LB-Medium | 1% (w/v) Bacto Trypton (Difco), 0.5 % (w/v) Hefeextrakt (Difco), 1.0 % NaCl, pH 7.2 |
LB-Agar | LB-Medium, 1.5 % (w/v) Bacto-Agar (Difco) |
LB-Top-Agar | LB-Medium, 0.7 % (w/v) Agarose |
NZY Broth Medium | 0.5 % (w/v) NaCl, 0.2 % (w/v) MgSO4*7H2O, 0.5 % (w/v) Hefeextrakt, 1 % (w/v) NZ Amine, pH 7.5 |
Zellkulturmedien | |
Dulbecco Minimum Eagle Medium | (Gibco BRL), 8 % Basal-Medium-Supplement (BMS, Seromed) |
L15 Leibovitz Medium | (Gibco BRL), 20 mM HEPES (Seromed) |
Standardlösungen und Puffer
Denaturierungslösung | 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH |
Depurinationslösung | 0.25 N HCl |
50x Denhardt's | 1 % (w/v) BSA, 1 % (w/v) Ficoll® 400, 1 % (w/v) Polyvinylpyrrolidon |
10xDNA-Ligasepuffer | 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 10 mM Dithioerythit, 10 mM ATP, pH 7.5 |
Guanidin-HCl | 7.8 M Guanidin-HCl, 2.5 mM Natriumcitrat, 10 mM DTT, pH 7.0 |
Guanidinthiocyanat | 4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, 1.8 M N-Lauryl Sarcosine, pH 7.0, 8 % (w/v) Mercaptoethanol |
Hank's Lösung | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.4 mMgSO4*7H2O, 0.5 mM MgCl2*6H2O, 0.35 mM Na2HPO4*2H2O, 0.44 mM KH2PO4 , 2 mM HEPES (Seromed), pH 7.4 |
2x HeBS | 0.28 M NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4, 42 mM HEPES (Seromed), 2 % Glukose, pH 7.05 |
H2O/DEPC | H2O, 0.1 % (v/v) Diethylpyrocarbonat |
Luciferinlösung | 25 mM Gly-Gly, pH 7.8, 10 mM DTT, 2.0
mM Firefly- Luciferase
|
Luciferinassaypuffer | 25 mM Gly-Gly, pH 7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 15 mM K-PO4-Puffer |
Lysierungspuffer (K-PO4) | 9.8 mM K2HPO4, 0.92 mM KH2PO4, pH 7.8, 0.2 % Triton X-100, 1 mM DTT |
Neutralisierungslösung | 1.0 M Tris, 2.0 M NaCl, pH 5.0 |
PBS-Puffer | 4 mM KH2PO4, 6 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl |
1x PCR-Puffer | 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, pH 9.0 |
Prehybridisierungslösung | 5x SSPE, 5x Denhardt's, 50 % Formamid, 1.0 % (v/v) SDS, 100 ug/ml tRNA |
6x Probenpuffer (DNA/RNA) | 50 % Glycerol, 1 mM EDTA, 0.4 % Bromphenolblau, 0.4 % Xylencyanol |
Qiagenpuffer | |
Puffer P1 | 100 ug/ml RNase A, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mMEDTA |
Puffer P2 | 20 mM NaOH, 1 % SDS |
Puffer P3 | 3.0 mM Kaliumacetat, pH 5.5 |
Puffer QBT | 750 mM NaCl, 50 mM MOPS, 15 % Ethanol, pH 7.0, 0.15 % Triton X-100 |
Puffer QC | 1.0 M NaCl, 50 mM MOPS, 15 % Ethanol, pH 7.0 |
Puffer QF | 1.25 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 15 % Ethanol, pH 8.5 |
Run-Off-Lösungen | |
Aufschlußpuffer A | 40 % Glycerin, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, pH 7.4, 0.01 % PMSF/AEBSF |
Aufschlußpuffer B | 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 2.1 M Saccharose, 0.01 % PMSF/AEBSF |
Glycerin-Storage-Puffer | 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 40 % Glycerin, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA |
Prehybridisierungslösung | 50 % TES Puffer, 50 % TES/NaCl Puffer, 100 ug/ml tRNA |
TES-Puffer | 10 mM TES, 10 mM EDTA, 0.2 % SDS |
TES/NaCl-Puffer | 10 mM TES, 10 mM EDTA, 0.2 % SDS, 0.6 M NaCl |
2x Reaktionspuffer/Hybridisierungslösung | 10 mM Tris, pH 8, 5 mM MgCl2, 0.3 M Kcl, 10 mM dNT's (ohne UTP), 5 mM DTT, 10 mM Kreatinphosphat, 0.4 mg/ml Kreatinkinase, 150 U/ml RNasin, 125 uCi 32P-[dUTP] |
HSB Puffer | 0.5 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM Tris pH 7.4 |
SDS/Tris Puffer | 5 % SDS, 0.5 M Tris, pH 7.4, 0.125 M EDTA |
DNase Puffer | 20 mM HEPES (Seromed), 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 |
Elutionspuffer | 1 % SDS, 10 mM Tris, pH 7.5, 5 mM EDTA |
10x RNA-Laufpuffer | 200 mM MOPS, 50 mM Natriumacetat, 5 mM EDTA, pH 7.0 |
Probenpuffer | 2 % SDS, 62.5 mM Tris-HCl,10 % Glycerol, 5 % Mercaptoethanol, 0.01 % Bromphenolblau, pH 6.8 |
Sequenzgellösung | 8 M Harnstoff (BRL), 6.0 % (w/v) Acrylamid, 0.3 % (w/v) Bisacrylamid in 1x TBE, 0.1 % (w/v) TEMED, 0.04 % (w/v) APS |
SM-Puffer | 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4*4H2O, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.01 % (w/v) Gelatine |
20x SSPE | 3.6 M NaCl, 200 mM Natriumphosphat, 0.02 M EDTA, pH 7.7 |
20x SSC | 3.0 M NaCl, 0.3 M Natriumcitrat, pH 7.0 |
1x TBE | 89 mM Tris-HCl, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8.3 |
1x TE | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4 |
SDS-PAGE-Gelpuffer / Western-Blot | |
Anodenpuffer I | 30 mM Tris, 20 % Methanol |
Anodenpuffer II | 300 mM Tris, 20 % Methanol |
Blockierungspuffer | 5 % (w/v) Milchpulver in 1x PBS |
Kathodenpuffer | 25 mM Tris, 40 mM Aminocapronsäure, 20 % Methanol |
1x Laufpuffer | 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0.1 % SDS |
Probenpuffer | 2 % SDS, 62.5 mM Tris-HCl, 10 % Glycerol, 5 % Mercaptoethanol, 0.01 % Bromphenolblau, pH 6.8 |
1x Sammelgelpuffer | 125 mM Tris-HCl, 0.1 % SDS, pH 6.8 |
1x Trenngelpuffer | 375 mM Tris-HCl, 0.1 % SDS, pH 8.8 |
Waschpuffer | 1.0 % Tween 20 in 1x PBS |
Durchführung: die 24 Stunden alten primären
Hepatozyten, ausplattiert auf 2 cm2-Schalen (Greiner) mit einer
Zelldichte von 1x105, wurden entsprechend den Versuchsbedingungen
stimuliert. 30 min vor Beendigung der Inkubationszeit wurde der Fluoreszenzmarker
DHR 123 in einer Endkonzentration von 1 uM zu den Zellen gegeben und bei
37deg.C in einem Begasungsschrank (Heraeus) bei 95 % Luft und 5 % CO2
inkubiert. Die Anreicherung der ROI's konnte im Anschluß an eine
Anregung des Präparates bei 488 nm und schließlich bei einer
Wellenlänge zwischen 515 bis 565 nm detektiert werden.
Durchführung: für die Durchführung
eines Run-Off Transkriptionsversuches wurden zunächst Zellkernextrakte
aus primären Hepatozyten gewonnen und die entsprechenden DNA-Fragmente
durch eine Nukleinsäure-Kapillar-Technik auf einer Trägermembran
fixiert.
Nach der Zellkernpräparation wurden die
Run-Off Transkriptionsversuche nach Ausubel et al. (Current Protocols)
durchgeführt.
Durchführung: die Hepatozyten wurden mit 30 mL Aufschlußpuffer A (mit Triton X-100) geerntet und in Kälte mit sechs Hüben bei 1200-1500 rpm im Potter-Elvehjem Homogenisator homogenisiert. Anschließend wurden die Präparate 15 min bei -4deg.C in einer Sorvall Zentrifuge RC 5B (Du Pont Instruments) bei 4124 g pelletiert. Nach zweimaligem Waschen der Pellets mit Aufschlußpuffer A ohne Triton X-100 (Zentrifugation wie gehabt), wurden die Pellets sukzessiv in 30 mL Puffer B resuspendiert und in einem 40 mL Douncer (Braun Melsungen) gleichmäßig durch zweimaliges Auf- und Abführen des Pistills homogenisiert. Die Proben wurden anschließend in einer Ultrazentrifuge Centrikon T-1160 (Kontron Instruments) in einem RP30 Rotor bei 30000 rpm und 4deg.C für 120 min zentrifugiert. Die Kerne wurden in 1 mL Glycerin-Storage-Puffer resuspendiert. Die optische Dichte von 10 uL Zellkernextrakt wurde bei 260 nm in 1 % SDS detektiert. Die Präparate wurden bei -70deg.C gelagert oder direkt für den Run-Off Transkriptionsansatz eingesetzt.
Durchführung: die Nitrozellulose Membran
BA 85SB (Schleicher & Schuell) wurde zuerst in H2O/DEPC
und anschließend in 1 M Ammoniumacetat-Lösung eingeweicht. Die
benötigten Nukleinsäuren, ca. 2.5 ug, wurden in 0.1 N NaOH in
einem Endvolumen von 50 uL 5 min bei 95deg.C denaturiert und auf Eis abgekühlt.
50 uL einer 2 M Ammoniumacetat-Lösung wurde dazugegeben, kurz anzentrifugiert
und auf die Schlitzlochplatte Minifold II SRC072/0 eines Mehrfach-Filtrationsgerätes
für Mikroproben (Schleicher & Schuell) aufgetragen. Nach dem Transfer
wurden die Nukleinsäuren in einem UV Stratalinker®
(Stratagene) auf der Membran fixiert und 2 Stunden in Prehydridisierungslösung
prehybridisiert.
Durchführung: die Zellen wurden zweimal mit
PBS gewaschen. Anschließend wurden 3 mL Guanidinthiocyanat-Lösung
auf eine 63 cm2-Schale gegeben, die Zellen geerntet und unter
mechanischem Rühren mit 0.075 mL 1 M Essigsäure und 2.250 mL
absolutem Ethanol versetzt und über Nacht bei -20deg.C gefällt.
In den folgenden zwei Tagen wurden die Präparate jeweils mit 1.5 mL
Guanidin-HCl, 0.038 mL Essigsäure, 0.75 mL Ethanol und 0.75 mL Guanidin-HCl,
0.019 mL Essigsäure und 0.375 mL Ethanol über Nacht bei -20deg.C
präzipitiert. Zentrifugation der Proben erfolgte bei 7093 g, 10 min
bei -10deg.C in einer Sorvall RC-5B Zentrifuge (Du Pont Instruments). Nach
der letzten Fällung wurden die Pellets bei Raumtemperatur getrocknet
und zweimal mit 0.3 mL H2O/DEPC 10 min bei 58deg.C extrahiert.
Zentrifugation erfolgte bei 14470 g und 10deg.C in der oben genannten Zentrifuge.
Von der resuspendierten Gesamt-RNA wurden optische Dichte und Reinheit
in einem Photometer (Pharmacia LKB Ultrospec III) bei 260/280 nm gemessen.
Durchführung: die Zellen auf der Zellkulturschale (10 cm2) wurden zweimal mit PBS gespült, dann mit 0.5 mL RNA-CLEAN Solvent versetzt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber geerntet und mit 0.05 mL Chloroform 15 sec unter mechanischem Rühren geschüttelt, 5 min auf Eis inkubiert und anschließend bei 4deg.C in einer Eppendorf Tischzentrifuge (Eppendorf 5402) bei 15800 g zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde dekantiert und mit derselben Menge 2-Propanol entweder über Nacht oder 30 min bei 4 deg.C gefällt. Zentrifugation der präzipitierten RNA und der Waschschritt mit 70 % Ethanol erfolgte in einer Eppendorf Kühlzentrifuge (siehe oben) bei 15800 g für 50 min. Die Pellets wurden bei Raumtemperatur getrocknet und in H2O/DEPC resuspendiert. Ausbeute und Reinheitsgrad der Gesamt-RNA wurden in einem Pharmacia Photometer (Pharmacia LKB Ultrospec III) bei 260/280 nm detektiert.
Durchführung: 10 ug Gesamt-RNA (in 50 % deionisiertem Formamid, 5.9 % Formaldehyd, 1x RNA Laufpuffer und 2 uL 6x Probenpuffer) wurden 15 min bei 65deg.C denaturiert. Anschließend wurden die Proben in einem denaturierenden Agarosegel bestehend aus 1 % Agarose, 5.9 % Formaldehyd in 1x Laufpuffer bei konstant 120 V in einer Pharmacia GNA 200 Apparatur aufgetrennt. Der Transfer auf die QIABRANE Nylonmembran (Qiagen) erfolgte mit einer Pharmacia Vacublot® Apparatur mit 20x SSC bei 40 mbar für 1.5 Stunden. Nach dem Transfer wurde die RNA im UV Stratalinker® (Stratagene) auf der Membran fixiert. Die Membran wurde in 2x SSC gespült und 2 Stunden in Prehybridisierungslösung prehybridisiert. Anschließend wurde die markierte cDNA-Sonde hinzugegeben und über Nacht bei 42deg.C hybridisiert. Die hybridisierte Membran wurde zweimal für 30 min bei Raumtemperatur mit 2x SSC, 0.5 % SDS gewaschen. Falls nötig, wurden stringentere Bedingungen gewählt, wie 1x SSC, 0.1 % SDS bei 65deg.C. Im Anschluß wurde die Membran ein bis vier Tage lang bei -70deg.C auf einem Röntgenfilm (Fuji X-Ray 100) exponiert.
Durchführung: für sämtliche Markierungen wurde der Oligolabeling Kit (Pharmacia) verwendet. Nach Vorschrift des Herstellers wurden 25-50 ng DNA mit 25-50 uCi [a-32P] dCTP markiert.
Durchführung: eine entsprechende Bakterieneinzelkolonie
wurde zunächst in 10 mL antibiotikahaltigem (25 ug/mL Tetrazyklin
und 50 ug/mL Ampicillin) LB-Medium bis zur Sättigung angezogen.
Die Mini-Kultur wurde in 100 mL (für eine Midi-) oder in 250-500
mL (für eine Maxi-Kultur) Amp/Tet-LB-Medium überführt
und über Nacht bei 37deg.C im Luftinkubator angezogen. Die Bakteriensuspension
wurde 10 min bei 6000 g pelletiert und in 10 mL Puffer P1 resuspendiert.
Nach Zugabe von 10 mL Puffer P2 wurde 5 min bei Raumtemperatur inkubiert,
10 mL Puffer P3 zugegeben, 15 min auf Eis inkubiert und 30 min bei 30000
g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine mit Puffer QBT äquilibrierte
Säule gegeben. Nach Waschen mit 60 mL QC Puffer wurde mit 15 mL QF
Puffer eluiert und die DNA mit 0.7 Volumenanteilen 2-Propanol gefällt.
Durchführung: sämtliche Sequenzierungen
waren Doppelstrangsequenzierungen und wurden mit dem Sequenase 2.0 Kit
(USB) durchgeführt.
(i) | Alkalidenaturierung doppelsträngiger Template:
5 ug des Plasmides wurden 5 min bei Raumtemperatur in 0.2 M NaOH denaturiert, anschließend mit Ethanol 20 min bei -20deg.C oder wahlweise über Nacht bei -20deg.C gefällt. Nach Zentrifugieren und Waschen wurde die DNA in 7 uL H2O aufgenommen. |
(ii) | Sequenzierung:
Die Sequenzierung wurde nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt (USB). |
(iii) | Gelelektrophorese:
Die Sequenzreaktionen wurden in einem 5 %igen denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Elektrophorese wurde in 1x TBE bei konstant 50 W durchgeführt. Nach dem Lauf wurde das Gel auf Whatman 3M-Papier transferiert, getrocknet in einem Slab Dryer 483 (Bio-Rad) und über Nacht auf einem Röntgenfilm (Fuji RX-100) exponiert. |
Durchführung: die zu analysierende DNA wurde
nach Zugabe von 1/4 Volumenprozent 6x DNA Probenpuffer in 0.7 bis 1.5 %igen
Agarosegelen, die 0.25 ug/mL Ethidiumbromid enthielten, aufgetrennt. Die
Elektrophorese erfolgte bei konstant 10 V/cm in 0.5x TBE.
Anschließend zu isolierende DNA, wie z.B.
PCR Produkte oder andere DNA Fragmente, erfolgte nach Vorschrift des Herstellers
mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
Bei der gelelektrophoretischen Trennung von genomischer
DNA (Probenvorbereitung wie oben) in einer Pharmacia GNA 200 Apparatur,
wurde das Präparat zuvor mit entsprechenden Restriktionsenzymen geschnitten.
Mindestens 1 ug der geschnittenen DNA wurde auf ein 0.7 %iges Agarosegel
aufgetragen und anschließend auf eine Trägermembran (Nylon)
transferiert. Die Hybridisierung der genomischen DNA mit einer markierten
DNA-Sonde erfolgte dann auf dieser Membran. Der Transfer auf die QIABRANE
Nylonmembran (Qiagen) erfolgte mit einer Vacublot Apparatur (Pharmacia)
bei konstant 40 mbar.
(i) | Depurination:
das Gel wurde für 7 min mit der Depurinationslösung beschichtet. Nach Absaugen der Lösung erfolgte die Denaturierung. |
(ii) | Denaturierung:
des Gels für ebenfalls 7 min mit der Denaturierungslösung. |
(iii) | Neutralisation:
wurde mit der Neutralisierungs-Lösung (für 7 min) durchgeführt. |
(iiii) | Transfer:
der anschließende Transfer erfolgte mit 20x SSC für 1.5 Stunden. |
Durchführung: die 50 uL PCR Ansätze enthielten in 1x PCR Puffer: 200 nM Primer (je), 200 uM dNTP's (Mix aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 500 ng DNA Template und 2.5 U Taq Polymerase (Pharmacia). Die Ansätze wurden mit 50 uL Mineralöl überschichtet und im OmniGene Thermocycler (Hybaid) mit folgendem Temperaturprogramm ("Tube-control" Modus) inkubiert: 3 min bei 95deg.C, die entsprechende Annealingtemperatur der Primer für 30 sec, 1 min bei 72deg.C, 30 sec bei 94deg.C - 30 Zyklen.
Durchführung: eine Einzelkolonie wurde mit einer Impfschlinge in 25 uL 1x PCR Puffer überführt und 10 min bei 95deg.C denaturiert. Der PCR Ansatz wurde auf 50 uL aufgefüllt, siehe oben und die PCR im bereits angegebenen Programm gefahren.
Durchführung: für sämtliche PCR
Klonierungen wurde der pT7 T-Vector Kit (Novagen) verwendet.
(i) | Ligation:
0.2 pmol des gereinigten PCR Produktes und 50 ng (0.03 pmol) des pT7 Vektors wurden in 1x DNase Puffer mit 1 U T4 DNA Ligase (Gibco BRL) über Nacht bei 14deg.C ligiert. |
(ii) | Transformation:
1 uL (ca.20 ng) des Ligationsansatzes wurden zu 20 uL kompetenten NovaBlue (Novagen) Zellen gegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Nach 2 min Erhitzen auf 42deg.C und 2 min auf Eis wurden 80 uL SOC Medium (Novagen) zugegeben und 1 Stunde bei 37deg.C inkubiert. Nach Zugabe von 40 uL X-Gal (50 mg/mL) und 20 uL IPTG (23.8 mg/mL) wurde der Ansatz auf LB Agar Platten, die 50 ug/mL Ampicillin und 15 ug/mL Tetrazyklin enthielten, ausplattiert und über Nacht bei 37deg.C inkubiert. Weiße Kolonien wurden mittels PCR auf Anwesenheit des Inserts überprüft. |
Durchführung: erfolgte nach der Methode von
Graunitz et al. (1996) 2.5 ug/10cm2 des Transfektionskonstruktes
und 250 mM CaCl in einem Endvolumen von 0.5 mL, wurden tropfenweise, durch
gleichzeitiges "Aufblubbern" der Lösung mit einer Pasteurpipette,
in 0.5 mL 2x HeBS Puffer gegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Unter Schwenken wurden die DNA/Calciumphosphat-Präzipitate auf die
primären Zellkulturen getropft und mindestens 5.5 bis 6 Stunden in
einem Feuchtinkubator (Heraeus) mit 5% CO2 und 95% Luft inkubiert.
Im Anschluß erfolgte für 2 min ein Glycerol-Schock und eine
dreistündige Inkubation mit den entsprechenden Induktoren. Nach einem
Mediumwechsel wurden die Hepatozyten über Nacht inkubiert und geerntet.
Die Zellen wurden in 0.1 mL Lysispuffer (1 mM DTT) aufgenommen und 2 min
in einer Eppendorf Tischzentrifuge 5402 (Eppendorf) bei 12000 rpm zentrifugiert.
Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
Für die Luciferase-Messung wurde die Hälfte der Zellsuspension
in 0.18 mL Luciferase-Bestimmungspuffer gegeben und in einem Luminometer
Lumat LB9501 (Berthold) unter Injektion von 0.1 mL Luciferinlösung
(Firefly Luciferase) gemessen.
Für die Bestimmung der Transfektionseffizienz
wurde das [beta]-Galactosidaseplasmid PCH110 mit dem Galacto-Light Plustm
Kit (Tropix) nach Angaben des Herstellers bestimmt.
Bei Verwendung des Luciferase-Reportergens Cytomegalovirus
CMV (Renilla Luciferase) wurde ebenfalls nach Angaben des Herstellers Dual-Luciferasetm
Reporter Kit (Promega) verfahren.
Durchführung: die Liposomen-Methode wurde
mit dem DOTAP Kit (Boehringer Mannheim) nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
Dabei wurden 3 ug/10cm2 des Transfektionsplasmides in einem
Verhältnis von 1: 5 mit der Liposomensuspension in ein Endvolumen
von 0.5 mL tropfenweise, durch gleichzeitiges "Aufblubbern" in 0.5 mL HEPES
Puffer gegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die weitere Durchführung
der Transfektion (Inkubationszeit der Kristalle, Induktion, Ernte und Messung)
gleicht dem Protokoll der Calcium-Phosphat-Methode (8.1).
Durchführung: die Anzucht der Bakterienkulturen,
die Phagentiterbestimmung und Anreicherung, sowie die Durchmusterungsansätze
und Fixierung der Phagen-DNA auf Nitrozellulose erfolgte nach Angaben des
Herstellers Lambda DASH® II Libary (Stratagene).
Die Markierung der DNA-Sonde erfolgte zum einem
mit der "Oligolabeling"-Methode (siehe 5.4) oder mit dem DIG DNA Labeling
and Detection Kit (Boehringer Mannheim).
Durchführung: 0.1 mL eines als "positiv"
nachgewiesenen DNA-Phagen-Aliquots wurde mit 1 mL Bakteriensuspension 20
min bei 37deg.C inkubiert. Diese Suspension wurde anschließend in
LB-Medium mit 10 mM MgSO4 (wahlweise 100, 250 oder 500 mL) gegeben
und 5 bis 8 Stunden über Tag bis zur vollständigen Lysierung
der Bakterien inkubiert. Die anschließende Präparation der DNA
erfolgte mit einem Lambda DNA Kit (Qiagen) nach Angaben des Herstellers.
Für weitere Identifizierungsuntersuchungen wurden mit der genomischen
DNA Southern-Transfer-Versuche (siehe 6.3) bzw. DNA-Sequenzierungen (siehe
6.2) durchgeführt.
Durchführung: die Proteinbestimmung erfolgte
mit dem BioRad® Proteinassay. Als Standard diente Rinderserumalbumin.
Zur Bestimmung des Gesamt-Proteins wurden die
Hepatozyten in 0.5 mL PBS aufgenommen. 1/100 der Zellsuspension wurde zu
der Bestimmung in den Assay-Puffer gegeben und 30 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wurden die Proben in einem Photometer (Pharmacia
LKB Ultrospec III) gemessen. Als Referenz zur Berechnung der [Delta]OD-Werte
diente ein substratfreier Ansatz.
Durchführung: die Auftrennung erfolgte in Trenngelen von 12 % Acrylamid in 1x Trenngelpuffer. Die Sammelgelkonzentration betrug 3 % Acrylamid in 1x Sammelgelpuffer. Die Elektrophorese wurde in 1x Laufpuffer bei konstanter Spannung (100 V für Minigele, BioRad) durchgeführt. Vor dem Auftragen wurden die Proteine in Probenpuffer 10 min bei 95deg.C denaturiert. Anschließend wurden die Zelltrümmer 10 min in einer Eppendorf Tischzentrifuge 5415C bei 14000 rpm abzentrifugiert. Für analytische Gele wurden 5 ng Gesamt-Protein aufgetragen. Als Längenstandard wurde Low-Molekular-Weight Proteinmarker (LMW, Pharmacia) oder das rekombinant hergestellte Rat Heme Oxygenase Protein SPP730 (Biomol) benutzt. Das analytische Gel wurde nach dem Lauf 30 min bei Raumtemperatur in Kathodenpuffer äquilibriert. Der Transfer auf Nitrozellulose (45 um, Schleicher & Schuell) erfolgte in einer "semi-dry" Blotapparatur (Phase) über 50 min bei 0.8 mA/cm2 Gelfläche im diskontinuierlichem Puffersystem. Anschließend wurde die Nitrozellulosemembran 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem Blockpuffer unter Schütteln äquilibriert. Über Nacht wurde die Membran mit dem Antikörper Anti-Heme Oxygenase OSA150 (Biomol) bei 4deg.C inkubiert. Nach häufigem Waschpufferwechsel (1-1.5 Stunden) wurde der zweite Antikörper, Amersham NA934, Anti Rabbit Ig (Amersham), für die folgende Protein-Detektion mit dem ECL-Detektion Kit (Amersham) hinzugegeben. Die Anwendung des ECL-Detektion Kit erfolgte nach Vorschrift des Herstellers.
Durchführung: die primären Hepatozyten, je nach Versuchsbedingungen stimuliert, wurden dreimal mit PBS gewaschen und anschließend in 1 mL PBS aufgenommen. Die Messung des Gesamt-ATP-Gehaltes erfolgte mit 50 uL der Zellsuspension mit dem ATP Assay Kit (Sigma) nach Angaben des Herstellers in einem Luminometer Lumat LB9501 (Berthold).