IV. Ergebnisse


IV. Ergebnisse

1. Induzierbarkeit der Hämoxygenase 1 in kultivierten Hepatozyten auf der RNA-Ebene

Die Induzierbarkeit der Hämoxygenase 1 durch anorganische Metalle und anderer zum Teil nicht verwandter, synthetischer Substanzen wurde von einigen Arbeitsgruppen in permanenten Zellinien gezeigt (Alam et al.,1989; Taketani et al.,1991 und Mitani et al.,1993).
Bei Untersuchungen am Gesamtorganismus läßt sich häufig nicht erkennen, ob der durch die Agentien ausgelöste Effekt tatsächlich eine Folge der Stimulierung ist, oder aber erst sekundär durch die Induktion anderer Signale zustande kommt. Hier können Experimente an isolierten Zellsystemen aussagekräftigere Daten liefern, da sich in isolierten Zellsystemen die Bedingungen optimaler einstellen lassen und dadurch ein konstanterer Status gewährleistet ist.
Zur Anwendung kommen hierbei entweder etablierte Zellinien transformierter Zellen, die teilungsfähig und permanent kultivierbar sind, oder primäre Zellkulturen, die direkt aus dem Gewebe präpariert werden und nur über einen begrenzten Zeitraum kultivierbar sind. Transformierte Zellen stimmen in ihren Eigenschaften weitgehend mit neoplastischen, also Tumorzellen überein. Da Tumorzellen gegenüber normalen Zellen häufig ein stark verändertes Expressionsmuster aufweisen, sind sie für Untersuchungen physiologischer Fragestellungen weniger geeignet als primäre Zellkulturen. Zur Untersuchung der Hämoxygenase 1 wurden deshalb primäre Hepatozytenkulturen verwendet.
 
 
 
 
Abb.12: Kultivierte primäre Hepatozyten der Ratte (24 Stunden alt) 
Die Zellen wurden in einer Dichte von 1.1x106 ausplatiert. Außer für die transienten Transfektionen wurden die Hepatozyten für die gesamten Versuche in Serum-freiem Medium kultiviert.
 
 

1.1 Analyse des Cadmiumchlorides als Induktor

In permanenten Zellinien (Hep3B und einer Hepatoma-Linie) wurde von Mitani et al. die Wirkung von anorganischen Metallen (Zinnchloride, Zinkchloride) auf die HO-1 ansatzweise untersucht. Ergebnisse der Hämoxygenase-Induktion in Primärkulturen lagen noch nicht vor.
Primäre Hepatozytenkulturen wurden 24 Stunden nach der Präparation für 0.5, 1.5, 3 und 6 Stunden mit 5 uM Cadmiumchlorid stimuliert. Als Kontrolle diente die RNA unbehandelter primärer Hepatozyten. Die Isolation der Gesamt-RNA und anschließende Northern Blot Analyse sowie die Detektion der HO-1 mRNA erfolgten wie im Experimentellen Teil beschrieben (Kapitel 5). Repräsentativ für alle weiteren Northern Transfer Analysen diente als interne RNA-Konzentrations-Kontrolle die Hybridisierung mit einer cDNA-Sonde des "housekeeping" Enzyms Katalase (CAT).

 

 
 
Abb.13: Relative Induktion der HO-1 mRNA 
Das Balkendiagramm zeigt 10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten, die für 0.5, 1.5, 3 und 6 Stunden mit 5 uM Cadmiumchlorid stimuliert wurden. Die x-fache Induktion der HO-1 mRNA ermittelte sich aus dem Quotient der relativen Integratoreinheiten (in %) von den induzierten Proben und den dazugehörigen Kontrollwerten. Angegeben sind jeweils die Mittelwerte aus drei Experimenten (+/- SEM).
 

Die Ergebnisse in der Abbildung 13 zeigen die Induzierbarkeit der HO-1 in primären Hepatozyten. In den unbehandelten Kontroll-Hepatozyten ist die HO-1 mRNA basal exprimiert, während Cadmiumchlorid die HO-1-Expression bereits nach 1.5 Stunden stimuliert. Eine maximale Induktion der HO-1 mRNA konnte nach 3 Stunden Stimulierung detektiert werden.
Weitere Zeitkinetikversuche zeigten, daß die Cadmiumchlorid-Stimulierung über 12 Stunden konstant induzierend auf die Hämoxygenase wirkt. 24 Stunden alte primäre Hepatozyten wurden für 1.5 Stunden mit Cadmiumchlorid inkubiert. Anschließend wurde das Medium gewechselt, um die toxischen Nebenwirkungen des Schwermetalles auf die Hepatozyten zu reduzieren, und die Zellen wurden für weitere 4.5 und 10.5 Stunden inkubiert. Als Kontrolle diente die RNA unbehandelter primärer Hepatozyten gleichen Zellalters, bei denen ebenfalls nach 1.5 Stunden ein Mediumwechsel stattfand. Die Zellernte und Präparation der RNA erfolgte nach 6 und 12 Stunden (inkl. 1.5 Stunden Stimuli). Die HO-1 mRNA unbehandelter Zellen wurde nur gering exprimiert, während die mRNA stimulierter Zellen nach 6 und sogar noch nach 12 Stunden stark exprimiert wurde (siehe Abbildung14).

 

 
Abb.14: Expression der HO-1 durch Cadmiumchlorid in primären Hepatozyten 
Die Abbildung zeigt 10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten, die für 1.5 Stunden mit 5 uM Cadmiumchlorid stimuliert und nach einem Mediumwechsel (MW) für weitere 4.5 ([Sigma] 6h) und 10.5 ([Sigma] 12) Stunden inkubiert wurden. Als interne Konzentrationskontrolle diente die Hybridisierung mit der cDNA der Katalase (CAT).
 
Um zu prüfen, ob es sich bei der Cadmiumchlorid vermittelten Expression der HO-1 um einen direkten Effekt auf die Transkription handelt, wurden Run-Off Transkriptionsmessungen durchgeführt.
Die Ergebnisse der Transkriptionsmessungen sind in der Abbildung 15 dargestellt. Bei den unbehandelten Run-Off Transkripten konnten auf den DNA-Kapillar-Membranen (Experimenteller Teil, Kapitel 4) keine Signale verifiziert werden, während bei den Transkripten aus den Cadmium-behandelten Hepatozytenkulturen ein eindeutiges Signal bei der HO-1 cDNA zu verzeichnen ist. Als weitere Kontrolle wurden bei dem DNA-Kapillar-Verfahren Präparate der cDNA Katalase und zwei Plasmidkonstrukte des 5'-untranskribierten HO-1-Promotors aufgetragen. Bei dem HO 830 Basenpaar (bp) Konstrukt konnte ein schwaches Signal gezeigt werden. Grund dafür ist die Anwesenheit von 103 bp dieses HO-1-Fragmentes, das in dem translatierten Bereich des Genes lokalisiert ist.

 

 
Abb.15: Run-Off Transkriptionsmessung der HO-1 
Für den Nukleinsäure-Kapillar-Transfer wurden 100 ng der cDNA HO-1, der internen Kontrolle Katalase (CAT) und des 830 bp HO-1-Promotorkonstruktes, sowie als eine weitere Kontrolle 250 ng eines 5'-untranskribierten HO-1 Plasmides eingesetzt.
 
 

1.2 Analyse des Kobaltchlorides als Induktor

Die Induktionsfähigkeit des Kobaltchlorids auf die HO-1-Expression wurde in den vergangenen Jahren vorwiegend in permanenten Zellinien untersucht. Wie das Kobaltchlorid auf die Expression der HO-1 mRNA wirkt, konnte bisher noch nicht geklärt werden. Einige Arbeitsgruppen diskutierten sogar (Eckardt et al., 1994), daß das zweiwertige Metall in der Lage ist, das kovalent gebundene Eisen-II-Ion des Porphyrinringes der Hämgruppe zu verdrängen und sich selbst an diese Stelle zu setzen. Diese Hypothese konnte bisher nicht bestätigt werden. Andere Arbeitsgruppen (Ehleben et al., 1997) diskutierten eine mögliche Regulation des Induktors durch Interaktion des zweiwertigen Metalls mit dem zentralen Eisenatom der Hämgruppe, was zu einem Wechsel des Redoxzustandes des zentralen Eisenatoms (Fe2+ zu Fe3+ ) führt. Beide Theorien beruhen auf einer Überführung des zentralen Hämgruppenmetalls in eine Desoxy-Form, welche somit induzierend auf die Expression HO-1 wirkt. 24 Stunden alte primäre Hepatozytenkulturen wurden 2 und 4 Stunden mit 100 uM Kobaltchlorid stimuliert. Als Kontrolle diente die RNA unbehandelter Hepatozyten.
Es ließen sich die bereits von Immenschuh et al. 1995 ermittelten Ergebnisse in primären Hepatozytenkulturen reproduzieren (Abbildung 16): in den unbehandelten Präparaten ist die HO-1 mRNA gering exprimiert, während das Kobaltchlorid die Expression nach 2 Stunden maximal stimuliert.

 

 
Abb.16: Expression der HO-1 durch Kobaltchlorid in primären Hepatozyten 
 10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten, die für 2 und 4 Stunden mit 100 uM Kobaltchlorid inkubierten, wurden in den Northern Transfer eingesetzt. Der Northern-Transfer und die Hybridisierung erfolgte wie im Experimentellen Teil (Kapitel 5) beschrieben.
 
 

1.3 Analyse des Hämoxygenase 1-Substrates Häm

Die Expressionsfähigkeit der HO-1 durch ihr eigenes Substrat Häm stellt einen sehr interessanten Aspekt dar, weil die Häm-vermittelte Induktion der HO-1 mRNA noch völlig unbekannt ist. Besonders erwähnenswert ist die Kenntnis, daß andere ebenfalls Häm-bindene Proteine wie das Hämopexin, nicht durch das Substrat stimuliert werden können. Ausgangspunkt für diese Untersuchungen war ebenfalls die Induzierbarkeit der HO-1 durch das Häm (Häminchlorid) in den primären Hepatozyten. Alle bislang in der Literatur vorhandenen Experimente wurden in permanenten Zellinien durchgeführt (Mitani et al., 1993 und Immenschuh et al., 1995). Es stellt sich die Frage, in welcher Art und Weise Häm die Induktion der HO-1 vermittelt und ob die transkriptionelle Aktivierung der HO-1 über ein spezifisches DNA-Element erfolgt.

Primäre Hepatozytenkulturen wurden 24 Stunden nach der Präparation für 2, 4 und 6 Stunden mit 10 uM Häm (Häminchlorid, C34H32ClFeN4O4) stimuliert. Als Kontrolle diente die RNA nicht stimulierter Hepatozyten. Die Ergebnisse der kinetischen Untersuchungen in den primären Hepatozyten sind in der Abbildung 17 dargestellt. Die Arbeitsgruppe um Immenschuh zeigte eine Expression der HO-1 nach einer fünfstündigen Inkubation mit dem Substrat Häm. Bei den kinetischen Ansätzen in den Primärkulturen konnte bereits nach 2 Stunden Stimulus eine eindeutige Expression der HO-1 mRNA verifiziert werden, die nach 4 Stunden eine maximale Expression zeigt. In den unbehandelten Präparaten ist die HO-1 mRNA kaum zu detektieren.

 

 
 
Abb.17: Häm-vermittelte relative Induktion der HO-1 mRNA 
Das Balkendiagramm zeigt 10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten die für 2, 4 und 6 Stunden mit dem HO-1-Subtrat Häm (10 uM) stimuliert wurden. Die x-fache Induktion der HO-1 mRNA ermittelte sich aus dem Quotienten der relativen Integratoreinheiten (in %) von den induzierten Proben und den dazugehörigen Kontrollwerten. Angegeben sind jeweils die Mittelwerte aus drei Experimenten (+/- SEM). 
 
 

1.4 t-Butylhydrochinon als Induktor der Hämoxygenase 1

1987 wurde von Müller et al. ein Teil des 5'-untranslatierten Bereiches der HO-1 und die cDNA-Sequenzen veröffentlicht. In dem Promotor-Bereich wurden mit Hilfe von käuflichen Computerprogrammen putative DNA-Bindungselemente bestimmt. Unter anderem wurde ein Metall-responsiver Trankriptionsfaktor 1 (metal-responsive transcription factor 1) verifiziert. Dalton et al. (1996) beschrieben eine Regulation des Metallothionein-Gens durch t-Butylhydrochinon über ein Metall-responsives Element. Allerdings liegt in dem Metallothionein-Gen dieses Element in einer fünffache Wiederholungssequenz vor. Bei der HO-1 handelt es sich um eine einmalige Sequenz.

Um zu prüfen, ob das t-Butylhydrochinon induzierend auf die HO-1 mRNA-Expression wirkt, wurden die 24 Stunden alten kultivierten Hepatozyten für 3 und 6 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen (20, 40 und 60 uM) des t-Butylhydrochinons (2-t-Butylbenzen-1,4-diol, C10H14O2) stimuliert, da die in der Literatur angegebene Konzentration von 100 uM für permanente Zellinien in den Primärkulturen toxisch wirkte.

 

 
Abb.18: Detektion der t-Butylhydrochinon-stimulierten HO-1 
10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten wurden für 3 und 6 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen ( 20, 40 und 60 uM) t-Butylhydrochinon stimuliert (t- BHC). Northern Transfer Analysen und die Hybridisierungen mit spezifischen cDNA-Sonden erfolgte wie im Experimentellen Teil (Kapitel 5) beschrieben.
 

Die Ergebnisse in Abbildung 18 zeigen die Northern Blot Analyse der t-Butylhydrochinon-inkubierten primären Hepatozyten. Als Kontrolle diente die RNA unbehandelter Kulturen und bei der Detektierung der mRNA wurde die Membran, wie in allen Versuchen, zusätzlich mit der cDNA der Katalase als interne Auftragungskontrolle hybridisiert. Die Kontroll-RNA der HO-1 ist kaum zu detektieren, während das t-Butylhydrochinon die HO-1-Expression bereits nach 3 Stunden mit der geringsten Konzentration von 20 uM stimuliert. Die anderen Konzentrationen (40 und 60 uM) wirkten ebenfalls nach 3 Stunden induzierend auf die HO-1 mRNA. Die RNA-Präparate, die 6 Stunden mit dem t-Butylhydrochinon stimuliert wurden, zeigten einen weiteren Anstieg der HO-1-Expression bei allen Konzentrationen. Die Ergebnisse zeigen, daß die HO-1 der mit 40 uM t-Butylhydrochinon behandelten Hepatozyten am stärksten induziert wird, so daß alle weiteren Untersuchungen mit dieser Konzentration durchgeführt wurden.

 

2. Analyse der Induzierbarkeit der Hämoxygenase 1 auf der Protein-Ebene

2.1 Die Metalle: Cadmium- und Kobaltchlorid

Analog zu den Untersuchungen auf der RNA-Ebene der Hämoxygenase wurden Untersuchungen zu der Expression auf der Proteinebene vorgenommen. Die bisherigen Expressions- und Aktivierungsstudien wurden ausschließlich auf der RNA-Ebene untersucht und in der Literatur gibt es viele Gene, die lediglich auf der RNA-Ebene induziert werden können, ohne daß das dazugehörende Protein translatiert wird. Eine Untersuchung der Induzierbarkeit der HO-1 auf der Protein-Ebene würde Hinweise darauf geben, ob bei der Regulation des Enzyms noch post-translationelle Modifikationen hinzukommen.

Für die kinetische Analyse der induzierten Hämoxygenase auf der Proteinebene wurden 24 Stunden alte primäre Hepatozyten für 2, 4 und 6 Stunden mit den Metallen stimuliert. Die Zellen wurden mit PBS geerntet und 5 ng des Gesamt-Proteins pro Bedingung aufgetragen. Als Kontrolle diente das Gesamt-Protein unbehandelter Primärkulturen. Die Detektierung des Proteins auf den SDS-PAGE-Gelen erfolgte mit einem rekombinant hergestellten "Rat Heme Oxygenase Protein SPP730" Antikörper. In Abbildung 19 ist der kinetische Western-Semi-Dry-Blot dargestellt. Bei den Präparaten der zweistündigen Cadmium- und Kobaltchlorid Behandlung konnte kein Anstieg des Protein-Gehaltes festgestellt werden. Nach einer vierstündigen Stimulierung wurde das Hämoxygenase-Protein verstärkt translatiert. Bei einem Vergleich der Protein-Expression zwischen der vier- und der sechsstündigen Stimulierung ist kein weiterer Anstieg der Cadmiumchlorid induzierten Präparate festzustellen. Während bei den Kobaltchlorid behandelten primären Hepatozyten zwischen dem 4 und 6 Stunden Stimulus ein, wenn auch nicht sehr starker, weiterer Anstieg des Protein-Gehaltes verifiziert werden konnte.

 

 
Abb.19: Western Transfer Analyse der HO-1 Protein-Expression  
Dargestellt sind 5 ng des Gesamt-Proteins aus primären Hepatozyten, die für 2, 4 und 6 Stunden entweder mit 5 uM Cadmium- oder mit 100 uM Kobaltchlorid inkubiert wurden. SDS-PAGE und Western Transfer Analysen erfolgten wie im Experimentellen Teil (Kapitel 10.2) beschrieben.
 
 

2.2 Häm- und t-Butylhydrochinon-vermittelte Protein-Expression

Die Untersuchungen auf der Protein-Ebene der HO-1, stimuliert durch Häm und dem t-Butylhydrochinon, erfolgte mit identischen, kinetischen Ansätze, wie bei den Metall-induzierten Proben. Primäre Hepatozyten wurden 24 Stunden nach ihrer Kultivierung für 2, 4, 6 und 8 Stunden mit Häm (10 uM) oder mit 40 uM des t-Butylhydrochinons stimuliert. Beide Induktoren sind in der Lage, nach einer zweistündigen Stimulierung den HO-1 Protein-Gehalt hoch zu regulieren. Der deutliche Anstieg des Proteins nach 4 Stunden (durch Häm und t-Butylhydrochinon) ist nach 6 und 8 Stunden Stimulierung noch immer maximal induziert. Als Kontrolle diente das Gesamt-Protein unbehandelter primärer Hepatozyten.
Die Ergebnisse der kinetischen Western Transfer Analysen zeigen in der Abbildung 20 eine maximale Expression des HO-1 Proteins durch die Induktoren Häm und t-Butylhydrochinon.

 

 
Abb.20: Kinetische Western Transfer Analyse des HO-1-Proteins  
 Detektion von 5 ng des Gesamt-Proteins aus primären Hepatozyten, die für 2, 4, 6 und 8 Stunden entweder mit 10 uM Hämin oder 40 uM t-Butylhydrochinon (t-BHC) stimuliert wurden. 
 

3. Amplifikation von cDNA-Abschnitten des c-Fos- und c-Jun- Genes mit geeigneten Primer-Paaren

Von der Forschergruppe Oguro et al. (1996) wurde ein Zusammenhang der HO-1 Induktion mit der gleichzeitigen Stimulierung des c-Jun-Genproduktes hergestellt. Das c-Jun gehört zu der Transkriptionsfaktorklasse der Leuzin-Zipper Motive, zu denen ebenfalls das c-Fos gehört. Diese Proteine sind in der Lage, als Homodimere (c-Jun/c-Jun) oder auch als Heterodimere (c-Jun/c-Fos) an das entsprechende DNA-Element zu binden. Aus diesem Grund wurden definierte cDNA-Bereiche dieser beiden Transkriptionsfaktoren mit geeigneten Primer-Paaren (siehe Anhang 1) mit Hilfe der PCR aus der genomischen Bank der Ratte amplifiziert. Der schematische Aufbau der Plasmidkonstrukte ist in Abbildung 21 dargestellt. Beide Genabschnitte (c-Jun und c-Fos) wurden in den A/T-Klonierungsvektor pT7 eingebracht (siehe Experimenteller Teil, Kapitel 7.2).

 

 
 
Abb.21: Schematischer Aufbau der c-Jun- und c-Fos-cDNA-Plasmide 
Die Klonierung der PCR-amplifizierten cDNA-Fragmente des c-Jun- und c-Fos-Genes erfolgte in den PCR-Vektor pT7Blue in die T-cloning site zwischen den Restriktionsendonukleasen EcoR I und BamH I. 
 
 

3.1 Untersuchung der c-Jun- und c-Fos-Expression in t-Butylhydrochinon- induzierten primären Hepatozyten

Um zu zeigen, daß die Induktion der HO-1 mit der gleichzeitigen Expression der Genprodukte c-Fos und/ oder c-Jun verläuft, wurden die primären Hepatozytenkulturen 24 Stunden nach ihrer Präparation für 6 Stunden mit 40 uM t-Butylhydrochinon stimuliert. Anschließend wurde ein Teil der bereits behandelten Zellen 3 Stunden mit 20 mM des Antioxidanten N-Acetylcystein (NAC) inkubiert. Als Kontrolle diente die Gesamt-RNA unstimulierter primärer Hepatozyten. In Abbildung 22 ist die c-Jun Expression der t-Butylhydrochinon-induzierten und NAC behandelten Präparate dargestellt. Die Resultate der c-Fos Stimulierung werden nicht gezeigt, da keine erhöhte Expression festgestellt werden konnte. Die Ergebnisse zeigen die eindeutige Induktion des Transkriptionsfaktors c-Jun durch das t-Butylhydrochinon. Diese eindeutige Expression läßt sich dominant durch den Antioxidanten NAC reprimieren.

 

 
Abb.22: c-Jun-Expression in t-Butylhydrochinon behandelten Zellen 
Detektion von 10 ug Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten, die für 6 Stunden mit 40 uM t-Butylhydrochinon (t-BHC) und zusätzlich für 3 Stunden mit dem Antioxidanten N- Acetylcystein (NAC, 20mM) ohne Mediumwechsel behandelt wurden ([Sigma] 9 Stunden Inkubationszeit). Bei den NAC-Kontrollwerten wurden die Zellen nach 6 Stunden, gleichfalls wie die zuvor stimulierten Proben, für 3 Stunden mit NAC inkubiert ([Sigma] 9 Stunden). Die Detektion der mRNA erfolgte mit einer spezifischen cDNA-Sonde des c-Jun-Genes. 
  
Primäre Hepatozyten, die mit den anderen Induktoren (Häm, Cadmium- und Kobaltchlorid) stimuliert wurden, zeigten keine Expression des Transkriptionsfaktors c-Jun. Die entsprechenden Hybridisierungen der t-Butylhydrochinon-stimulierten Northern Transfer Analysen mit der c-Fos cDNA-Sonde zeigen keine Expression des Transkriptionsfaktors. Negativ ist die c-Fos-Expression ebenfalls in den Häm, Cadmium- und Kobaltchlorid behandelten primären Hepatozyten.

 

4. Reprimierbarkeit der induzierten Hämoxygenase 1 durch Antioxidanten

Die HO-1 wird in der Literatur als ein Streß-induziertes Protein beschrieben (Sato et al.,1993), dessen Induzierbarkeit durch eine Vielzahl von Agentien erfolgen kann (z.B. durch Hitzeschock, UV-Licht, Radikale, Wasserstoffperoxid und oxidative Veränderungen der Zelle, verschiedene Metalle und verschiedene Metallporphyrine).
Um festzustellen, ob die Stimulierung der HO-1 durch die Induktoren Cadmium-, Kobaltchlorid, Häm und t-Butylhyhydrochinon unter oxidativer Veränderung in den primären Hepatozyten verläuft, wurden Antioxidanten co-inkubiert. Durch die Zugabe der Antioxidanten soll die Wiederherstellung der Balance zwischen den Oxidanten und den Antioxidanten der Zelle demonstriert werden.
 
 

4.1 Reprimierbarkeit der Metall-induzierten Hämoxygenase 1 durch N- Acetylcystein (NAC)

Das N-Acetylcystein (NAC) ist die Vorstufe des zellulären Antioxidanten Glutathion (GSH). Das Glutathion spielt eine bedeutende Rolle bei zellulären Entgiftungsvorgängen der Radikale und stellt für die Zelle ein Sulfhydryl-Puffersystem dar ( siehe Einleitung, Kapitel 5.2). Wenn das NAC zugegeben wird, geht man davon aus, daß die Expression der HO-1 mRNA (als ein unter oxidativem Streß induziertes Enzym) reprimiert wird.

Cadmium-induzierte primäre Hepatozyten
Kultivierte primäre Hepatozyten wurden 24 Stunden nach ihrer Präparation für 1.5 Stunden mit Cadmiumchlorid (5 uM) stimuliert. Anschließend erfolgte ein Mediumwechsel, um noch vorhandenes Metall aus dem Puffer zu erntfernen, da zweiwertige Metall-Ionen durch die Sulfhydrylgruppen des N-Acetylcysteins gebunden werden können. Durch die Metall-Schwefel-Bindung würde keine Aussage über die antioxidative Wirkung des NACs in den primären Hepatozyten getroffen werden können. Nach dem Mediumwechsel wurden die Primärkulturen für 6 bzw. 12 Stunden (inklusiv 1.5 Stunden Stimulus) inkubiert. Als Kontrolle dient die Gesamt-RNA unbehandelter Hepatozyten, die gleichfalls einen Mediumwechsel nach einer 1.5-stündigen Inkubation hatte.

In der Abbildung 23 ist der Northern Blot der Cadmium-induzierten und der NAC-reprimierten HO-1 mRNA dargestellt. Die Ergebnisse veranschaulichen, daß die nach 6 Stunden (1.5 Stunden Cadmiumchlorid, Mediumwechsel und 4.5 Stunden NAC) geernteten Zellen eine geringfügige Reprimierung der induzierten HO-1 mRNA zeigen, während die nach 12 Stunden (1.5 Stunden Metall, Mediumwechsel und 10.5 Stunden NAC) geernteten Gesamt-RNAs eine deutliche Reprimierung der Cadmium-vermittelten Stimulierung der HO-1 demonstrieren. Die Experimenten zeigen, daß eine Reprimierbarkeit der induzierten HO-1 erst nach einer sehr langen (10.5 Stunden) Inkubation mit dem Antioxidanten NAC erzielt werden konnte.

 

 
Abb.23: Repression der HO-1-Expression in primären Hepatozyten  
Dargestellt sind 10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten, die für 1.5 Stunden mit Cadmiumchlorid (5 uM) stimuliert und nach einem Mediumwechsel (MW) für weitere 4.5 ([Sigma] 6) und 10.5 Stunden ([Sigma] 12 Stunden Inkubationszeit) mit dem Antioxidanten NAC (20 mM) inkubiert wurden. 
 
Kobaltchlorid-induzierte primäre Hepatozyten
Um die Reprimierbarkeit der induzierten HO-1 mit dem Antioxidanten auch noch für das Kobaltchlorid zu demonstrieren, wurden kultivierte primäre Hepatozyten für 0.5, 1.5 und 2 Stunden mit Kobaltchlorid stimuliert. Anschließend wurde das Medium aller Versuchskulturen gewechselt und für weitere 2 Stunden wurde NAC den Zellen dargereicht. Der gleiche Versuchsansatz wurde mit Cadmium-induzierten Hepatozyten durchgeführt. Die Zellen wurden bei gleichem Zellalter, nach maximal 4 Stunden geerntet. Die Ergebnisse der Versuche, die eine Inkubationszeit des NACs von 2 Stunden aufweisen, zeigten keine Reprimierbarkeit der induzierten HO-1. Das läßt die Vermutung zu, daß der Antioxidant NAC einen längeren Zeitraum (10.5 Stunden) benötigt, um das Gleichgewicht zwischen den Oxidanten und Antioxidanten in den Cadmium- und Kobaltchlorid stimulierten primären Hepatozyten wieder herzustellen.

 

4.2 Reprimierbarkeit der Häm und t-Butylhydrochinon induzierten Hämoxygenase 1 durch N-Acetylcystein (NAC)

Um gleichfalls eine Reprimierung der HO-1 mRNA-Expression durch den Antioxidanten NAC bei den Häm und den t-Butylhydrochinon behandelten primären Hepatozyten zu demonstrieren, wurden die Primärkulturen 24 Stunden nach ihrer Kultivierung für 3 Stunden mit Häm und für 6 Stunden mit t-Butylhydrochinon stimuliert. Anschließend wurden die Zellen 3 Stunden mit 20 mM NAC inkubiert. Als Kontrolle diente die Gesamt-RNA unstimulierter und nur mit NAC behandelter Hepatozyten.
 
 
 
Abb.24A: HO-1-Repression durch NAC in primären Hepatozyten (Häm-Stimulierung) 
Die Abbildung zeigt eine Northern Transfer Analyse mit 10 ug Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten, die für 3 Stunden mit Hämin (10 uM) induziert und zusätzlich ohne Mediumwechsel für 3 Stunden mit NAC (20 mM) inkubiert wurden ([Sigma] 6 Stunden). 
 
 
Die Ergebnisse der Reprimierungsexperimente mit dem Antioxidanten NAC sind in den Abbildungen 24A und 24B veranschaulicht. In der Abbildung 24A ist die Northern Blot Analyse der Häm induzierten und NAC behandelten HO-1 dargestellt. Abbildung 24B zeigt die t-Butylhydrochinon-induzierten und NAC behandelten Präparate. Die Ergebnisse zeigen, daß sich die HO-1 mRNA der Häm und der t-Butylhydrochinon induzierten Präparate eindeutig durch den Glutathion (GSH) Vorläufer NAC reprimieren lassen.
 
 

Abb.24B: HO-1-Repression durch NAC in primären Hepatozyten (t-Butylhydrochinon- Stimulierung)  
Northern Transfer Analyse mit 10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten, die für 6 Stunden mit t-Butylhydrochinon (t-BHC; 40 uM) und zusätzlich für weitere 3 Stunden mit NAC (20 mM) inkubiert wurden ([Sigma] 9 Stunden). Bei der NAC-Kontrolle wurden die Zellen nach 6 Stunden, gleichfalls wie die zuvor stimulierten Proben, für 3 Stunden mit NAC inkubiert ([Sigma] 9 Stunden). 
 

4.3 Reprimierbarkeit der Häm und t-Butylhydrochinon induzierten Hämoxygenase 1 durch den Antioxidanten a-Tocopherol (Vitamin E)

In der Literatur wurde in den bisherigen Arbeiten über die HO-1 lediglich über eine Reprimierbarkeit des bereits induzierten Enzyms durch NAC diskutiert. Um die Ergebnisse der Glutathionvorstufe NAC abzurunden, wurde ein zweiter zellulärer Antioxidant ausgewählt. Das a-Tocopherol schützt die Zellmembranen vor einer Lipid-Peroxidation durch Radikale (siehe Einleitung, Kapitel 5.2).

Um eine Reprimierung der stimulierten HO-1 durch a-Tocopherol deutlich zu machen, wurden die kultivierten primären Hepatozyten 24 Stunden nach ihrer Präparation für 3 Stunden wahlweise mit Häm oder t-Butylhydrochinon stimuliert. Ein Teil der Zellen erhielt nach der Stimulation mit den entsprechenden Induktoren 1 bzw. 2 uM a-Tocopherol für 3 Stunden, um die HO-1 mRNA zu reprimieren. Als Kontrolle diente die Gesamt-RNA unbehandelter primärer Hepatozyten. Die Isolation der RNA und der anschließende Northern Transfer, sowie die Detektion der HO-1 mRNA erfolgte wie im Experimentellen Teil (Kapitel 5) beschrieben.
 
 

 
Abb.25: Repression der induzierten HO-1 durch den Antioxidanten a-Tocopherol 
A und B stellen die Northern Transfer Analysen von 10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten dar. Die Präparate wurden für 3 Stunden mit 10 uM Hämin (A) und mit 40 uM t-Butylhydrochinon (t-BHC) (B) induziert. Anschließend wurden die stimulierten Hepatozyten zusätzlich für weitere 3 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen (1 und 2 uM) des Antioxidanten a-Tocopherol (a-Toc) inkubiert ([Sigma] der Inkubationszeit 6 Stunden). Bei den a-Tocopherol-Kontrollwerten wurden die Zellen nach 3 Stunden, gleichfalls wie die zuvor stimulierten Proben, für 3 Stunden mit a-Tocopherol inkubiert ([Sigma] 6 Stunden). 
 

Die Ergebnisse der a-Tocopherol reprimierten HO-1 mRNA sind in der Abbildung 25A und B dargestellt. Die Abbildung 25A zeigt die Detektion der HO-1 mRNA im Northern Transfer durch Häm stimulierte Zellen, während Abbildung 25B die HO-1 mRNA t-Butylhydrochinon-induzierter Proben darstellt. In den unbehandelten Kontrollen ist die HO-1 mRNA kaum zu detektieren, während Häm und das t-Butylhydrochinon die HO-1-Expression maximal stimuliert. Die Ergebnisse demonstrieren, daß der positive Induktionseffekt der Induktoren durch a-Tocopherol (1 und 2 uM) dominant negativ reprimiert werden kann.

 

5. Reprimierbarkeit der Hämoxygenase 1 durch Inhibitoren der respiratorischen Kette

Die Atmungskette, ein Teilprozeß der oxidativen Phosphorylierung, katalysiert den Transport von Elektronen von NADH oder reduziertem Ubichinon auf molekularen Sauerstoff (O2). Für die vollständige Reduktion des Sauerstoffes zu Wasser (H2O) werden vier Elektronen auf den Sauerstoff übertragen und dabei gleichzeitig als Ausgleich Protonen von der Matrix zur inneren zytosolischen Seite der inneren Mitochondrienmembran gepumpt. Die Reduktion des Sauerstoffes offenbart allerdings das Problem, daß eine partielle Reduktion des Sauerstoffes zu außerordentlich reaktiven Verbindungen führt. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist das Superoxianionradikal (O2- .) das durch die Superoxid-Dismutase abgebaut wird. Hydroperoxide bzw. Wasserstoffperoxid werden von der Katalase abgebaut.
Bei "hohen" Konzentrationen von Sauerstoffradikalen sind diese Enzyme nicht mehr in der Lage, schnell genug die reaktiven Metabolite abzubauen. Offensichtlich werden effektivere zelluläre Schutzmechanismen aktiviert. Möglicherweise spielt unter diesen extremen Bedingungen die Expression der HO-1 bei dem zellulären Schutzsystem der primären Hepatozyten eine wichtige Rolle.
Um eine Beteiligung der Mitochondrien bei der Induktion der HO-1 zu belegen, müßte eine Inhibierung der mitochondrialen Funktionen zu einer Reprimierung bzw. Inhibierung des entspechenden Gens verlaufen. Die Inhibitoren, die hierfür verwendet wurden, waren Rotenon und Antimycin A. Rotenon ist ein Inhibitor der Elektronenpumpe für den Komplex 1 der Atmungskette, der die spezifische Elektronenübertragung innerhalb des NADH-Q-Reduktase-Komplexes hemmt, während das Antimycin A ein Inhibitor für den Komplex 2 der Atmungskette darstellt, der den Elektronenfluß zwischen den Cytochromen b1 und c verhindert.

 

5.1 Inhibierung der Metall induzierten Hämoxygenase 1 durch Rotenon

Primäre Hepatozyten wurden 24 Stunden nach ihrer Kultivierung für 2 Stunden mit Cadmiumchlorid (5 uM) bzw. mit Kobaltchlorid (100 uM) stimuliert. Ein Teil der Zellen erhielt für weitere 2 Stunden nach der Stimulation 10 uM des respiratorischen Inhibitors Rotenon, um die HO-1 mRNA-Synthese zu beeinflussen. Als interne Kontrolle diente die RNA unbehandelter Hepatozyten.
Durch die Inhibierung des Atmungskettenkomplexes 1 durch Rotenon konnte die Cadmium- und Kobaltchlorid induzierte HO-1 mRNA-Expression massiv reprimiert werden.
In der Abbildung 26 sind die Ergebnisse der Reprimierungsexperimente einer Kobalt-induzierten HO-1 mRNA dargestellt (der Induktor Cadmium liefert die gleichen Ergebnisse): in der unbehandelten Kontrolle und in den Proben, die ausschließlich Rotenon bekamen, ist die HO-1 mRNA gering exprimiert, während Kobaltchlorid die Expression stimuliert. Dieser positive Induktionseffekt wird durch die Zugabe von Rotenon dominant reprimiert. Diese Ergebnisse zeigen, daß eine durch die Metall-Ionen induzierte HO-1 mRNA sukkzessiv durch die gleichzeitige Inkubation mit dem Inhibitor Rotenon reprimiert wird und damit die Vermutung von einer Beteiligung der Mitochondrien während einer HO-1-Induktion zuläßt.

 

 
Abb.26: Inhibierung der induzierten HO-1 durch Rotenon  
Northern Transfer Analysen von 10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten, die für 2 Stunden mit Kobaltchlorid (100 uM) stimuliert und anschließend für weitere 2 Stunden mit dem Atmungsketteninhibitor Rotenon (10 uM) inkubiert wurden ([Sigma] 4 Stunden). Bei der Rotenon-Kontrolle wurden die Zellen nach 2 Stunden, gleichfalls wie die zuvor stimulierten Proben, für 2 Stunden mit Rotenon inkubiert ([Sigma] 4 Stunden). 
 
 

5.2 Inhibierung der Häm-induzierten Hämoxygenase 1 durch Rotenon

Um eine Beteiligung der mitochondrialen Atmungskette gleichfalls für eine Häm induzierte HO-1 zu demonstrieren, wurden kultivierte primäre Hepatozyten (24 Stunden alt) für 2.5 und 5 Stunden mit 10 uM Häm stimuliert. Ein definierter Teil der Zellen erhielt nach der Induktion 10 uM des Inhibitors Rotenon für je 1 Stunde. Als Kontrolle diente hier wiederum die RNA unbehandelter primärer Hepatozyten. Die Isolation der Gesamt-RNA und der anschließende Northern Transfer sowie die Detektion der HO-1 mRNA erfolgte wie im Experimentellen Teil (Kapitel 5) beschrieben.
Die Ergebnisse der Rotenon-Reprimierung der Häm induzierten HO-1 sind in der Abbildung 27 dargestellt. Bei den unbehandelten Kontrollen ist die HO-1 mRNA basal exprimiert, während, wie in 1.3 demonstriert, Häm die Expression stimuliert. Dieser Häm-Effekt läßt sich eindeutig durch die Zugabe von Rotenon reprimieren.

 

 
Abb.27: Inhibierung der Häm-induzierten Hämoxygenase 1  
10 ug der Gesamt-RNA aus kultivierten Hepatozyten wurden für 2.5 und 5 Stunden mit Hämin (10 uM) stimuliert und im Anschluß für jeweils 1 Stunde mit dem Inhibitor Rotenon co- inkubiert ([Sigma] 3.5 und 6 Stunden Inkubationszeit). Bei der Rotenon-Kontrolle wurden die Zellen nach 5 Stunden, gleichfalls wie die zum gleichen Zeitpunkt stimulierten Proben, für 1 Stunde mit Rotenon inkubiert ([Sigma] 6 Stunden). 
 

5.3 Inhibierung der induzierten Hämoxygenase 1 durch Antimycin A

Um die Ergebnisse des respiratorischen Inhibitors Rotenon abzurunden, wurde eine weitere Versuchsreihe mit dem zweiten Atmungsketteninhibitor Antimycin A durchgeführt.
Die in Kapitel 4.2 erläuterten Ergebnisse konnten mit dem Inhibitor Antimycin A, der hemmend auf den Atmungskettenkomplex 2 wirkt, reproduziert werden. In den Untersuchungen wurden die primären Hepatozyten 24 Stunden nach ihrer Präparation für 2.5 bis 3 Stunden mit den entsprechenden Induktoren stimuliert. Ein Teil der Zellen erhielt nach der Induktion 0.2 uM Antimycin A für jeweils 1 Stunde. Ebenfalls diente hier die Gesamt-RNA unbehandelter und die Gesamt-RNA Antimycin A behandelter primärer Hepatozyten als Kontrolle. Es ließen sich die Ergebnisse der Rotenon reprimierten Experimente bestätigen. Die Ergebnisse demonstrieren, daß der Inhibitor Antimycin A gleichfalls in der Lage ist, dominant die durch Häm, Cadmium- oder Kobaltchlorid stimulierte HO-1 zu reprimieren.

Inhibierung der t-Butylhydrochinon-induzierten Hämoxygenase 1 durch Rotenon und Antimycin A
Dieser reprimierende Effekt der Atmungsketteninhibitoren Antimycin A und Rotenon auf die HO-1 mRNA-Expression sollte im Anschluß noch für den Induktor der HO-1 t-Butylhydrochinon demonstriert werden. Aus diesem Grund wurden 24 Stunden alte primäre Hepatozyten für 4 Stunden mit 40 uM t-Butylhydrochinon induziert. Ein Teil der Hepatozyten erhielt nach der Stimulierung 10 uM Rotenon für 2 Stunden. Gleichfalls diente hier als Kontrolle die RNA unbehandelter und die RNA nur Rotenon behandelter primärer Hepatozyten. Die Ergebnisse der Experimente zeigten, daß das t-Butylhydrochinon die HO-1-Genexpression maximal stimuliert, während diese Induktion durch die Zugabe des respiratorischen Inhibitors Rotenon nicht reprimiert werden kann. Das gleiche Ergebnis konnte mit dem zweiten Atmungsketteninhibitor Antimycin A festgestellt werden, der ebenfalls keine Reprimierung der bereits t-Butylhydrochinon induzierten HO-1 mRNA zeigt.

 

6. Adenosintriphosphat-(ATP)-Gehalt der primären Hepatozyten

Das Adenosintriphosphat (ATP) fungiert durch sein hohes Phosphorylgruppenüber-tragungspotential als Energiequelle für die verschiedensten zellulären Vorgänge. Das ATP wird durch die Oxidation von Brennstoffmolekülen wie Glukose, Fettsäuren und Aminosäuren erzeugt. Das gemeinsame Zwischenprodukt bei den meisten dieser Oxidationen ist das Acetyl-CoA. Die Kohlenstoffatome der Acetylgruppe werden in dem Citratzyklus vollständig zu Kohlendioxid (CO2) oxidiert, wobei gleichzeitig die Elektronen-Carrier NADH und FADH2 entstehen. Diese Elektronen-Carrier übertragen ihre energiereichen Elektronen anschließend auf die Atmungskette. Der Elektronenfluß zum Sauerstoff (O2) bewirkt, daß Protonen durch die innere Mitochondrienmembran gepumpt werden. Dieser Protonengradient wird anschließend zur ATP-Synthese benutzt (Stryer, 1990). Das ATP ist die universelle Energiequelle einer Zelle und gibt gleichzeitig Auskunft über den zellulären Zustand (z.B. der Mitochondrien).
Der ATP-Gehalt wurde gemessen, um den Einfluß der HO-1-Induktoren auf den Gesamt-ATP-Gehalt der primären Hepatozyten zu bestimmen und damit einen Einblick auf den zellulären Zustand der Hepatozyten zu erhalten.

 

6.1 Bestimmung des ATP-Gehaltes Cadmium-behandelter Hepatozyten

Für die Bestimmung des ATP-Gehaltes der primären Hepatozytenkulturen wurden 24 Stunden alte Zellen für 2 und 4 Stunden mit Cadmiumchlorid (5 uM) stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte primäre Hepatozyten. Die Ernte und Aufarbeitung der Zellen sowie die Messung des ATPs erfolgte wie im Experimentellen Teil (Kapitel 11) beschrieben.
Die Ergebnisse der ATP-Messung unter Cadmiumchlorid in den primären Hepatozyten ist in der Abbildung 28 dargestellt. In den unbehandelten Kontrollextrakten ist der ATP-Gehalt gut meßbar. Nach einer zweistündigen Cadmiumchlorid-Inkubation ist der ATP-Gehalt leicht gesenkt (um das 1.4-fache), während nach einer vierstündigen Inkubation der ATP-Gehalt sukkzessiv reprimiert ist (um das 28-fache). Diese Ergebnisse zeigen, daß das Cadmiumchlorid einen massiven Einfluß auf den Gesamt-ATP-Gehalt der primären Hepatozyten nimmt.

 

 
 
Abb.28: Relativer ATP-Gehalt der induzierten primären Hepatozyten 
Die Bestimmung des ATP-Gehaltes der Cadmiumchlorid (5 uM) induzierten primären Hepatozyten erfolgte über 2 und 4 Stunden mit 50 uL der hepatischen Zellsuspension in einem Luminometer (siehe Experimenteller Teil, Kapitel 11). 
 
 

6.2 Messung des ATP-Gehaltes Kobaltchlorid-behandelter primären Hepatozyten

Um den Gesamt-ATP-Gehalt in den durch Kobaltchlorid behandelten Primärkulturen zu bestimmen, wurden die Hepatozyten 24 Stunden nach ihrer Präparation für 2 und 4 Stunden mit 100 uM Kobaltchlorid induziert. Die Proteinsuspension unbehandelter primärer Hepatozyten diente als Kontrolle. In der Abbildung 29 ist das ATP-Balkendiagramm Kobaltchlorid induzierter Hepatozyten dargestellt.
Das Ergebnis veranschaulicht, daß sich durch eine Kobaltchloridbehandlung der primären Hepatozyten keine Veränderung des ATP-Gehaltes nachweisen läßt. Selbst nach einer vierstündigen Inkubationszeit ist der ATP-Gehalt vergleichbar mit dem unbehandelter Zellen.
 
 
 
 
Abb.29: ATP-Gehalt Kobalt-induzierter primärer Hepatozyten 
Das Balkendiagramm zeigt die Analyse des ATP-Gehaltes aus primären Hepatozyten (50 uL), die zuvor für 2 und 4 Stunden mit Kobaltchlorid (100 uM) induziert wurden. 
 
 

6.3 Bestimmung des ATP-Gehaltes Häm-induzierter primärer Hepatozyten

Die primären Hepatozyten wurden für die Gesamt-ATP-Messung unter einer Hämbehandlung 24 Stunden nach ihrer Kultivierung für 3 Stunden mit Häm (10 uM) stimuliert. Ein Teil der Zellen erhielt nach der Stimulation für 1.5 Stunden 20 mM des Antioxidanten N-Acetylcystein (NAC), um den eventuellen reprimierenden Effekt der Hämbehandlung auf den ATP-Gehalt aufzuheben. Als Kontrolle dienten Proteinextrakte unbehandelter primärer Hepatozyten.
In der Abbildung 30 ist der ATP-Gehalt der primären Hepatozyten unter Häm dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß in der unbehandelten Kontrolle der ATP-Gehalt während des Versuches konstant bleibt, während Häm den ATP-Gehalt in den Zellen dominant absenkt. Die Häm-behandelten Hepatozyten, bei denen anschließend eine Zugabe von NAC erfolgte, zeigten nur einen geringfügigen Wiederanstieg des ATP-Gehaltes.

 

 
 
Abb.30: ATP-Gehalt der Häm-stimulierten primären Hepatozyten 
Die Bestimmung des ATP-Gehaltes erfolgte in Hepatozyten, die für 3 Stunden mit Hämin (10 uM) stimuliert wurden, wobei ein Teil der Zellen anschließend mit dem Antioxidanten NAC (20 mM) für weitere 1.5 Stunden co-inkubiert wurden. 
 
 

6.4 Messung des ATP-Gehaltes in t-Butylhydrochinon-stimulierten Hepatozyten

Um zu prüfen, ob sich der Gesamt-ATP-Gehalt der t-Butylhydrochinon behandelten primären Hepatozyten gleichfalls, wie bei den Induktoren Cadmiumchlorid und Häm, massiv reprimiert, wurden 24 Stunden alte Hepatozyten für 4 und 6 Stunden mit 40 uM t-Butylhydrochinon induziert.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zu der Wirkung des tert-Butylhydrochinons auf den ATP-Gehalt hepatischer Primärkulturen zeigten, daß der Induktor keinen Einfluß auf den ATP-Spiegel der hepatischen Zelle ausübt. Als Kontrolle dienten Proteinsuspensionen unbehandelter Hepatozyten. In der Abbildung 31 ist das Balkendiagramm des ATP-Gehaltes dargestellt. Das t-Butylhydrochinon zeigt keinen Einfluß auf den ATP-Spiegel der behandelten Hepatozyten.

 

 
 
Abb.31: ATP-Gehalt in t-Butylhydrochinon-behandelten Primärkulturen 
Das Balkendiagramm zeigt die Analyse des ATP-Gehaltes aus einer primären Zellsuspension (50 uL), die zuvor für 4 und 6 Stunden mit t-Butylhydrochinon (t-BHC; 40 uM) stimuliert wurde. 
 
 

7. Fluoreszenzanalyse der reaktiven Sauerstoffzwischenstufen- Bildung in Hepatozyten mit dem Fluorenszesfarbstoff Dihydrorhodamin 123

Die Fluoreszenzanalyse ist eine Sammelbezeichnung für analytische Methoden, die die charakteristische Fluoreszenz bestrahlter Verbindungen ausnutzen. Im engeren Sinn wird unter der Fluoreszenzanalyse die Untersuchung und Identifizierung von Substanzen durch die Aufnahme des Fluoreszenzspektrums (Fluoreszenzspektroskopie) ebenso wie die quantitative Bestimmung fluoreszierender Verbindungen in z.B. Lösung durch Messung ihrer Fluoreszenzintensität verstanden.

Reaktive Sauerstoffzwischenstufen (reaktive oxygen intermediates, ROIs) sind in vielen biologischen Prozessen involviert. Ein ansteigender Gehalt an freien Radikalen führt zu einem Versagen des zellulären Schutzes. Freie Radikale sind unter anderem "second messenger" (zweite Botenstoffe) für z.B. die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-[kappa]B und der Grund für Zellschädigung, wie z.B. der Lipidperoxidation. Ein Zellschutzsystem gegen erhöhte Mengen an ROIs sind beispielsweise die Überexpression von Mangan Superoxid-Dismutase (MnSOD), Radikaleinfangmechanismen (GSH, Vitamin E), Eisenchelatoren und Inhibitoren oder Eliminatoren der mitochondrialen Elektronentransportkette.
Um die Anreicherung der ROIs in den Mitochondrien der primären Hepatozyten unter oxidativem Streß zu analysieren, wurde der ROI-spezifische, mitochondriale Fluoreszenzmarker Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) eingesetzt (Goossens et al., 1995). Die durch die ROI-Bildung angeregte Floureszenz kann an individuellen primären Hepatozyten mit Hilfe einer konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie (confocal laser scanning microscopy, CLSM) analysiert werden und gibt Aussage über die zytotoxische Antwort der Zelle auf oxidativen Streß. Das Zell-permeable, nicht fluoreszierende Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) wird durch die ROIs (hauptsächlich Hydroxylradikale, Wasserstoffperoxid und Superoxidanionen) zu dem kationisch-fluoreszierenden Farbstoff Rhodamin 123 (R 123) oxidiert, der ausschließlich durch aktive Mitochondrien entfernt wird.
Mit Hilfe dieser Methode sollte die "Streßerzeugung", die ROI-Anreicherung der Induktoren der HO-1 (Cadmium- und Kobaltchlorid, Häm und t-Butylhydrochinon) erstmalig verifiziert werden.

 

7.1 Etablierung der Meßmethode in den primären Hepatozyten

Zur Überprüfung, ob diese Methode für die Detektierung der ROIs in primären Hepatozyten überhaupt geeignet ist, wurden die Kulturen 24 Stunden nach ihrer Präparation für 10, 30, 60 und 90 min mit Wasserstoffperoxid (100 uM) stimuliert, als Positivkontrolle für eine ROI-Anreicherung in der Zelle. Als weitere Kontrolle dienten unbehandelte Zellen gleichen Alters. Das Dihydrorhodamin 123 (1 uM) wurde während der Induktion mit Wasserstoffperoxid für 30 min co-inkubiert und anschließend in einem konfokalen Laser-Scanning Mikroskop bei 488 nm angeregt und bei 550 nm detektiert (siehe Experimentelle Teil, Kapitel 3).
Es ließ sich die von Goossens et al. beschriebene Methode erstmals in primären Hepatozyten reproduzieren (Abbildung 32). In der unbehandelten Kontrolle ist die Fluoreszens des Rhodamins 123 kaum zu detektieren, während in den Wasserstoffperoxid-behandelten Hepatozyten nach bereits 30-minütiger Stimulation eine Akkumulation des ROI-Farbstoffes zu detektieren ist. Wie erwartet, konnte das Wasserstoffperoxid als Kotrolle für diese Methode in den primären Hepatozyten verwendet werden.

 

 
 
Abb.32: Wasserstoffperoxid-vermittelte ROI-Akkumulation 
Die primären Hepatozyten wurden für 30 min mit H2O2 (100 uM) stimuliert (B). In A sind die nicht-induzierten Kontrollpräparate dargestellt (30 min). 
 

7.2 Analyse der ROI-Akkumulation, vermittelt durch Metall-Induktoren

Ein Zusammenhang zwischen der Entstehung von Radikalen und zweiwertigen Metall-Ionen wurde in der Einleitung (Kapitel 9.2) bereits angesprochen. Brennan & Schiestl (1996) beschrieben das Cadmium-II-Ion als einen Induktor für oxidativen Streß in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die Anreicherung der freien Radikale durch die Wirkung des Cadmiums in der Zelle und wahrscheinlich anderer zweiwertiger Metall-Ionen (wie z.B. Kobalt-II-Ion) und die damit verbundene Induktion der Hämoxygenase, als ein zellulärer Schutz gegen oxidativen Streß, würde einen plausiblen Zusammenhang ergeben.

Kultivierte primäre Hepatozyten wurden 24 Stunden nach ihrer Präparation mit Cadmiumchlorid (5 uM) oder Kobaltchlorid (100 uM) für 30, 60, 90 und 120 min stimuliert. Für die Kontrolle dienten unbehandelte Hepatozyten, bei denen, wie bei den stimulierten Zellen, Dihydrorhodamin 123 (1 uM) für 30 min co-inkubiert wurde.
Die Ergebnisse der Fluoreszenzanalysen zeigen erstmalig die Bildung von ROIs bei der Zugabe von Cadmium- und Kobaltchlorid (Abbildung 33, Seite 77): in den unbehandelten Kontrollen ist der Fluoreszenzfarbstoff nur basal zu detektieren, während bereits eine 30-minütige Inkubation der Hepatozyten mit den zweiwertigen Metall-Ionen die ROI-Anreicherung maximal stimuliert. Bei beiden Metallen hält die Stimulierung des Zellsystemes und die damit verbundene permanente Anreicherung mit reaktiven Sauerstoffzwischenstufen 90 min an. Nach einer 120-minütigen Stimulierung ist eine Abnahme der ROI-Bildung in den Cadmium-stimulierten primären Hepatozyten zu verzeichnen, während die Anreicherung der ROIs in den Kobalt-behandelten Zellen noch anhält (in der Abbildung 33 nicht gezeigt).

 

7.3 Analyse der ROI-Akkumulation, vermittelt durch das Hämoxygenase 1- Substrat Häm und durch das t-Butylhydrochinon

Eine Induktion der HO-1 wird durch ihr eigenes Substrat Häm sowie durch das t-Butylhydrochinon vermittelt. In der Literatur wurde das t-Butylhydrochinon (Dalton et al.,1996) als ein oxidativer Streß-Induktor des Methallothionein-Gens diskutiert, während ein Zusammenhang des Substrates Häm und der Bildung von ROIs in der Literatur bisher nur andeutungsweise in Betracht gezogen worden war.

24 Stunden nach der Kultivierung wurden primäre Hepatozyten für 30, 60, 90 und 120 min mit Häm (10 uM) oder t-Butylhydrochinon (40 uM) stimuliert. Als Kontrolle dienten nicht stimulierte, DHR 123 behandelte primäre Hepatozyten gleichen Zellalters.
In Abbildung 34 auf der Seite 78 sind die ROI-Anreicherungen der Häm- und t-Butylhydrochinon behandelten primären Hepatozyten dargestellt: in den unbehandelten Kontrollen ist der Fluoreszenzfarbstoff kaum zu detektieren, während in den stimulierten Zellen eine dominante Akkumulation des Farbstoffes zu verzeichnen ist. In den Häm behandelten Hepatozyten ist eine Anreicherung der ROIs und damit eine verstärkte Fluoreszenz nach 60 min Stimulation zu sehen (Abbildung 34, B). Diese Aktivierung der reaktiven Sauerstoffspezies ist noch nach 90-minütiger Behandlung festzustellen (Abbildung 34, E). In den t-Butylhydrochinon stimulierten primären Hepatozyten zeigt sich, ebenfalls wie in den Häm stimulierten Zellen, eine gesteigerte Fluoreszenz nach 60-minütiger Inkubation mit dem Fremdstoff (Abbildung 34, C). Die Anreicherung der Hepatozyten mit ROIs ist bei der t-Butylhydrochinon-Stimulierung noch 90 min (Abbildung 34, F) und sogar noch 120 min später deutlich zu detektieren (nicht gezeigt). Es ließen sich die von Dalton et al. 1996 aufgestellten Ergebnisse der oxidativen Streß-Eigenschaften des t-Butylhydrochinon erstmals mit Hilfe der Flourenszensanalyse im individuellen Zellsystem unter Laborbedingungen reproduzieren.
 
 

 
 
 
Abb.33: Cadmium- und Kobaltchlorid-induzierte ROI-Akkumulation 
Bilder A und D zeigen die Kontrollmessungen, B und E die Cadmiumchlorid- und C und F die Kobaltchlorid-induzierten Präparate der primären Hepatozyten.
 
 
 
Abb.34: Häm- und t-Butylhydrochinon-induzierte ROI-Akkumulation 
Bilder A und D zeigen die Kontrollmessungen, B und E die Häm- und C und F die t-Butylhydrochinon-induzierten Präparate der primären Hepatozyten.
 
 

8. Untersuchung der transkriptionellen Eigenschaften des Hämoxygenase 1-Promotors

Auf Grund der bisherigen Ergebnisse, bei denen eine transkriptionelle Aktivierung der HO-1 mRNA durch die verschiedenen Induktoren und ihre Beteiligung an der Bildung von ROIs in den primären Hepatozyten nachgewiesen wurde, stellt sich die Frage, welche DNA-Bindungsmotive für diese spezifische Aktivierung der HO-1 von Bedeutung sind.
Ein weiterer wichtiger Aspekt, auf den sich die weiteren molekularen Regulationsuntersuchungen der HO-1 begründen, ist die Schilddrüsenhormon abhängige Induktion der HO-1 mRNA-Expression. Ausgangspunkt der hier durchgeführten Experimente ist die eindeutige Abhängigkeit der HO-1 mRNA-Expression durch Schilddrüsenhormone (3,5,3'-Triiod-L-thyronin, T3) in Northern Transfer Analysen.

Die Untersuchung regulatorischer Bereiche spezifischer Gene erfolgt über Reportergene. Zu diesem Zweck werden die zu untersuchenden Promotor-Abschnitte vor ein Reportergen kloniert, dessen Expression nun unter Kontrolle dieser ausgewählten Sequenzen steht. Als Reportergen geeignet sind Gene, deren Aktivität leicht meßbar ist und die nicht in den verwendeten Zellinien selbst exprimiert werden. Als Reportergen wurde hier Luciferase, ein Enzym des Feuerkäfers (Phonitus pyralis), eingesetzt. Luciferase katalysiert die Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin, bei der Energie in Form von Lumineszenz ensteht. Das emittierte Licht ist der Menge an Luciferase proportional und damit ein Maß für die Aktivität des dem Reportergen vorgeschalteten Promotors. Zwei Arten von Reportergenkonstrukten werden unterschieden:
 
 
1. Heterologe Konstrukte enthalten neben dem Reportergen noch zusätzlich einen minimalen Fremdpromotor, der alle zur Transkription notwendigen regulatorischen Elemente wie TATA-, CCAT- und GC-Box enthält. Durch Insertion anderer regulatorischen Elemente, wie z.B. responsive Sequenzen, lassen sich deren modulierende Einflüsse auf die Transkription isoliert untersuchen. 
 2. Bei homologen Reportergenkonstrukten werden die Promotorsequenzen der basalen Transkriptionsmaschinerie von dem zu untersuchenden Gen selbst geliefert. Putative Elemente können so in ihrer natürlichen Umgebung unter Berücksichtigung zusätzlicher eventuell vorhandener Enhancer- oder Silencer-Sequenzen untersucht werden. 
 
 

8.1 Herstellung der homologen Reporterkonstrukte: Amplifikation von Hämoxygenase 1-Promotorabschnitten mit geeigneten Primern

Mit Hilfe der PCR wurden mit entsprechenden Primer-Paaren (siehe Anhang I) die Promotorabschnitte der HO-1 aus der genomischen Bank der Ratte amplifiziert. Die Primer waren an ihren 5'- und 3'-Enden mit den Restriktionsendonukleasen Kpn I und Bgl II flankiert, über die eine gerichtete Klonierung in den promotorlosen Vektor pxp2 (Nordeen, 1988), der als Reportergen Luciferase enthielt, möglich war. Zwei verschieden lange Promotorabschnitte konnten aus der genomischen Bank der Ratte amplifiziert werden, ein 1300 Basenpaar (bp) und ein 830 bp Fragment. Der schematische Aufbau der Reporterplasmide ist in der Abbildung 35 dargestellt.
 
 
 
 
Abb.35: Schematischer Aufbau der homologen HO-1-Promotor-Konstrukte für die transienten Transfektionen
 

8.2 Transfektionsexperimente

Die Reportergenkonstrukte wurden in Transfektionsexperimente eingesetzt, um die Funktionalität der Promotorregionen zu überprüfen. In derartigen Gentransfer-Experimenten läßt sich nachweisen, ob die untersuchten Sequenzen tatsächlich in der Lage sind, die Transkription durch Stimulation mit den entsprechenden Agentien (Cadmium- und Kobalt-Ionen, Häm, tbHQ und Schilddrüsenhormon T3) zu modulieren. Bei den Experimenten wurden primäre Hepatozyten verwendet. Zusätzlich wurde ein Expressionsplasmid für die bakterielle [beta]-Galaktosidase beziehungsweise ein Expressionsplasmid für die Renilla Luciferase co-transfiziert, die als interner Standard zur Überprüfung der Transkriptionseffizienz dienten. Die primären Hepatozyten wurden 24 Stunden nach ihrer Kultivierung mit der (Ca)3(PO4)2-Präzipitations-Methode für 6 Stunden transfiziert. Anschließend wurde bei den Hepatozyten ein Glycerolschock durchgeführt, um die Zellen für die Aufnahme von DNA-Molekülen empfänglich zu machen. Daraufhin wurden die Zellen für 3 Stunden stimuliert, wie im Experimentellen Teil (Kapitel 8) beschrieben.

 

8.3 Analyse der Hämoxygenase 1-Promotor-Fragmente

Im Allgemeinen gilt für alle Transfektionen, daß zur Normalisierung der Transfektionseffizienz für jeden Transfektionsansatz der Quotient aus den relativen Lichtunits der Luciferase und den [beta]-Galaktosidase-Werten gebildet wurde. Das relative Verhältnis dieser Expressionswerte in An- und Abwesenheit der entsprechenden Induktoren der Hämoxygenase diente zur Ermittlung des Induktionsfaktors, der damit ein Maß für die Induktor-abhängige Expression darstellt.
Die Ergebnisse der beiden Hämoxygenase Promotor-Fragmente (HO 1300 bp und HO 830 bp, siehe Kapitel 8.1) werden zusammen vorgestellt, da ihre Ergebnisse der transienten Transfektionen weitgehend identisch sind.
 
 

8.3.1 Cadmium- und Kobaltchlorid Induktoren

In der Abbildung 36 ist das Ergebnis der Tansfektionen des homologen 1300 bp HO-1- Fragmentes, durch die Metall-Induktoren (Cadmium- und Kobaltchlorid) stimuliert, dargestellt. Im Vergleich zu dem Reportergenkonstrukt allein (pxp2) ließ sich das homologe HO 1300 bp Fragment durch Cadmiumchlorid (1uM) 3-fach induzieren, wärend das HO 830 bp Fragment 2.3-fach stimuliert wird. Für die Transfektionsversuche wurde mit einer geringeren Cadmiumkonzentration gearbeitet, da die primären Hepatozyten gegenüber einer höheren Konzentration während des Versuchablaufes zu anfällig für Apoptose sind. Das homologe HO 1300 bp Fragment ließ sich, im Vergleich zu dem Reporterkonstrukt allein, ebenfalls durch Kobaltchlorid (100 uM) um das 5.6-fache stimulieren. Das HO 830 bp Konstrukt ließ sich durch Kobalt-II-Ionen um das 4.8-fache induzieren.
 
 
 
 
Abb.36: Transfektion der homologen HO-1-Promotor-Konstrukte 
Primäre Hepatozyten wurden mit den HO-1-Promotor-Konstrukten sowie mit dem Promotor- losen pxp2 Plasmid für 6 Stunden transfiziert und anschließend für 3 Stunden mit Cadmium- (1 uM) beziehungsweise mit Kobaltchlorid (100 uM) induziert. Der Induktionsfaktor wurde wie im Kapitel 8.3 des Ergebnisteils beschrieben bestimmt. 
  

8.3.2 Häm und t-Butylhydrochinon Induktoren

Das in Abbildung 37 dargestellte Ergebnis zeigt die Regulation der Häm und t-Butylhydrochinon stimulierten Transkription der beiden Promotor-Konstrukte. Im Vergleich zu dem Reportergenkonstrukt pxp2 allein ließen sich die homologen HO-1-Promotor-Konstrukte durch Häm (10 uM) stimulieren. Das HO 1300 bp Fragment ließ sich um das 3-fache exprimieren, während das HO 830 bp Konstrukt um das 2.5-fache induziert wurde. Durch das t-Butylhydrochinon wird das HO 1300 bp Fragment 4-fach und das HO 830 bp Fragment dominant um das 5-fache induziert.
 
 
 
 
Abb.37: Transfektion der homologen Reporterkonstrukte in primären Hepatozyten 
Die Hepatozyten wurden 24 Stunden nach ihrer Präparation mit den HO1-Promotor-Plasmiden sowie mit dem Promotor-losen Plasmid pxp2 für 6 Stunden transfiziert. Für jeweils 3 Stunden wurden die transfizierten Zellen mit Hämin (10 uM) oder t-Butylhydrochinon (t-BHC; 40 uM) stimuliert. 
  

8.3.3 Schilddrüsenhormon T3 als Induktor der Hämoxygenase 1-Promotor- Konstrukte

Die Transfektionen der homologen Reportergenkonstrukte in An- und Abwesenheit des Schilddrüsenhormons T3 erfolgte wie in Kapitel 8.2 und 8.3 dargestellt. Die Inkubationszeit mit dem Schilddrüsenhormon beträgt 3 und 18 Stunden. Durch Untersuchungen in unserem Labor, durch Frau Dr. Schneuer 1996, hat sich eine T3-Inkubationszeit von 18 Stunden für die Transfektion als besonders günstig erwiesen.
Das in der Abbildung 38 dargestellte Ergebnis zeigt die Regulation der T3-stimulierten (0.1 uM) Transkription der HO-Promotor-Konstrukte. Im Vergleich zu dem Reportergenkonstrukt allein ließen sich die beiden homologen Konstrukte (HO 1300 bp und 830 bp) durch T3 nach 3 Stunden nur um das 1- und 1.5-fache induzieren, während bei einer T3-Inkubation über 18 Stunden beide HO-1-Konstrukte massiv um das 3fache induziert wurden.
 
 
 
 
Abb.38: T3-vermittelte Regulation der homologen HO-1-Promotor-Konstrukte 
Die primären Hepatozyten wurden mit den Reportergenkonstrukten und mit dem Promotor- losen pxp2 Plasmid für 6 Stunden transfiziert. Anschließend wurden die Zellen für 3 und 18 Stunden mit T3 (0.1 uM) stimuliert. Die Ermittlung des Induktionsfaktors erfolgte wie im Kapitel 8.3 des Ergebnisteils beschrieben.