes cadmiumchloride, cobaltchloride, t-butylhydroquinone
and its substrate heme were added to the cultures. These inductors were
found to increase the formation of ROIs (reactive oxygen intermediates)
in primary hepatocytes. Investigation at the HO-1 promoter level revealed,
that the above inductors operate through different activation mechanisms
but constitently stimulate mRNA and protein levels. The transient transfection
experiments demonstrated that a sequenced 830 bp HO-1 promoter fragment
is responsible for the inductor mediated stimulation of the HO-1 expression.
These results show the presence of a DNA-binding element, which acts as
an "oxygen-sensitive element" for the activation of HO-1 gene expression
and the resulting formation of the antioxidant biliverdin.
Studies of T3 action of the HO-1 expression (transient
transfection) have also shown, that the regulation of HO-1 by T3 has been
located in the same 830 bp promoter fragment. Surprisingly a thyroid-responsible
element (TRE) has not yet been identified in this sequenced rat HO-1 promoter
region.
The results have shown, that all used inductors
(cadmiumchloride, cobaltchloride, heme and t-butylhydroquinone) were found
to generate the ROI formation in the in vivo-like primary hepatocytes,
and therefore demonstrate the alteration of the oxidative status. It also
have shown one of the defence mechanisms against the toxic metals cadmium
and cobalt.
Furthermore it could be demonstrated for the
first time that the above inductors increase HO-1 protein level. The results
show, that the above inductors acts via different pathways to induce HO-1
expression. Moreover the studies have shown, that during HO-1 stimulation
the inductor t-butylhydroquinone simultaneously increases the c-Jun mRNA
level, to form a c-Jun homodimeric gene product (transcription factor AP1).
Till now, no AP1-sequence has been found in the sequenced rat HO-1 promoter
in contrast to the promoter in mice and human.
Furthermore the transient transfection assays
show, that the sequenced 830 bp of the HO-1 promoter includes a crucial
regulatory region for stimulating HO-1 by oxidative stress and by thyroid
hormone (T3) action. The putative binding metal-responsive element (MRE)
is a possible candidate for an "oxygen-sensitive element" in the HO-1 promoter
which is found in this region. It seems to be possible that the increase
of HO-1 by t-butylhydroquinone is mediated through MRE, as known from the
literature of the metallothionein gene (Dalton et al., 1997). These results
imply that the putative MRE on the HO-1 promoter is functioning, when stimulated
by the t-butylhydroquinone and other already mentioned inductors.
Activation of HO-1 through T3 is likely to proceed
by the same binding-element found in the 830 bp fragment of the sequenced
rat HO-1 promoter. This could be the result of increased reactive oxygen
intermediates (ROIs) production resulting from increased mitochondria oxygen
consumption mediated by T3.
On the basis of these results future regulatory
studies of the HO-1 promoter can be restricted: the verification of the
"oxygen-sensitive element" in the 830 bp fragment which is also responsible
for the indirect stimulation of HO-1 through T3.
In addition, the availability of other 5'-end
HO-1 promoter fragments would aid a more thorough characterisation of HO-1.
This would further contribute to the understanding of gene regulatory pathways
used in oxidative stress and inflammation, over-exertion and vitamin deficiency.