Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. T.M. Pillar
für die Überlassung des Themas und der hilfreichen Unterstützung
und Herrn Prof. Dr. H.J. Seitz für die Aufnahme in seiner Abteilung
und für anregende Diskussionen.
Herrn Prof. Dr. H. Marquardt danke ich für
die Vertretung der Arbeit gegenüber dem Fachbereich Chemie.
Erstgutachter: Prof. Dr. H. Marquardt
Zweitgutachter: Prof. Dr. H.J. Seitz
Rigorosum: 14. September 1998
2. Molekulare Wirkungsweise von Schilddrüsenhormonen
2.1 Physiologische Aspekte der Schilddrüsenhormone
2.2 Molekularer Wirkungsmechanismus
3. Oxidativer Streß und zelluläre
Antioxidanten
3.1 Hitzeschock-Proteine
3.2 Oxidativer Streß
3.3 Zellulärer Schutz
4. Entdeckung und Charakterisierung der Hämoxygenase
1
4.1 Sauerstofftransportierende Proteine und ihre
prosthetische Gruppe Häm
4.2 Hämoxygenase
4.3 Isoformen der Hämoxygenase
5. Substratspezifität, Struktur und aktive
Form des Proteins
5.1 Substratspezifität
5.2 Struktur des Proteins und aktive Zentren
5.3 Hämoxygenase und Hämpool
6. Molekulare Charakterisierung der Hämoxygenase
1
6.1 Hämoxygenase Genstruktur
6.2 Induzierbarkeit der Hämoxygenase 1
6.2 Hormonelle Regulation
7. Hämoxygenase 1 als ein Streß-induziertes
Protein
7.1 Akute-Phasen-Proteine
7.2 Ein oxidatives Streß-Protein
8. Pathophysiologie der Hämoxygenase 1
8.1 Kohlenmonoxid und Stickstoffmonoxid als Boten
8.2 Hypoxie
2. Präparation und Kultur primärer Hepatozyten
3. Konfokale Laser-Mikroskopie
4. Run-Off Transkriptionsmessungen
4.1 Zellkernextrakte
4.2 Nukleinsäure-Kapillar-Transfer
5. Methoden zur RNA-Analysierung
5.1 RNA-Isolierung nach der Guanidinthiocyanat-Methode
5.2 RNA-Isolierung nach RNA CLEAN
5.3 Northern Transfer von RNA und Hybridisierung
5.4 Radioaktive Markierung von cDNA-Sonden
6. Methoden zur DNA-Analysierung und Präparation
6.1 Plasmidpräparationen
6.2 DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode
mit [a-35S] dATP
6.3 Gelelektrophoretische Trennung von DNA- und
PCR-Produkten sowie der genomischen DNA, Southern Transfer und Hybridisierung
7. PCR (Polymerase-Kettenreaktion) Methode
7.1 PCR Screening von Bakterienkulturen
7.2 A/T-Klonierung von PCR-Produkten
8. Transiente Transfektionen von primären
Hepatozyten
8.1 Calcium-Phosphat Methode
8.1 Liposomen Methode
9. Durchmusterung einer [lambda]-Phagen-DNA-Bibliothek
9.1 Präparation von [lambda]-DNA
10. Proteinchemische Methoden
10.1 Proteinbestimmung
10.2 SDS-PAGE und Western Transfer
11. ATP-Messung
12. Computersoftware zur Protein- und DNA-Analyse
13. Statistik
2. Analyse der Induzierbarkeit der Hämoxygenase
1 auf der Protein-Ebene
2.1 Die Metalle: Cadmium- und Kobaltchlorid
2.2 Häm- und t-Butylhydrochinon-vermittelte
Protein-Expression
3. Amplifikation von cDNA-Abschnitten des c-Fos-
und c-Jun-Genes mit geeigneten Primer-Paaren
3.1 Untersuchung der c-Jun- und c-Fos-Expression
in t-Butylhydrochinon-induzierten primären Hepatozyten
4. Reprimierbarkeit der induzierten Hämoxygenase
1 durch Antioxidanten
4.1 Reprimierbarkeit der Metall-induzierten Hämoxygenase
1 durch N-Acetylcystein (NAC)
4.2 Reprimierbarkeit der Häm- und t-Butylhydrochinon-induzierten
Hämoxygenase 1 durch N-Acetylcystein (NAC)
4.3 Reprimierbarkeit der Häm- und t-Butylhydrochinon-induzierten
Hämoxygenase 1 durch den Antioxidanten a-Tocopherol (Vitamin E)
5. Reprimierbarkeit der Hämoxygenase 1
durch Inhibitoren der respiratorischen Kette
5.1 Inhibierung der Metall-induzierten Hämoxygenase
1 durch Rotenon
5.2 Inhibierung der Häm-induzierten Hämoxygenase
1 durch Rotenon
5.3 Inhibierung der induzierten Hämoxygenase
1 durch Antimycin A
6. Adenosintriphosphat-(ATP)-Gehalt der primären
Hepatozyten
6.1 Messung des ATP-Gehaltes Cadmiumchlorid-behandelter
primärer Hepatozyten
6.2 Messung des ATP-Gehaltes Kobaltchlorid-behandelter
primärer Hepatozyten
6.3 Messung des ATP-Gehaltes Häm-induzierter
primärer Hepatozyten
6.4 Messung des ATP-Gehaltes t-Butylhydrochinon-stimulierter
primärer Hepatozyten
7. Fluoreszenzanalyse der reaktiven Sauerstoffzwischenstufenbildung
in Hepatozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff Dihydrorhodamin 123
7.1 Etablierung der Meßmethode in den primären
Hepatozyten
7.2 Analyse der ROI-Akkumulation, vermittelt
durch die Metall-Induktoren
7.3 Analyse der ROI-Akkumulation, vermittelt
durch das Hämoxygenase 1-Substrat Häm und durch das t-Butylhydrochinon
8. Untersuchung der transkriptionellen Eigenschaften
des Hämoxygenase 1- Promotors
8.1 Herstellung der homologen Reporterkonstrukte:
Amplifikation von Hämoxygenase 1-Promotorabschnitten mit geeigneten
Primern
8.2 Transfektionsexperimente
8.3 Analyse der Hämoxygenase 1-Promotor-Fragmente
8.3.1 Cadmium- und Kobaltchlorid Induktoren
8.3.2 Häm und t-Butylhydrochinon Induktoren
8.3.3 Schilddrüsenhormon T3 als Induktor
der Hämoxygenase 1-Promotorkonstrukte
2. Einfluß von Atmungsketteninhibitoren
auf die stimulierte Hämoxygenase 1 und der ATP-Gehalt in diesen induzierten
primären Hepatozyten
2.1 Beeinflussung der Cadmium- und Kobaltchlorid-induzierten
Hämoxygenase 1
2.2 Häm-stimulierte Hämoxygenase 1
2.3 Induktor t-Butylhydrochinon
3. Untersuchung zu dem Einfluß von Antioxidanten
auf die Hämoxygenase 1-Genexpression sowie die Bildung von reaktiven
Sauerstoffzwischenstufen (reactive oxygen intermediates, ROIs)
3.1 Oxidativer Einfluß von Cadmium- und
Kobaltchlorid
3.2 Radikal-Bildung unter dem Einfluß der
Induktoren Häm und t- Butylhydrochinon
4. Charakterisierungsgrundlagen der Hämoxygenase
1-Promotor-regulation in primären Hepatozyten
4.1 Einfluß von Cadmium- und Kobaltchlorid
auf die Promotorkonstrukte der Hämoxygenase 1
4.2 Einfluß des Substrates Häm auf
die Transkription der Hämoxygenase 1- Promotorkonstrukte
4.3 Regulation der t-Butylhydrochinon-stimulierten
Hämoxygenase 1
4.4 Mechanismus der T3-vermittelten Hämoxygenase
1-Induktion
4.5 Zukünftige Experimente zur Untersuchung
des Hämoxygenase 1-Promotors und klinische Aspekte