IV. Ergebnisse
IV. Ergebnisse
1. Induzierbarkeit der Hämoxygenase
1 in kultivierten Hepatozyten auf der RNA-Ebene
Die Induzierbarkeit der Hämoxygenase 1 durch
anorganische Metalle und anderer zum Teil nicht verwandter, synthetischer
Substanzen wurde von einigen Arbeitsgruppen in permanenten Zellinien gezeigt
(Alam et al.,1989; Taketani et al.,1991 und Mitani et al.,1993).
Bei Untersuchungen am Gesamtorganismus läßt
sich häufig nicht erkennen, ob der durch die Agentien ausgelöste
Effekt tatsächlich eine Folge der Stimulierung ist, oder aber erst
sekundär durch die Induktion anderer Signale zustande kommt. Hier
können Experimente an isolierten Zellsystemen aussagekräftigere
Daten liefern, da sich in isolierten Zellsystemen die Bedingungen optimaler
einstellen lassen und dadurch ein konstanterer Status gewährleistet
ist.
Zur Anwendung kommen hierbei entweder etablierte
Zellinien transformierter Zellen, die teilungsfähig und permanent
kultivierbar sind, oder primäre Zellkulturen, die direkt aus dem Gewebe
präpariert werden und nur über einen begrenzten Zeitraum kultivierbar
sind. Transformierte Zellen stimmen in ihren Eigenschaften weitgehend mit
neoplastischen, also Tumorzellen überein. Da Tumorzellen gegenüber
normalen Zellen häufig ein stark verändertes Expressionsmuster
aufweisen, sind sie für Untersuchungen physiologischer Fragestellungen
weniger geeignet als primäre Zellkulturen. Zur Untersuchung der Hämoxygenase
1 wurden deshalb primäre Hepatozytenkulturen verwendet.
Abb.12: |
Kultivierte primäre Hepatozyten der Ratte
(24 Stunden alt)
Die Zellen wurden in einer Dichte von 1.1x106
ausplatiert. Außer für die transienten Transfektionen wurden
die Hepatozyten für die gesamten Versuche in Serum-freiem Medium kultiviert. |
1.1 Analyse des Cadmiumchlorides
als Induktor
In permanenten Zellinien (Hep3B und einer Hepatoma-Linie)
wurde von Mitani et al. die Wirkung von anorganischen Metallen (Zinnchloride,
Zinkchloride) auf die HO-1 ansatzweise untersucht. Ergebnisse der Hämoxygenase-Induktion
in Primärkulturen lagen noch nicht vor.
Primäre Hepatozytenkulturen wurden 24 Stunden
nach der Präparation für 0.5, 1.5, 3 und 6 Stunden mit 5 uM Cadmiumchlorid
stimuliert. Als Kontrolle diente die RNA unbehandelter primärer Hepatozyten.
Die Isolation der Gesamt-RNA und anschließende Northern Blot Analyse
sowie die Detektion der HO-1 mRNA erfolgten wie im Experimentellen Teil
beschrieben (Kapitel 5). Repräsentativ für alle weiteren Northern
Transfer Analysen diente als interne RNA-Konzentrations-Kontrolle die Hybridisierung
mit einer cDNA-Sonde des "housekeeping" Enzyms Katalase (CAT).
Abb.13: |
Relative Induktion der HO-1 mRNA
Das Balkendiagramm zeigt 10 ug der Gesamt-RNA
aus primären Hepatozyten, die für 0.5, 1.5, 3 und 6 Stunden mit
5 uM Cadmiumchlorid stimuliert wurden. Die x-fache Induktion der HO-1 mRNA
ermittelte sich aus dem Quotient der relativen Integratoreinheiten (in
%) von den induzierten Proben und den dazugehörigen Kontrollwerten.
Angegeben sind jeweils die Mittelwerte aus drei Experimenten (+/- SEM). |
Die Ergebnisse in der Abbildung 13 zeigen die
Induzierbarkeit der HO-1 in primären Hepatozyten. In den unbehandelten
Kontroll-Hepatozyten ist die HO-1 mRNA basal exprimiert, während Cadmiumchlorid
die HO-1-Expression bereits nach 1.5 Stunden stimuliert. Eine maximale
Induktion der HO-1 mRNA konnte nach 3 Stunden Stimulierung detektiert werden.
Weitere Zeitkinetikversuche zeigten, daß
die Cadmiumchlorid-Stimulierung über 12 Stunden konstant induzierend
auf die Hämoxygenase wirkt. 24 Stunden alte primäre Hepatozyten
wurden für 1.5 Stunden mit Cadmiumchlorid inkubiert. Anschließend
wurde das Medium gewechselt, um die toxischen Nebenwirkungen des Schwermetalles
auf die Hepatozyten zu reduzieren, und die Zellen wurden für weitere
4.5 und 10.5 Stunden inkubiert. Als Kontrolle diente die RNA unbehandelter
primärer Hepatozyten gleichen Zellalters, bei denen ebenfalls nach
1.5 Stunden ein Mediumwechsel stattfand. Die Zellernte und Präparation
der RNA erfolgte nach 6 und 12 Stunden (inkl. 1.5 Stunden Stimuli). Die
HO-1 mRNA unbehandelter Zellen wurde nur gering exprimiert, während
die mRNA stimulierter Zellen nach 6 und sogar noch nach 12 Stunden stark
exprimiert wurde (siehe Abbildung14).
Abb.14: |
Expression der HO-1 durch Cadmiumchlorid in
primären Hepatozyten
Die Abbildung zeigt 10 ug der Gesamt-RNA aus
primären Hepatozyten, die für 1.5 Stunden mit 5 uM Cadmiumchlorid
stimuliert und nach einem Mediumwechsel (MW) für weitere 4.5 ([Sigma]
6h) und 10.5 ([Sigma] 12) Stunden inkubiert wurden. Als interne Konzentrationskontrolle
diente die Hybridisierung mit der cDNA der Katalase (CAT). |
Um zu prüfen, ob es sich bei der Cadmiumchlorid
vermittelten Expression der HO-1 um einen direkten Effekt auf die Transkription
handelt, wurden Run-Off Transkriptionsmessungen durchgeführt.
Die Ergebnisse der Transkriptionsmessungen sind
in der Abbildung 15 dargestellt. Bei den unbehandelten Run-Off Transkripten
konnten auf den DNA-Kapillar-Membranen (Experimenteller Teil, Kapitel 4)
keine Signale verifiziert werden, während bei den Transkripten aus
den Cadmium-behandelten Hepatozytenkulturen ein eindeutiges Signal bei
der HO-1 cDNA zu verzeichnen ist. Als weitere Kontrolle wurden bei dem
DNA-Kapillar-Verfahren Präparate der cDNA Katalase und zwei Plasmidkonstrukte
des 5'-untranskribierten HO-1-Promotors aufgetragen. Bei dem HO 830 Basenpaar
(bp) Konstrukt konnte ein schwaches Signal gezeigt werden. Grund dafür
ist die Anwesenheit von 103 bp dieses HO-1-Fragmentes, das in dem translatierten
Bereich des Genes lokalisiert ist.
Abb.15: |
Run-Off Transkriptionsmessung der HO-1
Für den Nukleinsäure-Kapillar-Transfer
wurden 100 ng der cDNA HO-1, der internen Kontrolle Katalase (CAT) und
des 830 bp HO-1-Promotorkonstruktes, sowie als eine weitere Kontrolle 250
ng eines 5'-untranskribierten HO-1 Plasmides eingesetzt. |
1.2 Analyse des Kobaltchlorides
als Induktor
Die Induktionsfähigkeit des Kobaltchlorids auf
die HO-1-Expression wurde in den vergangenen Jahren vorwiegend in permanenten
Zellinien untersucht. Wie das Kobaltchlorid auf die Expression der HO-1
mRNA wirkt, konnte bisher noch nicht geklärt werden. Einige Arbeitsgruppen
diskutierten sogar (Eckardt et al., 1994), daß das zweiwertige Metall
in der Lage ist, das kovalent gebundene Eisen-II-Ion des Porphyrinringes
der Hämgruppe zu verdrängen und sich selbst an diese Stelle zu
setzen. Diese Hypothese konnte bisher nicht bestätigt werden. Andere
Arbeitsgruppen (Ehleben et al., 1997) diskutierten eine mögliche Regulation
des Induktors durch Interaktion des zweiwertigen Metalls mit dem zentralen
Eisenatom der Hämgruppe, was zu einem Wechsel des Redoxzustandes des
zentralen Eisenatoms (Fe2+ zu Fe3+ ) führt.
Beide Theorien beruhen auf einer Überführung des zentralen Hämgruppenmetalls
in eine Desoxy-Form, welche somit induzierend auf die Expression HO-1 wirkt.
24 Stunden alte primäre Hepatozytenkulturen wurden 2 und 4 Stunden
mit 100 uM Kobaltchlorid stimuliert. Als Kontrolle diente die RNA unbehandelter
Hepatozyten.
Es ließen sich die bereits von Immenschuh
et al. 1995 ermittelten Ergebnisse in primären Hepatozytenkulturen
reproduzieren (Abbildung 16): in den unbehandelten Präparaten ist
die HO-1 mRNA gering exprimiert, während das Kobaltchlorid die Expression
nach 2 Stunden maximal stimuliert.
Abb.16: |
Expression der HO-1 durch Kobaltchlorid in
primären Hepatozyten
10 ug der Gesamt-RNA aus primären
Hepatozyten, die für 2 und 4 Stunden mit 100 uM Kobaltchlorid inkubierten,
wurden in den Northern Transfer eingesetzt. Der Northern-Transfer und die
Hybridisierung erfolgte wie im Experimentellen Teil (Kapitel 5) beschrieben. |
1.3 Analyse des Hämoxygenase
1-Substrates Häm
Die Expressionsfähigkeit der HO-1 durch ihr
eigenes Substrat Häm stellt einen sehr interessanten Aspekt dar, weil
die Häm-vermittelte Induktion der HO-1 mRNA noch völlig unbekannt
ist. Besonders erwähnenswert ist die Kenntnis, daß andere ebenfalls
Häm-bindene Proteine wie das Hämopexin, nicht durch das Substrat
stimuliert werden können. Ausgangspunkt für diese Untersuchungen
war ebenfalls die Induzierbarkeit der HO-1 durch das Häm (Häminchlorid)
in den primären Hepatozyten. Alle bislang in der Literatur vorhandenen
Experimente wurden in permanenten Zellinien durchgeführt (Mitani et
al., 1993 und Immenschuh et al., 1995). Es stellt sich die Frage, in welcher
Art und Weise Häm die Induktion der HO-1 vermittelt und ob die transkriptionelle
Aktivierung der HO-1 über ein spezifisches DNA-Element erfolgt.
Primäre Hepatozytenkulturen wurden 24 Stunden
nach der Präparation für 2, 4 und 6 Stunden mit 10 uM Häm
(Häminchlorid, C34H32ClFeN4O4)
stimuliert. Als Kontrolle diente die RNA nicht stimulierter Hepatozyten.
Die Ergebnisse der kinetischen Untersuchungen in den primären Hepatozyten
sind in der Abbildung 17 dargestellt. Die Arbeitsgruppe um Immenschuh zeigte
eine Expression der HO-1 nach einer fünfstündigen Inkubation
mit dem Substrat Häm. Bei den kinetischen Ansätzen in den Primärkulturen
konnte bereits nach 2 Stunden Stimulus eine eindeutige Expression der HO-1
mRNA verifiziert werden, die nach 4 Stunden eine maximale Expression zeigt.
In den unbehandelten Präparaten ist die HO-1 mRNA kaum zu detektieren.
Abb.17: |
Häm-vermittelte relative Induktion der
HO-1 mRNA
Das Balkendiagramm zeigt 10 ug der Gesamt-RNA
aus primären Hepatozyten die für 2, 4 und 6 Stunden mit dem HO-1-Subtrat
Häm (10 uM) stimuliert wurden. Die x-fache Induktion der HO-1 mRNA
ermittelte sich aus dem Quotienten der relativen Integratoreinheiten (in
%) von den induzierten Proben und den dazugehörigen Kontrollwerten.
Angegeben sind jeweils die Mittelwerte aus drei Experimenten (+/- SEM). |
1.4 t-Butylhydrochinon als
Induktor der Hämoxygenase 1
1987 wurde von Müller et al. ein Teil des 5'-untranslatierten
Bereiches der HO-1 und die cDNA-Sequenzen veröffentlicht. In dem Promotor-Bereich
wurden mit Hilfe von käuflichen Computerprogrammen putative DNA-Bindungselemente
bestimmt. Unter anderem wurde ein Metall-responsiver Trankriptionsfaktor
1 (metal-responsive transcription factor 1) verifiziert. Dalton et al.
(1996) beschrieben eine Regulation des Metallothionein-Gens durch t-Butylhydrochinon
über ein Metall-responsives Element. Allerdings liegt in dem Metallothionein-Gen
dieses Element in einer fünffache Wiederholungssequenz vor. Bei der
HO-1 handelt es sich um eine einmalige Sequenz.
Um zu prüfen, ob das t-Butylhydrochinon induzierend
auf die HO-1 mRNA-Expression wirkt, wurden die 24 Stunden alten kultivierten
Hepatozyten für 3 und 6 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen
(20, 40 und 60 uM) des t-Butylhydrochinons (2-t-Butylbenzen-1,4-diol, C10H14O2)
stimuliert, da die in der Literatur angegebene Konzentration von 100 uM
für permanente Zellinien in den Primärkulturen toxisch wirkte.
Abb.18: |
Detektion der t-Butylhydrochinon-stimulierten
HO-1
10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten
wurden für 3 und 6 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen (
20, 40 und 60 uM) t-Butylhydrochinon stimuliert (t- BHC). Northern Transfer
Analysen und die Hybridisierungen mit spezifischen cDNA-Sonden erfolgte
wie im Experimentellen Teil (Kapitel 5) beschrieben. |
Die Ergebnisse in Abbildung 18 zeigen die Northern
Blot Analyse der t-Butylhydrochinon-inkubierten primären Hepatozyten.
Als Kontrolle diente die RNA unbehandelter Kulturen und bei der Detektierung
der mRNA wurde die Membran, wie in allen Versuchen, zusätzlich mit
der cDNA der Katalase als interne Auftragungskontrolle hybridisiert. Die
Kontroll-RNA der HO-1 ist kaum zu detektieren, während das t-Butylhydrochinon
die HO-1-Expression bereits nach 3 Stunden mit der geringsten Konzentration
von 20 uM stimuliert. Die anderen Konzentrationen (40 und 60 uM) wirkten
ebenfalls nach 3 Stunden induzierend auf die HO-1 mRNA. Die RNA-Präparate,
die 6 Stunden mit dem t-Butylhydrochinon stimuliert wurden, zeigten einen
weiteren Anstieg der HO-1-Expression bei allen Konzentrationen. Die Ergebnisse
zeigen, daß die HO-1 der mit 40 uM t-Butylhydrochinon behandelten
Hepatozyten am stärksten induziert wird, so daß alle weiteren
Untersuchungen mit dieser Konzentration durchgeführt wurden.
2. Analyse der Induzierbarkeit
der Hämoxygenase 1 auf der Protein-Ebene
2.1 Die Metalle: Cadmium-
und Kobaltchlorid
Analog zu den Untersuchungen auf der RNA-Ebene der
Hämoxygenase wurden Untersuchungen zu der Expression auf der Proteinebene
vorgenommen. Die bisherigen Expressions- und Aktivierungsstudien wurden
ausschließlich auf der RNA-Ebene untersucht und in der Literatur
gibt es viele Gene, die lediglich auf der RNA-Ebene induziert werden können,
ohne daß das dazugehörende Protein translatiert wird. Eine Untersuchung
der Induzierbarkeit der HO-1 auf der Protein-Ebene würde Hinweise
darauf geben, ob bei der Regulation des Enzyms noch post-translationelle
Modifikationen hinzukommen.
Für die kinetische Analyse der induzierten
Hämoxygenase auf der Proteinebene wurden 24 Stunden alte primäre
Hepatozyten für 2, 4 und 6 Stunden mit den Metallen stimuliert. Die
Zellen wurden mit PBS geerntet und 5 ng des Gesamt-Proteins pro Bedingung
aufgetragen. Als Kontrolle diente das Gesamt-Protein unbehandelter Primärkulturen.
Die Detektierung des Proteins auf den SDS-PAGE-Gelen erfolgte mit einem
rekombinant hergestellten "Rat Heme Oxygenase Protein SPP730" Antikörper.
In Abbildung 19 ist der kinetische Western-Semi-Dry-Blot dargestellt. Bei
den Präparaten der zweistündigen Cadmium- und Kobaltchlorid Behandlung
konnte kein Anstieg des Protein-Gehaltes festgestellt werden. Nach einer
vierstündigen Stimulierung wurde das Hämoxygenase-Protein verstärkt
translatiert. Bei einem Vergleich der Protein-Expression zwischen der vier-
und der sechsstündigen Stimulierung ist kein weiterer Anstieg der
Cadmiumchlorid induzierten Präparate festzustellen. Während bei
den Kobaltchlorid behandelten primären Hepatozyten zwischen dem 4
und 6 Stunden Stimulus ein, wenn auch nicht sehr starker, weiterer Anstieg
des Protein-Gehaltes verifiziert werden konnte.
Abb.19: |
Western Transfer Analyse der HO-1 Protein-Expression
Dargestellt sind 5 ng des Gesamt-Proteins aus
primären Hepatozyten, die für 2, 4 und 6 Stunden entweder mit
5 uM Cadmium- oder mit 100 uM Kobaltchlorid inkubiert wurden. SDS-PAGE
und Western Transfer Analysen erfolgten wie im Experimentellen Teil (Kapitel
10.2) beschrieben. |
2.2 Häm- und t-Butylhydrochinon-vermittelte
Protein-Expression
Die Untersuchungen auf der Protein-Ebene der HO-1,
stimuliert durch Häm und dem t-Butylhydrochinon, erfolgte mit identischen,
kinetischen Ansätze, wie bei den Metall-induzierten Proben. Primäre
Hepatozyten wurden 24 Stunden nach ihrer Kultivierung für 2, 4, 6
und 8 Stunden mit Häm (10 uM) oder mit 40 uM des t-Butylhydrochinons
stimuliert. Beide Induktoren sind in der Lage, nach einer zweistündigen
Stimulierung den HO-1 Protein-Gehalt hoch zu regulieren. Der deutliche
Anstieg des Proteins nach 4 Stunden (durch Häm und t-Butylhydrochinon)
ist nach 6 und 8 Stunden Stimulierung noch immer maximal induziert. Als
Kontrolle diente das Gesamt-Protein unbehandelter primärer Hepatozyten.
Die Ergebnisse der kinetischen Western Transfer
Analysen zeigen in der Abbildung 20 eine maximale Expression des HO-1 Proteins
durch die Induktoren Häm und t-Butylhydrochinon.
Abb.20: |
Kinetische Western Transfer Analyse des HO-1-Proteins
Detektion von 5 ng des Gesamt-Proteins
aus primären Hepatozyten, die für 2, 4, 6 und 8 Stunden entweder
mit 10 uM Hämin oder 40 uM t-Butylhydrochinon (t-BHC) stimuliert wurden. |
3. Amplifikation von cDNA-Abschnitten
des c-Fos- und c-Jun- Genes mit geeigneten Primer-Paaren
Von der Forschergruppe Oguro et al. (1996) wurde
ein Zusammenhang der HO-1 Induktion mit der gleichzeitigen Stimulierung
des c-Jun-Genproduktes hergestellt. Das c-Jun gehört zu der Transkriptionsfaktorklasse
der Leuzin-Zipper Motive, zu denen ebenfalls das c-Fos gehört. Diese
Proteine sind in der Lage, als Homodimere (c-Jun/c-Jun) oder auch als Heterodimere
(c-Jun/c-Fos) an das entsprechende DNA-Element zu binden. Aus diesem Grund
wurden definierte cDNA-Bereiche dieser beiden Transkriptionsfaktoren mit
geeigneten Primer-Paaren (siehe Anhang 1) mit Hilfe der PCR aus der genomischen
Bank der Ratte amplifiziert. Der schematische Aufbau der Plasmidkonstrukte
ist in Abbildung 21 dargestellt. Beide Genabschnitte (c-Jun und c-Fos)
wurden in den A/T-Klonierungsvektor pT7 eingebracht (siehe Experimenteller
Teil, Kapitel 7.2).
Abb.21: |
Schematischer Aufbau der c-Jun- und c-Fos-cDNA-Plasmide
Die Klonierung der PCR-amplifizierten cDNA-Fragmente
des c-Jun- und c-Fos-Genes erfolgte in den PCR-Vektor pT7Blue in die T-cloning
site zwischen den Restriktionsendonukleasen EcoR I und BamH I. |
3.1 Untersuchung der c-Jun-
und c-Fos-Expression in t-Butylhydrochinon- induzierten primären Hepatozyten
Um zu zeigen, daß die Induktion der HO-1 mit
der gleichzeitigen Expression der Genprodukte c-Fos und/ oder c-Jun verläuft,
wurden die primären Hepatozytenkulturen 24 Stunden nach ihrer Präparation
für 6 Stunden mit 40 uM t-Butylhydrochinon stimuliert. Anschließend
wurde ein Teil der bereits behandelten Zellen 3 Stunden mit 20 mM des Antioxidanten
N-Acetylcystein (NAC) inkubiert. Als Kontrolle diente die Gesamt-RNA unstimulierter
primärer Hepatozyten. In Abbildung 22 ist die c-Jun Expression der
t-Butylhydrochinon-induzierten und NAC behandelten Präparate dargestellt.
Die Resultate der c-Fos Stimulierung werden nicht gezeigt, da keine erhöhte
Expression festgestellt werden konnte. Die Ergebnisse zeigen die eindeutige
Induktion des Transkriptionsfaktors c-Jun durch das t-Butylhydrochinon.
Diese eindeutige Expression läßt sich dominant durch den Antioxidanten
NAC reprimieren.
Abb.22: |
c-Jun-Expression in t-Butylhydrochinon behandelten
Zellen
Detektion von 10 ug Gesamt-RNA aus primären
Hepatozyten, die für 6 Stunden mit 40 uM t-Butylhydrochinon (t-BHC)
und zusätzlich für 3 Stunden mit dem Antioxidanten N- Acetylcystein
(NAC, 20mM) ohne Mediumwechsel behandelt wurden ([Sigma] 9 Stunden Inkubationszeit).
Bei den NAC-Kontrollwerten wurden die Zellen nach 6 Stunden, gleichfalls
wie die zuvor stimulierten Proben, für 3 Stunden mit NAC inkubiert
([Sigma] 9 Stunden). Die Detektion der mRNA erfolgte mit einer spezifischen
cDNA-Sonde des c-Jun-Genes. |
Primäre Hepatozyten, die mit den anderen
Induktoren (Häm, Cadmium- und Kobaltchlorid) stimuliert wurden, zeigten
keine Expression des Transkriptionsfaktors c-Jun. Die entsprechenden Hybridisierungen
der t-Butylhydrochinon-stimulierten Northern Transfer Analysen mit der
c-Fos cDNA-Sonde zeigen keine Expression des Transkriptionsfaktors. Negativ
ist die c-Fos-Expression ebenfalls in den Häm, Cadmium- und Kobaltchlorid
behandelten primären Hepatozyten.
4. Reprimierbarkeit der induzierten
Hämoxygenase 1 durch Antioxidanten
Die HO-1 wird in der Literatur als ein Streß-induziertes
Protein beschrieben (Sato et al.,1993), dessen Induzierbarkeit durch eine
Vielzahl von Agentien erfolgen kann (z.B. durch Hitzeschock, UV-Licht,
Radikale, Wasserstoffperoxid und oxidative Veränderungen der Zelle,
verschiedene Metalle und verschiedene Metallporphyrine).
Um festzustellen, ob die Stimulierung der HO-1
durch die Induktoren Cadmium-, Kobaltchlorid, Häm und t-Butylhyhydrochinon
unter oxidativer Veränderung in den primären Hepatozyten verläuft,
wurden Antioxidanten co-inkubiert. Durch die Zugabe der Antioxidanten soll
die Wiederherstellung der Balance zwischen den Oxidanten und den Antioxidanten
der Zelle demonstriert werden.
4.1 Reprimierbarkeit der
Metall-induzierten Hämoxygenase 1 durch N- Acetylcystein (NAC)
Das N-Acetylcystein (NAC) ist die Vorstufe des zellulären
Antioxidanten Glutathion (GSH). Das Glutathion spielt eine bedeutende Rolle
bei zellulären Entgiftungsvorgängen der Radikale und stellt für
die Zelle ein Sulfhydryl-Puffersystem dar ( siehe Einleitung, Kapitel 5.2).
Wenn das NAC zugegeben wird, geht man davon aus, daß die Expression
der HO-1 mRNA (als ein unter oxidativem Streß induziertes Enzym)
reprimiert wird.
Cadmium-induzierte primäre Hepatozyten
Kultivierte primäre Hepatozyten wurden 24
Stunden nach ihrer Präparation für 1.5 Stunden mit Cadmiumchlorid
(5 uM) stimuliert. Anschließend erfolgte ein Mediumwechsel, um noch
vorhandenes Metall aus dem Puffer zu erntfernen, da zweiwertige Metall-Ionen
durch die Sulfhydrylgruppen des N-Acetylcysteins gebunden werden können.
Durch die Metall-Schwefel-Bindung würde keine Aussage über die
antioxidative Wirkung des NACs in den primären Hepatozyten getroffen
werden können. Nach dem Mediumwechsel wurden die Primärkulturen
für 6 bzw. 12 Stunden (inklusiv 1.5 Stunden Stimulus) inkubiert. Als
Kontrolle dient die Gesamt-RNA unbehandelter Hepatozyten, die gleichfalls
einen Mediumwechsel nach einer 1.5-stündigen Inkubation hatte.
In der Abbildung 23 ist der Northern Blot der
Cadmium-induzierten und der NAC-reprimierten HO-1 mRNA dargestellt. Die
Ergebnisse veranschaulichen, daß die nach 6 Stunden (1.5 Stunden
Cadmiumchlorid, Mediumwechsel und 4.5 Stunden NAC) geernteten Zellen eine
geringfügige Reprimierung der induzierten HO-1 mRNA zeigen, während
die nach 12 Stunden (1.5 Stunden Metall, Mediumwechsel und 10.5 Stunden
NAC) geernteten Gesamt-RNAs eine deutliche Reprimierung der Cadmium-vermittelten
Stimulierung der HO-1 demonstrieren. Die Experimenten zeigen, daß
eine Reprimierbarkeit der induzierten HO-1 erst nach einer sehr langen
(10.5 Stunden) Inkubation mit dem Antioxidanten NAC erzielt werden konnte.
Abb.23: |
Repression der HO-1-Expression in primären
Hepatozyten
Dargestellt sind 10 ug der Gesamt-RNA aus primären
Hepatozyten, die für 1.5 Stunden mit Cadmiumchlorid (5 uM) stimuliert
und nach einem Mediumwechsel (MW) für weitere 4.5 ([Sigma] 6) und
10.5 Stunden ([Sigma] 12 Stunden Inkubationszeit) mit dem Antioxidanten
NAC (20 mM) inkubiert wurden. |
Kobaltchlorid-induzierte primäre Hepatozyten
Um die Reprimierbarkeit der induzierten HO-1
mit dem Antioxidanten auch noch für das Kobaltchlorid zu demonstrieren,
wurden kultivierte primäre Hepatozyten für 0.5, 1.5 und 2 Stunden
mit Kobaltchlorid stimuliert. Anschließend wurde das Medium aller
Versuchskulturen gewechselt und für weitere 2 Stunden wurde NAC den
Zellen dargereicht. Der gleiche Versuchsansatz wurde mit Cadmium-induzierten
Hepatozyten durchgeführt. Die Zellen wurden bei gleichem Zellalter,
nach maximal 4 Stunden geerntet. Die Ergebnisse der Versuche, die eine
Inkubationszeit des NACs von 2 Stunden aufweisen, zeigten keine Reprimierbarkeit
der induzierten HO-1. Das läßt die Vermutung zu, daß der
Antioxidant NAC einen längeren Zeitraum (10.5 Stunden) benötigt,
um das Gleichgewicht zwischen den Oxidanten und Antioxidanten in den Cadmium-
und Kobaltchlorid stimulierten primären Hepatozyten wieder herzustellen.
4.2 Reprimierbarkeit der
Häm und t-Butylhydrochinon induzierten Hämoxygenase 1 durch N-Acetylcystein
(NAC)
Um gleichfalls eine Reprimierung der HO-1 mRNA-Expression
durch den Antioxidanten NAC bei den Häm und den t-Butylhydrochinon
behandelten primären Hepatozyten zu demonstrieren, wurden die Primärkulturen
24 Stunden nach ihrer Kultivierung für 3 Stunden mit Häm und
für 6 Stunden mit t-Butylhydrochinon stimuliert. Anschließend
wurden die Zellen 3 Stunden mit 20 mM NAC inkubiert. Als Kontrolle diente
die Gesamt-RNA unstimulierter und nur mit NAC behandelter Hepatozyten.
Abb.24A: |
HO-1-Repression durch NAC in primären
Hepatozyten (Häm-Stimulierung)
Die Abbildung zeigt eine Northern Transfer Analyse
mit 10 ug Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten, die für 3 Stunden
mit Hämin (10 uM) induziert und zusätzlich ohne Mediumwechsel
für 3 Stunden mit NAC (20 mM) inkubiert wurden ([Sigma] 6 Stunden). |
Die Ergebnisse der Reprimierungsexperimente mit
dem Antioxidanten NAC sind in den Abbildungen 24A und 24B veranschaulicht.
In der Abbildung 24A ist die Northern Blot Analyse der Häm induzierten
und NAC behandelten HO-1 dargestellt. Abbildung 24B zeigt die t-Butylhydrochinon-induzierten
und NAC behandelten Präparate. Die Ergebnisse zeigen, daß sich
die HO-1 mRNA der Häm und der t-Butylhydrochinon induzierten Präparate
eindeutig durch den Glutathion (GSH) Vorläufer NAC reprimieren lassen.

Abb.24B: |
HO-1-Repression durch NAC in primären
Hepatozyten (t-Butylhydrochinon- Stimulierung)
Northern Transfer Analyse mit 10 ug der Gesamt-RNA
aus primären Hepatozyten, die für 6 Stunden mit t-Butylhydrochinon
(t-BHC; 40 uM) und zusätzlich für weitere 3 Stunden mit NAC (20
mM) inkubiert wurden ([Sigma] 9 Stunden). Bei der NAC-Kontrolle wurden
die Zellen nach 6 Stunden, gleichfalls wie die zuvor stimulierten Proben,
für 3 Stunden mit NAC inkubiert ([Sigma] 9 Stunden). |
4.3 Reprimierbarkeit der
Häm und t-Butylhydrochinon induzierten Hämoxygenase 1 durch den
Antioxidanten a-Tocopherol (Vitamin E)
In der Literatur wurde in den bisherigen Arbeiten
über die HO-1 lediglich über eine Reprimierbarkeit des bereits
induzierten Enzyms durch NAC diskutiert. Um die Ergebnisse der Glutathionvorstufe
NAC abzurunden, wurde ein zweiter zellulärer Antioxidant ausgewählt.
Das a-Tocopherol schützt die Zellmembranen vor einer Lipid-Peroxidation
durch Radikale (siehe Einleitung, Kapitel 5.2).
Um eine Reprimierung der stimulierten HO-1 durch
a-Tocopherol deutlich zu machen, wurden die kultivierten primären
Hepatozyten 24 Stunden nach ihrer Präparation für 3 Stunden wahlweise
mit Häm oder t-Butylhydrochinon stimuliert. Ein Teil der Zellen erhielt
nach der Stimulation mit den entsprechenden Induktoren 1 bzw. 2 uM a-Tocopherol
für 3 Stunden, um die HO-1 mRNA zu reprimieren. Als Kontrolle diente
die Gesamt-RNA unbehandelter primärer Hepatozyten. Die Isolation der
RNA und der anschließende Northern Transfer, sowie die Detektion
der HO-1 mRNA erfolgte wie im Experimentellen Teil (Kapitel 5) beschrieben.
Abb.25: |
Repression der induzierten HO-1 durch den
Antioxidanten a-Tocopherol
A und B stellen die Northern Transfer
Analysen von 10 ug der Gesamt-RNA aus primären Hepatozyten dar. Die
Präparate wurden für 3 Stunden mit 10 uM Hämin (A)
und mit 40 uM t-Butylhydrochinon (t-BHC) (B) induziert. Anschließend
wurden die stimulierten Hepatozyten zusätzlich für weitere 3
Stunden mit verschiedenen Konzentrationen (1 und 2 uM) des Antioxidanten
a-Tocopherol (a-Toc) inkubiert ([Sigma] der Inkubationszeit 6 Stunden).
Bei den a-Tocopherol-Kontrollwerten wurden die Zellen nach 3 Stunden, gleichfalls
wie die zuvor stimulierten Proben, für 3 Stunden mit a-Tocopherol
inkubiert ([Sigma] 6 Stunden). |
Die Ergebnisse der a-Tocopherol reprimierten HO-1
mRNA sind in der Abbildung 25A und B dargestellt. Die Abbildung 25A zeigt
die Detektion der HO-1 mRNA im Northern Transfer durch Häm stimulierte
Zellen, während Abbildung 25B die HO-1 mRNA t-Butylhydrochinon-induzierter
Proben darstellt. In den unbehandelten Kontrollen ist die HO-1 mRNA kaum
zu detektieren, während Häm und das t-Butylhydrochinon die HO-1-Expression
maximal stimuliert. Die Ergebnisse demonstrieren, daß der positive
Induktionseffekt der Induktoren durch a-Tocopherol (1 und 2 uM) dominant
negativ reprimiert werden kann.
5. Reprimierbarkeit der Hämoxygenase
1 durch Inhibitoren der respiratorischen Kette
Die Atmungskette, ein Teilprozeß der oxidativen
Phosphorylierung, katalysiert den Transport von Elektronen von NADH oder
reduziertem Ubichinon auf molekularen Sauerstoff (O2). Für
die vollständige Reduktion des Sauerstoffes zu Wasser (H2O)
werden vier Elektronen auf den Sauerstoff übertragen und dabei gleichzeitig
als Ausgleich Protonen von der Matrix zur inneren zytosolischen Seite der
inneren Mitochondrienmembran gepumpt. Die Reduktion des Sauerstoffes offenbart
allerdings das Problem, daß eine partielle Reduktion des Sauerstoffes
zu außerordentlich reaktiven Verbindungen führt. Ein Beispiel
für eine solche Verbindung ist das Superoxianionradikal (O2-
.) das durch die Superoxid-Dismutase abgebaut wird. Hydroperoxide
bzw. Wasserstoffperoxid werden von der Katalase abgebaut.
Bei "hohen" Konzentrationen von Sauerstoffradikalen
sind diese Enzyme nicht mehr in der Lage, schnell genug die reaktiven Metabolite
abzubauen. Offensichtlich werden effektivere zelluläre Schutzmechanismen
aktiviert. Möglicherweise spielt unter diesen extremen Bedingungen
die Expression der HO-1 bei dem zellulären Schutzsystem der primären
Hepatozyten eine wichtige Rolle.
Um eine Beteiligung der Mitochondrien bei der
Induktion der HO-1 zu belegen, müßte eine Inhibierung der mitochondrialen
Funktionen zu einer Reprimierung bzw. Inhibierung des entspechenden Gens
verlaufen. Die Inhibitoren, die hierfür verwendet wurden, waren Rotenon
und Antimycin A. Rotenon ist ein Inhibitor der Elektronenpumpe für
den Komplex 1 der Atmungskette, der die spezifische Elektronenübertragung
innerhalb des NADH-Q-Reduktase-Komplexes hemmt, während das Antimycin
A ein Inhibitor für den Komplex 2 der Atmungskette darstellt, der
den Elektronenfluß zwischen den Cytochromen b1 und c verhindert.
5.1 Inhibierung der Metall
induzierten Hämoxygenase 1 durch Rotenon
Primäre Hepatozyten wurden 24 Stunden nach ihrer
Kultivierung für 2 Stunden mit Cadmiumchlorid (5 uM) bzw. mit Kobaltchlorid
(100 uM) stimuliert. Ein Teil der Zellen erhielt für weitere 2 Stunden
nach der Stimulation 10 uM des respiratorischen Inhibitors Rotenon, um
die HO-1 mRNA-Synthese zu beeinflussen. Als interne Kontrolle diente die
RNA unbehandelter Hepatozyten.
Durch die Inhibierung des Atmungskettenkomplexes
1 durch Rotenon konnte die Cadmium- und Kobaltchlorid induzierte HO-1 mRNA-Expression
massiv reprimiert werden.
In der Abbildung 26 sind die Ergebnisse der Reprimierungsexperimente
einer Kobalt-induzierten HO-1 mRNA dargestellt (der Induktor Cadmium liefert
die gleichen Ergebnisse): in der unbehandelten Kontrolle und in den Proben,
die ausschließlich Rotenon bekamen, ist die HO-1 mRNA gering exprimiert,
während Kobaltchlorid die Expression stimuliert. Dieser positive Induktionseffekt
wird durch die Zugabe von Rotenon dominant reprimiert. Diese Ergebnisse
zeigen, daß eine durch die Metall-Ionen induzierte HO-1 mRNA sukkzessiv
durch die gleichzeitige Inkubation mit dem Inhibitor Rotenon reprimiert
wird und damit die Vermutung von einer Beteiligung der Mitochondrien während
einer HO-1-Induktion zuläßt.
Abb.26: |
Inhibierung der induzierten HO-1 durch Rotenon
Northern Transfer Analysen von 10 ug der Gesamt-RNA
aus primären Hepatozyten, die für 2 Stunden mit Kobaltchlorid
(100 uM) stimuliert und anschließend für weitere 2 Stunden mit
dem Atmungsketteninhibitor Rotenon (10 uM) inkubiert wurden ([Sigma] 4
Stunden). Bei der Rotenon-Kontrolle wurden die Zellen nach 2 Stunden, gleichfalls
wie die zuvor stimulierten Proben, für 2 Stunden mit Rotenon inkubiert
([Sigma] 4 Stunden). |
5.2 Inhibierung der Häm-induzierten
Hämoxygenase 1 durch Rotenon
Um eine Beteiligung der mitochondrialen Atmungskette
gleichfalls für eine Häm induzierte HO-1 zu demonstrieren, wurden
kultivierte primäre Hepatozyten (24 Stunden alt) für 2.5 und
5 Stunden mit 10 uM Häm stimuliert. Ein definierter Teil der Zellen
erhielt nach der Induktion 10 uM des Inhibitors Rotenon für je 1 Stunde.
Als Kontrolle diente hier wiederum die RNA unbehandelter primärer
Hepatozyten. Die Isolation der Gesamt-RNA und der anschließende Northern
Transfer sowie die Detektion der HO-1 mRNA erfolgte wie im Experimentellen
Teil (Kapitel 5) beschrieben.
Die Ergebnisse der Rotenon-Reprimierung der Häm
induzierten HO-1 sind in der Abbildung 27 dargestellt. Bei den unbehandelten
Kontrollen ist die HO-1 mRNA basal exprimiert, während, wie in 1.3
demonstriert, Häm die Expression stimuliert. Dieser Häm-Effekt
läßt sich eindeutig durch die Zugabe von Rotenon reprimieren.
Abb.27: |
Inhibierung der Häm-induzierten Hämoxygenase
1
10 ug der Gesamt-RNA aus kultivierten Hepatozyten
wurden für 2.5 und 5 Stunden mit Hämin (10 uM) stimuliert und
im Anschluß für jeweils 1 Stunde mit dem Inhibitor Rotenon co-
inkubiert ([Sigma] 3.5 und 6 Stunden Inkubationszeit). Bei der Rotenon-Kontrolle
wurden die Zellen nach 5 Stunden, gleichfalls wie die zum gleichen Zeitpunkt
stimulierten Proben, für 1 Stunde mit Rotenon inkubiert ([Sigma] 6
Stunden). |
5.3 Inhibierung der induzierten
Hämoxygenase 1 durch Antimycin A
Um die Ergebnisse des respiratorischen Inhibitors
Rotenon abzurunden, wurde eine weitere Versuchsreihe mit dem zweiten Atmungsketteninhibitor
Antimycin A durchgeführt.
Die in Kapitel 4.2 erläuterten Ergebnisse
konnten mit dem Inhibitor Antimycin A, der hemmend auf den Atmungskettenkomplex
2 wirkt, reproduziert werden. In den Untersuchungen wurden die primären
Hepatozyten 24 Stunden nach ihrer Präparation für 2.5 bis 3 Stunden
mit den entsprechenden Induktoren stimuliert. Ein Teil der Zellen erhielt
nach der Induktion 0.2 uM Antimycin A für jeweils 1 Stunde. Ebenfalls
diente hier die Gesamt-RNA unbehandelter und die Gesamt-RNA Antimycin A
behandelter primärer Hepatozyten als Kontrolle. Es ließen sich
die Ergebnisse der Rotenon reprimierten Experimente bestätigen. Die
Ergebnisse demonstrieren, daß der Inhibitor Antimycin A gleichfalls
in der Lage ist, dominant die durch Häm, Cadmium- oder Kobaltchlorid
stimulierte HO-1 zu reprimieren.
Inhibierung der t-Butylhydrochinon-induzierten
Hämoxygenase 1 durch Rotenon und Antimycin A
Dieser reprimierende Effekt der Atmungsketteninhibitoren
Antimycin A und Rotenon auf die HO-1 mRNA-Expression sollte im Anschluß
noch für den Induktor der HO-1 t-Butylhydrochinon demonstriert werden.
Aus diesem Grund wurden 24 Stunden alte primäre Hepatozyten für
4 Stunden mit 40 uM t-Butylhydrochinon induziert. Ein Teil der Hepatozyten
erhielt nach der Stimulierung 10 uM Rotenon für 2 Stunden. Gleichfalls
diente hier als Kontrolle die RNA unbehandelter und die RNA nur Rotenon
behandelter primärer Hepatozyten. Die Ergebnisse der Experimente zeigten,
daß das t-Butylhydrochinon die HO-1-Genexpression maximal stimuliert,
während diese Induktion durch die Zugabe des respiratorischen Inhibitors
Rotenon nicht reprimiert werden kann. Das gleiche Ergebnis konnte mit dem
zweiten Atmungsketteninhibitor Antimycin A festgestellt werden, der ebenfalls
keine Reprimierung der bereits t-Butylhydrochinon induzierten HO-1 mRNA
zeigt.
6. Adenosintriphosphat-(ATP)-Gehalt
der primären Hepatozyten
Das Adenosintriphosphat (ATP) fungiert durch sein
hohes Phosphorylgruppenüber-tragungspotential als Energiequelle für
die verschiedensten zellulären Vorgänge. Das ATP wird durch die
Oxidation von Brennstoffmolekülen wie Glukose, Fettsäuren und
Aminosäuren erzeugt. Das gemeinsame Zwischenprodukt bei den meisten
dieser Oxidationen ist das Acetyl-CoA. Die Kohlenstoffatome der Acetylgruppe
werden in dem Citratzyklus vollständig zu Kohlendioxid (CO2)
oxidiert, wobei gleichzeitig die Elektronen-Carrier NADH und FADH2
entstehen. Diese Elektronen-Carrier übertragen ihre energiereichen
Elektronen anschließend auf die Atmungskette. Der Elektronenfluß
zum Sauerstoff (O2) bewirkt, daß Protonen durch die innere
Mitochondrienmembran gepumpt werden. Dieser Protonengradient wird anschließend
zur ATP-Synthese benutzt (Stryer, 1990). Das ATP ist die universelle Energiequelle
einer Zelle und gibt gleichzeitig Auskunft über den zellulären
Zustand (z.B. der Mitochondrien).
Der ATP-Gehalt wurde gemessen, um den Einfluß
der HO-1-Induktoren auf den Gesamt-ATP-Gehalt der primären Hepatozyten
zu bestimmen und damit einen Einblick auf den zellulären Zustand der
Hepatozyten zu erhalten.
6.1 Bestimmung des ATP-Gehaltes
Cadmium-behandelter Hepatozyten
Für die Bestimmung des ATP-Gehaltes der primären
Hepatozytenkulturen wurden 24 Stunden alte Zellen für 2 und 4 Stunden
mit Cadmiumchlorid (5 uM) stimuliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte
primäre Hepatozyten. Die Ernte und Aufarbeitung der Zellen sowie die
Messung des ATPs erfolgte wie im Experimentellen Teil (Kapitel 11) beschrieben.
Die Ergebnisse der ATP-Messung unter Cadmiumchlorid
in den primären Hepatozyten ist in der Abbildung 28 dargestellt. In
den unbehandelten Kontrollextrakten ist der ATP-Gehalt gut meßbar.
Nach einer zweistündigen Cadmiumchlorid-Inkubation ist der ATP-Gehalt
leicht gesenkt (um das 1.4-fache), während nach einer vierstündigen
Inkubation der ATP-Gehalt sukkzessiv reprimiert ist (um das 28-fache).
Diese Ergebnisse zeigen, daß das Cadmiumchlorid einen massiven Einfluß
auf den Gesamt-ATP-Gehalt der primären Hepatozyten nimmt.
Abb.28: |
Relativer ATP-Gehalt der induzierten primären
Hepatozyten
Die Bestimmung des ATP-Gehaltes der Cadmiumchlorid
(5 uM) induzierten primären Hepatozyten erfolgte über 2 und 4
Stunden mit 50 uL der hepatischen Zellsuspension in einem Luminometer (siehe
Experimenteller Teil, Kapitel 11). |
6.2 Messung des ATP-Gehaltes
Kobaltchlorid-behandelter primären Hepatozyten
Um den Gesamt-ATP-Gehalt in den durch Kobaltchlorid
behandelten Primärkulturen zu bestimmen, wurden die Hepatozyten 24
Stunden nach ihrer Präparation für 2 und 4 Stunden mit 100 uM
Kobaltchlorid induziert. Die Proteinsuspension unbehandelter primärer
Hepatozyten diente als Kontrolle. In der Abbildung 29 ist das ATP-Balkendiagramm
Kobaltchlorid induzierter Hepatozyten dargestellt.
Das Ergebnis veranschaulicht, daß sich
durch eine Kobaltchloridbehandlung der primären Hepatozyten keine
Veränderung des ATP-Gehaltes nachweisen läßt. Selbst nach
einer vierstündigen Inkubationszeit ist der ATP-Gehalt vergleichbar
mit dem unbehandelter Zellen.
Abb.29: |
ATP-Gehalt Kobalt-induzierter primärer
Hepatozyten
Das Balkendiagramm zeigt die Analyse des ATP-Gehaltes
aus primären Hepatozyten (50 uL), die zuvor für 2 und 4 Stunden
mit Kobaltchlorid (100 uM) induziert wurden. |
6.3 Bestimmung des ATP-Gehaltes
Häm-induzierter primärer Hepatozyten
Die primären Hepatozyten wurden für die
Gesamt-ATP-Messung unter einer Hämbehandlung 24 Stunden nach ihrer
Kultivierung für 3 Stunden mit Häm (10 uM) stimuliert. Ein Teil
der Zellen erhielt nach der Stimulation für 1.5 Stunden 20 mM des
Antioxidanten N-Acetylcystein (NAC), um den eventuellen reprimierenden
Effekt der Hämbehandlung auf den ATP-Gehalt aufzuheben. Als Kontrolle
dienten Proteinextrakte unbehandelter primärer Hepatozyten.
In der Abbildung 30 ist der ATP-Gehalt der primären
Hepatozyten unter Häm dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß
in der unbehandelten Kontrolle der ATP-Gehalt während des Versuches
konstant bleibt, während Häm den ATP-Gehalt in den Zellen dominant
absenkt. Die Häm-behandelten Hepatozyten, bei denen anschließend
eine Zugabe von NAC erfolgte, zeigten nur einen geringfügigen Wiederanstieg
des ATP-Gehaltes.
Abb.30: |
ATP-Gehalt der Häm-stimulierten primären
Hepatozyten
Die Bestimmung des ATP-Gehaltes erfolgte in Hepatozyten,
die für 3 Stunden mit Hämin (10 uM) stimuliert wurden, wobei
ein Teil der Zellen anschließend mit dem Antioxidanten NAC (20 mM)
für weitere 1.5 Stunden co-inkubiert wurden. |
6.4 Messung des ATP-Gehaltes
in t-Butylhydrochinon-stimulierten Hepatozyten
Um zu prüfen, ob sich der Gesamt-ATP-Gehalt
der t-Butylhydrochinon behandelten primären Hepatozyten gleichfalls,
wie bei den Induktoren Cadmiumchlorid und Häm, massiv reprimiert,
wurden 24 Stunden alte Hepatozyten für 4 und 6 Stunden mit 40 uM t-Butylhydrochinon
induziert.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zu der Wirkung
des tert-Butylhydrochinons auf den ATP-Gehalt hepatischer Primärkulturen
zeigten, daß der Induktor keinen Einfluß auf den ATP-Spiegel
der hepatischen Zelle ausübt. Als Kontrolle dienten Proteinsuspensionen
unbehandelter Hepatozyten. In der Abbildung 31 ist das Balkendiagramm des
ATP-Gehaltes dargestellt. Das t-Butylhydrochinon zeigt keinen Einfluß
auf den ATP-Spiegel der behandelten Hepatozyten.
Abb.31: |
ATP-Gehalt in t-Butylhydrochinon-behandelten
Primärkulturen
Das Balkendiagramm zeigt die Analyse des ATP-Gehaltes
aus einer primären Zellsuspension (50 uL), die zuvor für 4 und
6 Stunden mit t-Butylhydrochinon (t-BHC; 40 uM) stimuliert wurde. |
7. Fluoreszenzanalyse der
reaktiven Sauerstoffzwischenstufen- Bildung in Hepatozyten mit dem Fluorenszesfarbstoff
Dihydrorhodamin 123
Die Fluoreszenzanalyse ist eine Sammelbezeichnung
für analytische Methoden, die die charakteristische Fluoreszenz bestrahlter
Verbindungen ausnutzen. Im engeren Sinn wird unter der Fluoreszenzanalyse
die Untersuchung und Identifizierung von Substanzen durch die Aufnahme
des Fluoreszenzspektrums (Fluoreszenzspektroskopie) ebenso wie die quantitative
Bestimmung fluoreszierender Verbindungen in z.B. Lösung durch Messung
ihrer Fluoreszenzintensität verstanden.
Reaktive Sauerstoffzwischenstufen (reaktive oxygen
intermediates, ROIs) sind in vielen biologischen Prozessen involviert.
Ein ansteigender Gehalt an freien Radikalen führt zu einem Versagen
des zellulären Schutzes. Freie Radikale sind unter anderem "second
messenger" (zweite Botenstoffe) für z.B. die Aktivierung des Transkriptionsfaktors
NF-[kappa]B und der Grund für Zellschädigung, wie z.B. der Lipidperoxidation.
Ein Zellschutzsystem gegen erhöhte Mengen an ROIs sind beispielsweise
die Überexpression von Mangan Superoxid-Dismutase (MnSOD), Radikaleinfangmechanismen
(GSH, Vitamin E), Eisenchelatoren und Inhibitoren oder Eliminatoren der
mitochondrialen Elektronentransportkette.
Um die Anreicherung der ROIs in den Mitochondrien
der primären Hepatozyten unter oxidativem Streß zu analysieren,
wurde der ROI-spezifische, mitochondriale Fluoreszenzmarker Dihydrorhodamin
123 (DHR 123) eingesetzt (Goossens et al., 1995). Die durch die ROI-Bildung
angeregte Floureszenz kann an individuellen primären Hepatozyten mit
Hilfe einer konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie (confocal laser scanning
microscopy, CLSM) analysiert werden und gibt Aussage über die zytotoxische
Antwort der Zelle auf oxidativen Streß. Das Zell-permeable, nicht
fluoreszierende Dihydrorhodamin 123 (DHR 123) wird durch die ROIs (hauptsächlich
Hydroxylradikale, Wasserstoffperoxid und Superoxidanionen) zu dem kationisch-fluoreszierenden
Farbstoff Rhodamin 123 (R 123) oxidiert, der ausschließlich durch
aktive Mitochondrien entfernt wird.
Mit Hilfe dieser Methode sollte die "Streßerzeugung",
die ROI-Anreicherung der Induktoren der HO-1 (Cadmium- und Kobaltchlorid,
Häm und t-Butylhydrochinon) erstmalig verifiziert werden.
7.1 Etablierung der Meßmethode
in den primären Hepatozyten
Zur Überprüfung, ob diese Methode für
die Detektierung der ROIs in primären Hepatozyten überhaupt geeignet
ist, wurden die Kulturen 24 Stunden nach ihrer Präparation für
10, 30, 60 und 90 min mit Wasserstoffperoxid (100 uM) stimuliert, als Positivkontrolle
für eine ROI-Anreicherung in der Zelle. Als weitere Kontrolle dienten
unbehandelte Zellen gleichen Alters. Das Dihydrorhodamin 123 (1 uM) wurde
während der Induktion mit Wasserstoffperoxid für 30 min co-inkubiert
und anschließend in einem konfokalen Laser-Scanning Mikroskop bei
488 nm angeregt und bei 550 nm detektiert (siehe Experimentelle Teil, Kapitel
3).
Es ließ sich die von Goossens et al. beschriebene
Methode erstmals in primären Hepatozyten reproduzieren (Abbildung
32). In der unbehandelten Kontrolle ist die Fluoreszens des Rhodamins 123
kaum zu detektieren, während in den Wasserstoffperoxid-behandelten
Hepatozyten nach bereits 30-minütiger Stimulation eine Akkumulation
des ROI-Farbstoffes zu detektieren ist. Wie erwartet, konnte das Wasserstoffperoxid
als Kotrolle für diese Methode in den primären Hepatozyten verwendet
werden.
Abb.32: |
Wasserstoffperoxid-vermittelte ROI-Akkumulation
Die primären Hepatozyten wurden für
30 min mit H2O2 (100 uM) stimuliert (B). In
A sind die nicht-induzierten Kontrollpräparate dargestellt
(30 min). |
7.2 Analyse der ROI-Akkumulation,
vermittelt durch Metall-Induktoren
Ein Zusammenhang zwischen der Entstehung von Radikalen
und zweiwertigen Metall-Ionen wurde in der Einleitung (Kapitel 9.2) bereits
angesprochen. Brennan & Schiestl (1996) beschrieben das Cadmium-II-Ion
als einen Induktor für oxidativen Streß in der Hefe Saccharomyces
cerevisiae. Die Anreicherung der freien Radikale durch die Wirkung
des Cadmiums in der Zelle und wahrscheinlich anderer zweiwertiger Metall-Ionen
(wie z.B. Kobalt-II-Ion) und die damit verbundene Induktion der Hämoxygenase,
als ein zellulärer Schutz gegen oxidativen Streß, würde
einen plausiblen Zusammenhang ergeben.
Kultivierte primäre Hepatozyten wurden 24
Stunden nach ihrer Präparation mit Cadmiumchlorid (5 uM) oder Kobaltchlorid
(100 uM) für 30, 60, 90 und 120 min stimuliert. Für die Kontrolle
dienten unbehandelte Hepatozyten, bei denen, wie bei den stimulierten Zellen,
Dihydrorhodamin 123 (1 uM) für 30 min co-inkubiert wurde.
Die Ergebnisse der Fluoreszenzanalysen zeigen
erstmalig die Bildung von ROIs bei der Zugabe von Cadmium- und Kobaltchlorid
(Abbildung 33, Seite 77): in den unbehandelten Kontrollen ist der Fluoreszenzfarbstoff
nur basal zu detektieren, während bereits eine 30-minütige Inkubation
der Hepatozyten mit den zweiwertigen Metall-Ionen die ROI-Anreicherung
maximal stimuliert. Bei beiden Metallen hält die Stimulierung des
Zellsystemes und die damit verbundene permanente Anreicherung mit reaktiven
Sauerstoffzwischenstufen 90 min an. Nach einer 120-minütigen Stimulierung
ist eine Abnahme der ROI-Bildung in den Cadmium-stimulierten primären
Hepatozyten zu verzeichnen, während die Anreicherung der ROIs in den
Kobalt-behandelten Zellen noch anhält (in der Abbildung 33 nicht gezeigt).
7.3 Analyse der ROI-Akkumulation,
vermittelt durch das Hämoxygenase 1- Substrat Häm und durch das
t-Butylhydrochinon
Eine Induktion der HO-1 wird durch ihr eigenes Substrat
Häm sowie durch das t-Butylhydrochinon vermittelt. In der Literatur
wurde das t-Butylhydrochinon (Dalton et al.,1996) als ein oxidativer Streß-Induktor
des Methallothionein-Gens diskutiert, während ein Zusammenhang des
Substrates Häm und der Bildung von ROIs in der Literatur bisher nur
andeutungsweise in Betracht gezogen worden war.
24 Stunden nach der Kultivierung wurden primäre
Hepatozyten für 30, 60, 90 und 120 min mit Häm (10 uM) oder t-Butylhydrochinon
(40 uM) stimuliert. Als Kontrolle dienten nicht stimulierte, DHR 123 behandelte
primäre Hepatozyten gleichen Zellalters.
In Abbildung 34 auf der Seite 78 sind die ROI-Anreicherungen
der Häm- und t-Butylhydrochinon behandelten primären Hepatozyten
dargestellt: in den unbehandelten Kontrollen ist der Fluoreszenzfarbstoff
kaum zu detektieren, während in den stimulierten Zellen eine dominante
Akkumulation des Farbstoffes zu verzeichnen ist. In den Häm behandelten
Hepatozyten ist eine Anreicherung der ROIs und damit eine verstärkte
Fluoreszenz nach 60 min Stimulation zu sehen (Abbildung 34, B). Diese Aktivierung
der reaktiven Sauerstoffspezies ist noch nach 90-minütiger Behandlung
festzustellen (Abbildung 34, E). In den t-Butylhydrochinon stimulierten
primären Hepatozyten zeigt sich, ebenfalls wie in den Häm stimulierten
Zellen, eine gesteigerte Fluoreszenz nach 60-minütiger Inkubation
mit dem Fremdstoff (Abbildung 34, C). Die Anreicherung der Hepatozyten
mit ROIs ist bei der t-Butylhydrochinon-Stimulierung noch 90 min (Abbildung
34, F) und sogar noch 120 min später deutlich zu detektieren (nicht
gezeigt). Es ließen sich die von Dalton et al. 1996 aufgestellten
Ergebnisse der oxidativen Streß-Eigenschaften des t-Butylhydrochinon
erstmals mit Hilfe der Flourenszensanalyse im individuellen Zellsystem
unter Laborbedingungen reproduzieren.
Abb.33: |
Cadmium- und Kobaltchlorid-induzierte ROI-Akkumulation
Bilder A und D zeigen die Kontrollmessungen,
B und E die Cadmiumchlorid- und C und F die Kobaltchlorid-induzierten Präparate
der primären Hepatozyten. |
Abb.34: |
Häm- und t-Butylhydrochinon-induzierte
ROI-Akkumulation
Bilder A und D zeigen die Kontrollmessungen,
B und E die Häm- und C und F die t-Butylhydrochinon-induzierten Präparate
der primären Hepatozyten. |
8. Untersuchung der transkriptionellen
Eigenschaften des Hämoxygenase 1-Promotors
Auf Grund der bisherigen Ergebnisse, bei denen eine
transkriptionelle Aktivierung der HO-1 mRNA durch die verschiedenen Induktoren
und ihre Beteiligung an der Bildung von ROIs in den primären Hepatozyten
nachgewiesen wurde, stellt sich die Frage, welche DNA-Bindungsmotive für
diese spezifische Aktivierung der HO-1 von Bedeutung sind.
Ein weiterer wichtiger Aspekt, auf den sich die
weiteren molekularen Regulationsuntersuchungen der HO-1 begründen,
ist die Schilddrüsenhormon abhängige Induktion der HO-1 mRNA-Expression.
Ausgangspunkt der hier durchgeführten Experimente ist die eindeutige
Abhängigkeit der HO-1 mRNA-Expression durch Schilddrüsenhormone
(3,5,3'-Triiod-L-thyronin, T3) in Northern Transfer Analysen.
Die Untersuchung regulatorischer Bereiche spezifischer
Gene erfolgt über Reportergene. Zu diesem Zweck werden die zu untersuchenden
Promotor-Abschnitte vor ein Reportergen kloniert, dessen Expression nun
unter Kontrolle dieser ausgewählten Sequenzen steht. Als Reportergen
geeignet sind Gene, deren Aktivität leicht meßbar ist und die
nicht in den verwendeten Zellinien selbst exprimiert werden. Als Reportergen
wurde hier Luciferase, ein Enzym des Feuerkäfers (Phonitus pyralis),
eingesetzt. Luciferase katalysiert die Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin,
bei der Energie in Form von Lumineszenz ensteht. Das emittierte Licht ist
der Menge an Luciferase proportional und damit ein Maß für die
Aktivität des dem Reportergen vorgeschalteten Promotors. Zwei Arten
von Reportergenkonstrukten werden unterschieden:
1. |
Heterologe Konstrukte enthalten neben dem Reportergen
noch zusätzlich einen minimalen Fremdpromotor, der alle zur Transkription
notwendigen regulatorischen Elemente wie TATA-, CCAT- und GC-Box enthält.
Durch Insertion anderer regulatorischen Elemente, wie z.B. responsive Sequenzen,
lassen sich deren modulierende Einflüsse auf die Transkription isoliert
untersuchen. |
2. |
Bei homologen Reportergenkonstrukten werden die
Promotorsequenzen der basalen Transkriptionsmaschinerie von dem zu untersuchenden
Gen selbst geliefert. Putative Elemente können so in ihrer natürlichen
Umgebung unter Berücksichtigung zusätzlicher eventuell vorhandener
Enhancer- oder Silencer-Sequenzen untersucht werden. |
8.1 Herstellung der homologen
Reporterkonstrukte: Amplifikation von Hämoxygenase 1-Promotorabschnitten
mit geeigneten Primern
Mit Hilfe der PCR wurden mit entsprechenden Primer-Paaren
(siehe Anhang I) die Promotorabschnitte der HO-1 aus der genomischen Bank
der Ratte amplifiziert. Die Primer waren an ihren 5'- und 3'-Enden mit
den Restriktionsendonukleasen Kpn I und Bgl II flankiert, über die
eine gerichtete Klonierung in den promotorlosen Vektor pxp2 (Nordeen, 1988),
der als Reportergen Luciferase enthielt, möglich war. Zwei verschieden
lange Promotorabschnitte konnten aus der genomischen Bank der Ratte amplifiziert
werden, ein 1300 Basenpaar (bp) und ein 830 bp Fragment. Der schematische
Aufbau der Reporterplasmide ist in der Abbildung 35 dargestellt.
Abb.35: |
Schematischer Aufbau der homologen HO-1-Promotor-Konstrukte
für die transienten Transfektionen |
8.2 Transfektionsexperimente
Die Reportergenkonstrukte wurden in Transfektionsexperimente
eingesetzt, um die Funktionalität der Promotorregionen zu überprüfen.
In derartigen Gentransfer-Experimenten läßt sich nachweisen,
ob die untersuchten Sequenzen tatsächlich in der Lage sind, die Transkription
durch Stimulation mit den entsprechenden Agentien (Cadmium- und Kobalt-Ionen,
Häm, tbHQ und Schilddrüsenhormon T3) zu modulieren. Bei den Experimenten
wurden primäre Hepatozyten verwendet. Zusätzlich wurde ein Expressionsplasmid
für die bakterielle [beta]-Galaktosidase beziehungsweise ein Expressionsplasmid
für die Renilla Luciferase co-transfiziert, die als interner Standard
zur Überprüfung der Transkriptionseffizienz dienten. Die primären
Hepatozyten wurden 24 Stunden nach ihrer Kultivierung mit der (Ca)3(PO4)2-Präzipitations-Methode
für 6 Stunden transfiziert. Anschließend wurde bei den Hepatozyten
ein Glycerolschock durchgeführt, um die Zellen für die Aufnahme
von DNA-Molekülen empfänglich zu machen. Daraufhin wurden die
Zellen für 3 Stunden stimuliert, wie im Experimentellen Teil (Kapitel
8) beschrieben.
8.3 Analyse der Hämoxygenase
1-Promotor-Fragmente
Im Allgemeinen gilt für alle Transfektionen,
daß zur Normalisierung der Transfektionseffizienz für jeden
Transfektionsansatz der Quotient aus den relativen Lichtunits der Luciferase
und den [beta]-Galaktosidase-Werten gebildet wurde. Das relative Verhältnis
dieser Expressionswerte in An- und Abwesenheit der entsprechenden Induktoren
der Hämoxygenase diente zur Ermittlung des Induktionsfaktors, der
damit ein Maß für die Induktor-abhängige Expression darstellt.
Die Ergebnisse der beiden Hämoxygenase Promotor-Fragmente
(HO 1300 bp und HO 830 bp, siehe Kapitel 8.1) werden zusammen vorgestellt,
da ihre Ergebnisse der transienten Transfektionen weitgehend identisch
sind.
8.3.1 Cadmium- und Kobaltchlorid
Induktoren
In der Abbildung 36 ist das Ergebnis der Tansfektionen
des homologen 1300 bp HO-1- Fragmentes, durch die Metall-Induktoren (Cadmium-
und Kobaltchlorid) stimuliert, dargestellt. Im Vergleich zu dem Reportergenkonstrukt
allein (pxp2) ließ sich das homologe HO 1300 bp Fragment durch Cadmiumchlorid
(1uM) 3-fach induzieren, wärend das HO 830 bp Fragment 2.3-fach stimuliert
wird. Für die Transfektionsversuche wurde mit einer geringeren Cadmiumkonzentration
gearbeitet, da die primären Hepatozyten gegenüber einer höheren
Konzentration während des Versuchablaufes zu anfällig für
Apoptose sind. Das homologe HO 1300 bp Fragment ließ sich, im Vergleich
zu dem Reporterkonstrukt allein, ebenfalls durch Kobaltchlorid (100 uM)
um das 5.6-fache stimulieren. Das HO 830 bp Konstrukt ließ sich durch
Kobalt-II-Ionen um das 4.8-fache induzieren.
Abb.36: |
Transfektion der homologen HO-1-Promotor-Konstrukte
Primäre Hepatozyten wurden mit den HO-1-Promotor-Konstrukten
sowie mit dem Promotor- losen pxp2 Plasmid für 6 Stunden transfiziert
und anschließend für 3 Stunden mit Cadmium- (1 uM) beziehungsweise
mit Kobaltchlorid (100 uM) induziert. Der Induktionsfaktor wurde wie im
Kapitel 8.3 des Ergebnisteils beschrieben bestimmt. |
8.3.2 Häm und t-Butylhydrochinon
Induktoren
Das in Abbildung 37 dargestellte Ergebnis zeigt die
Regulation der Häm und t-Butylhydrochinon stimulierten Transkription
der beiden Promotor-Konstrukte. Im Vergleich zu dem Reportergenkonstrukt
pxp2 allein ließen sich die homologen HO-1-Promotor-Konstrukte durch
Häm (10 uM) stimulieren. Das HO 1300 bp Fragment ließ sich um
das 3-fache exprimieren, während das HO 830 bp Konstrukt um das 2.5-fache
induziert wurde. Durch das t-Butylhydrochinon wird das HO 1300 bp Fragment
4-fach und das HO 830 bp Fragment dominant um das 5-fache induziert.
Abb.37: |
Transfektion der homologen Reporterkonstrukte
in primären Hepatozyten
Die Hepatozyten wurden 24 Stunden nach ihrer
Präparation mit den HO1-Promotor-Plasmiden sowie mit dem Promotor-losen
Plasmid pxp2 für 6 Stunden transfiziert. Für jeweils 3 Stunden
wurden die transfizierten Zellen mit Hämin (10 uM) oder t-Butylhydrochinon
(t-BHC; 40 uM) stimuliert. |
8.3.3 Schilddrüsenhormon
T3 als Induktor der Hämoxygenase 1-Promotor- Konstrukte
Die Transfektionen der homologen Reportergenkonstrukte
in An- und Abwesenheit des Schilddrüsenhormons T3 erfolgte wie in
Kapitel 8.2 und 8.3 dargestellt. Die Inkubationszeit mit dem Schilddrüsenhormon
beträgt 3 und 18 Stunden. Durch Untersuchungen in unserem Labor, durch
Frau Dr. Schneuer 1996, hat sich eine T3-Inkubationszeit von 18 Stunden
für die Transfektion als besonders günstig erwiesen.
Das in der Abbildung 38 dargestellte Ergebnis
zeigt die Regulation der T3-stimulierten (0.1 uM) Transkription der HO-Promotor-Konstrukte.
Im Vergleich zu dem Reportergenkonstrukt allein ließen sich die beiden
homologen Konstrukte (HO 1300 bp und 830 bp) durch T3 nach 3 Stunden nur
um das 1- und 1.5-fache induzieren, während bei einer T3-Inkubation
über 18 Stunden beide HO-1-Konstrukte massiv um das 3fache induziert
wurden.
Abb.38: |
T3-vermittelte Regulation der homologen HO-1-Promotor-Konstrukte
Die primären Hepatozyten wurden mit den
Reportergenkonstrukten und mit dem Promotor- losen pxp2 Plasmid für
6 Stunden transfiziert. Anschließend wurden die Zellen für 3
und 18 Stunden mit T3 (0.1 uM) stimuliert. Die Ermittlung des Induktionsfaktors
erfolgte wie im Kapitel 8.3 des Ergebnisteils beschrieben. |