Untersuchungen zur zellulären Antwort der Leber auf oxidativen Streß am Beispiel der Hämoxygenase 1:

 

Genexpression und funktionelle Promotorstudien

 
DISSERTATION
 
 
 
zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades

am Fachbereich Chemie der Universität Hamburg
 


 
vorgelegt von
 
 Alexandra Monington West
 
 aus Hamburg
 
 
Hamburg 1998



Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 1994 bis Mai 1998 am Institut für Physiologische Chemie in der Abteilung Biochemische Endokrinologie der Universität Hamburg unter Leitung von Prof. Dr. H.J. Seitz und Dr. T.M. Pillar angefertigt.
 

Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. T.M. Pillar für die Überlassung des Themas und der hilfreichen Unterstützung und Herrn Prof. Dr. H.J. Seitz für die Aufnahme in seiner Abteilung und für anregende Diskussionen.
 

Herrn Prof. Dr. H. Marquardt danke ich für die Vertretung der Arbeit gegenüber dem Fachbereich Chemie.
 
 
 
 

Erstgutachter: Prof. Dr. H. Marquardt
Zweitgutachter: Prof. Dr. H.J. Seitz

Rigorosum: 14. September 1998


 
Meinen Eltern
 

Es lohnt sich immer, eine Frage zu stellen, wenn es sich auch
nicht immer lohnt, eine Frage zu beantworten.
Oscar Wilde, Aphorismen (III, 192)


 
Laute Gunk-Musik plärrte und schepperte durch die Kommandozentrale der "Herz aus Gold", als Zaphod die Wellenbereiche des Sub-Etha-Radios nach irgendwelchen Nachrichten über sich absuchte. Das Gerät war ziemlich schwierig zu bedienen. Jahrelang hatte man bei Radios auf Knöpfe drücken und an Skalenrädern drehen müssen; als dann die Technik immer raffinierter wurde, machte man die Regler berührempfindlich - man brauchte die Schaltelemente nur noch mit den Fingern anzutippen. Jetzt aber mußte man nur noch mit einer Hand ungefähr in die Richtung des Apparates winken und hoffen. Das sparte natürlich eine menge Muskelkraft, hatte aber auch den Nachteil, daß man wahnsinnig still sitzen mußte, wenn man ein und dasselbe Programm drinbehalten wollte.
Douglas Adams, Per Anhalter durch die Galaxis

Inhaltsverzeichnis

I. Einleitung

1. Molekulare Prinzipien der Transkriptionsregulation
1.1 Promotor, Enhancer und Silencer
1.2 Transkriptionsfaktorklassen
1.2.1 Helix-Turn-Helix Motive
1.2.2 Zink-Finger Motive
1.2.3 Leucin-Zipper Motive
1.2.4 Weitere Bindungsprinzipien

2. Molekulare Wirkungsweise von Schilddrüsenhormonen
2.1 Physiologische Aspekte der Schilddrüsenhormone
2.2 Molekularer Wirkungsmechanismus

3. Oxidativer Streß und zelluläre Antioxidanten
3.1 Hitzeschock-Proteine
3.2 Oxidativer Streß
3.3 Zellulärer Schutz

4. Entdeckung und Charakterisierung der Hämoxygenase 1
4.1 Sauerstofftransportierende Proteine und ihre prosthetische Gruppe Häm
4.2 Hämoxygenase
4.3 Isoformen der Hämoxygenase

5. Substratspezifität, Struktur und aktive Form des Proteins
5.1 Substratspezifität
5.2 Struktur des Proteins und aktive Zentren
5.3 Hämoxygenase und Hämpool

6. Molekulare Charakterisierung der Hämoxygenase 1
6.1 Hämoxygenase Genstruktur
6.2 Induzierbarkeit der Hämoxygenase 1
6.2 Hormonelle Regulation

7. Hämoxygenase 1 als ein Streß-induziertes Protein
7.1 Akute-Phasen-Proteine
7.2 Ein oxidatives Streß-Protein

8. Pathophysiologie der Hämoxygenase 1
8.1 Kohlenmonoxid und Stickstoffmonoxid als Boten
8.2 Hypoxie

 

II. Problemstellung

 

III. Experimenteller Teil

1. Material und Geräte
1.2 Zusammensetzung von Medien, Standardlösungen und Puffern

2. Präparation und Kultur primärer Hepatozyten

3. Konfokale Laser-Mikroskopie

4. Run-Off Transkriptionsmessungen
4.1 Zellkernextrakte
4.2 Nukleinsäure-Kapillar-Transfer

5. Methoden zur RNA-Analysierung
5.1 RNA-Isolierung nach der Guanidinthiocyanat-Methode
5.2 RNA-Isolierung nach RNA CLEAN
5.3 Northern Transfer von RNA und Hybridisierung
5.4 Radioaktive Markierung von cDNA-Sonden

6. Methoden zur DNA-Analysierung und Präparation
6.1 Plasmidpräparationen
6.2 DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode mit [a-35S] dATP
6.3 Gelelektrophoretische Trennung von DNA- und PCR-Produkten sowie der genomischen DNA, Southern Transfer und Hybridisierung

7. PCR (Polymerase-Kettenreaktion) Methode
7.1 PCR Screening von Bakterienkulturen
7.2 A/T-Klonierung von PCR-Produkten

8. Transiente Transfektionen von primären Hepatozyten
8.1 Calcium-Phosphat Methode
8.1 Liposomen Methode

9. Durchmusterung einer [lambda]-Phagen-DNA-Bibliothek
9.1 Präparation von [lambda]-DNA

10. Proteinchemische Methoden
10.1 Proteinbestimmung
10.2 SDS-PAGE und Western Transfer

11. ATP-Messung

12. Computersoftware zur Protein- und DNA-Analyse

13. Statistik

 

IV. Ergebnisse

1. Induzierbarkeit der Hämoxygenase 1 in kultivierten Hepatozyten auf der RNA-Ebene
1.1 Analyse des Cadmiumchlorides als Induktor
1.2 Analyse des Kobaltchlorides als Induktor
1.3 Analyse des Hämoxygenase 1-Substrates Häm
1.4 t-Butylhydrochinon als Induktor der Hämoxygenase 1

2. Analyse der Induzierbarkeit der Hämoxygenase 1 auf der Protein-Ebene
2.1 Die Metalle: Cadmium- und Kobaltchlorid
2.2 Häm- und t-Butylhydrochinon-vermittelte Protein-Expression

3. Amplifikation von cDNA-Abschnitten des c-Fos- und c-Jun-Genes mit geeigneten Primer-Paaren
3.1 Untersuchung der c-Jun- und c-Fos-Expression in t-Butylhydrochinon-induzierten primären Hepatozyten

4. Reprimierbarkeit der induzierten Hämoxygenase 1 durch Antioxidanten
4.1 Reprimierbarkeit der Metall-induzierten Hämoxygenase 1 durch N-Acetylcystein (NAC)
4.2 Reprimierbarkeit der Häm- und t-Butylhydrochinon-induzierten Hämoxygenase 1 durch N-Acetylcystein (NAC)
4.3 Reprimierbarkeit der Häm- und t-Butylhydrochinon-induzierten Hämoxygenase 1 durch den Antioxidanten a-Tocopherol (Vitamin E)

5. Reprimierbarkeit der Hämoxygenase 1 durch Inhibitoren der respiratorischen Kette
5.1 Inhibierung der Metall-induzierten Hämoxygenase 1 durch Rotenon
5.2 Inhibierung der Häm-induzierten Hämoxygenase 1 durch Rotenon
5.3 Inhibierung der induzierten Hämoxygenase 1 durch Antimycin A

6. Adenosintriphosphat-(ATP)-Gehalt der primären Hepatozyten
6.1 Messung des ATP-Gehaltes Cadmiumchlorid-behandelter primärer Hepatozyten
6.2 Messung des ATP-Gehaltes Kobaltchlorid-behandelter primärer Hepatozyten
6.3 Messung des ATP-Gehaltes Häm-induzierter primärer Hepatozyten
6.4 Messung des ATP-Gehaltes t-Butylhydrochinon-stimulierter primärer Hepatozyten

7. Fluoreszenzanalyse der reaktiven Sauerstoffzwischenstufenbildung in Hepatozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff Dihydrorhodamin 123
7.1 Etablierung der Meßmethode in den primären Hepatozyten
7.2 Analyse der ROI-Akkumulation, vermittelt durch die Metall-Induktoren
7.3 Analyse der ROI-Akkumulation, vermittelt durch das Hämoxygenase 1-Substrat Häm und durch das t-Butylhydrochinon

8. Untersuchung der transkriptionellen Eigenschaften des Hämoxygenase 1- Promotors
8.1 Herstellung der homologen Reporterkonstrukte: Amplifikation von Hämoxygenase 1-Promotorabschnitten mit geeigneten Primern
8.2 Transfektionsexperimente
8.3 Analyse der Hämoxygenase 1-Promotor-Fragmente
8.3.1 Cadmium- und Kobaltchlorid Induktoren
8.3.2 Häm und t-Butylhydrochinon Induktoren
8.3.3 Schilddrüsenhormon T3 als Induktor der Hämoxygenase 1-Promotorkonstrukte

 

V. Diskussion

1. Die Expression der hepatischen Hämoxygenase 1
1.1 Cadmium- und Kobaltchlorid-vermittelte Expression
1.2 Expression der Hämoxygenase 1 durch das eigene Substrat Häm
1.3 Expression der Hämoxygenase 1 in t-Butylhydrochinon-behandelten Primärkulturen
1.4 Einfluß von t-Butylhydrochinon auf die Expression von c-Jun in primären Hepatozyten

2. Einfluß von Atmungsketteninhibitoren auf die stimulierte Hämoxygenase 1 und der ATP-Gehalt in diesen induzierten primären Hepatozyten
2.1 Beeinflussung der Cadmium- und Kobaltchlorid-induzierten Hämoxygenase 1
2.2 Häm-stimulierte Hämoxygenase 1
2.3 Induktor t-Butylhydrochinon

3. Untersuchung zu dem Einfluß von Antioxidanten auf die Hämoxygenase 1-Genexpression sowie die Bildung von reaktiven Sauerstoffzwischenstufen (reactive oxygen intermediates, ROIs)
3.1 Oxidativer Einfluß von Cadmium- und Kobaltchlorid
3.2 Radikal-Bildung unter dem Einfluß der Induktoren Häm und t- Butylhydrochinon

4. Charakterisierungsgrundlagen der Hämoxygenase 1-Promotor-regulation in primären Hepatozyten
4.1 Einfluß von Cadmium- und Kobaltchlorid auf die Promotorkonstrukte der Hämoxygenase 1
4.2 Einfluß des Substrates Häm auf die Transkription der Hämoxygenase 1- Promotorkonstrukte
4.3 Regulation der t-Butylhydrochinon-stimulierten Hämoxygenase 1
4.4 Mechanismus der T3-vermittelten Hämoxygenase 1-Induktion
4.5 Zukünftige Experimente zur Untersuchung des Hämoxygenase 1-Promotors und klinische Aspekte
 
 

VI. Zusammenfassung

Abstract

 

VII. Abkürzungen

 

VIII. Literaturverzeichnis

 

IX. Anhang I

 

X. Anhang II

 
Danksagung

Lebenslauf