VI. Zusammenfassung / Abstract



 

VI. Zusammenfassung

Untersuchungen zur schädigenden Wirkung von oxidativem Streß und die Mechanismen seiner Abwehr stehen heute im Mittelpunkt vieler Forschungsanstrengungen für Organe wie Leber, Gehirn, Herzmuskel u.a.. Dies geschieht insbesondere deswegen, weil man der Überzeugung ist, daß ein besseres Verstehen von oxidativen Streß und seiner Abwehr zu einem besseren Verstehen von z.B. Alterungs- und Entzündungsprozessen auf zellulärer Ebene führt. Eine wichtige Antwort auf oxidativem Streß besteht in vielen Organen (wie Leber, Herz u.a.) in der Erhöhung der Hämoxygenase (HO), einem hochkonserviertem Enzym (E.C. 1.14.99.3), das die Reaktion der Hämdegradierung zu dem linearen Tetrapyrol und Antioxidanten Biliverdin unter Freisetzung von Eisen-II (Fe2+) und Kohlenmonoxid (CO) katalysiert (Abraham et al., 1988).
Neben einer in jeder Zelle vorkommenden HO existiert eine induzierbare Isoform, die HO-1. Sie wird durch eine Vielzahl von Agentien (wie z.B. synthetische Zinn- und Zinkporphyrine, das eigene Substrat Häm und Metallsalze) aktiviert (Cruse & Maines, 1988 und Trakshel & Maines, 1989).
Darüber hinaus konnte das Schilddrüsenhormon 3,5,3'-Triiod-L-thyronin (T3) als ein weiterer Induktor der HO-1 mRNA in vivo gezeigt werden (Befunde von Dr. T.M. Pillar und I.Wilke).

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, am Beispiel der Leber die bisher unverstandene Regulation der HO-1 unter oxidativen Situationen sowie die Schilddrüsenhormonwirkung auf der Ebene des HO-1-Promotors näher zu charakterisieren. Für die Untersuchungen wurde das in vivo-nahe primäre Hepatozytenkultursystem gewählt, zudem wurden gängige moderne molekularbiologische Methoden (z.B. Northern und Western Transfer Analysen, Run-Off Transkriptionsmessungen und transiente Transfektionen) angewandt. Zur Kontrolle dienten Befunde aus den permanenten Leberzellinien Hep3B und HepG2. Die Messung der Sauerstoffradikalbildung erfolgte mit der konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie (confocal laser scanning microscopy; CLSM).

Durch die eingesetzten Induktoren (den Schwermetallverbindungen Cadmium- und Kobaltchlorid, dem eigenen Substrat Häm sowie t-Butylhydrochinon) konnte eine Stimulierung der HO-1-Expression auf der mRNA- und der Proteinebene in primären Hepatozyten verifiziert werden. Ferner konnte demonstriert werden, daß die unterschiedlichen Induktoren der HO-1 in primären Hepatozytenkulturen oxidativen Streß durch die Bildung reaktiver Sauerstoffzwischenstufen (reactive oxygen intermediates; ROIs) erzeugen. Durch Untersuchungen auf Promotorebene des HO-1-Enzyms konnten für die Induktoren unterschiedliche Angriffspunkte dargestellt werden: die Konsequenz war jedoch stets die Stimulierung der HO-1 mRNA und die Synthese des Proteins. Mit Hilfe der transienten Transfektionsexperimente in primären Hepatozyten konnte für ein bereits sequenziertes 830 bp HO-1-Promotorfragment eine Stimulierung der HO-1-Expression durch die Induktoren Häm, Cadmium- und Kobaltchlorid sowie t-Butylhydrochinon dargestellt werden. Diese Ergebnisse zeigen die Anwesenheit eines DNA-Bindungselementes, das als ein "oxidativer Sensor" für die Aktivierung der HO-1-Genexpression und der damit verbundenen Bildung des Antioxidanten Biliverdin wirkt.
Was die Stimulierung und Genexpression des Enzyms durch T3 betrifft, ist festzustellen, daß sie gleichfalls in dem 830 bp langen HO-1-Promotorfragment erfolgt. In dem bisher sequenzierten HO-1-Promotor der Ratte konnte jedoch überraschenderweise kein funktionelles Schilddrüsenhormon-responsives Element (thyroidhormone-responsive element, TRE) identifiziert werden.

Die gezeigten Ergebnisse machen erstmals deutlich, daß unter Verwendung der in vivo-nahen primären Hepatozytenkulturen die unterschiedlichen Induktoren der HO-1 (Cadmium- und Kobaltchlorid, Häm und t-Butylhydrochinon) eine Veränderung des oxidativen Zustandes (Anreicherung von ROIs) in diesen Zellen bewirken und erläutern einen der zellulären Abwehrmechanismen auf die toxischen Metalle Cadmium und Kobalt.
Darüberhinaus konnte erstmalig ein induzierender Effekt der Induktoren auf die HO-1-Proteinsynthese dargestellt werden. Durch Resultate einer spezifische Versuchsanordnung kann für die Induktoren der HO-1 von unterschiedlichen Wirkungsmechanismen ausgegangen werden, die als Konsequenz immer eine Aktivierung der HO-1-Expression bewirken. Zum erstenmal konnte für den Induktor t-Butylhydrochinon während einer HO-1-Stimulierung gleichzeitig die Aktivierung eines AP1 Transkriptionsfaktors in Form eines c-Jun homodimeren Genproduktes verifiziert werden.
Mit transienten Transfektionsexperimenten konnte der entscheidende regulatorische Bereich des HO-1-Promotors in Bezug auf die Wirkung der oxidativen Induktoren und der Schilddrüsehormonwirkung eindeutig eingegrenzt werden. Dieser regulatorische Bereich befindet sich in einem bereits sequenzierten 830 bp HO-1-Promotorfragment. In dieser Region kommt ein putatives DNA-Element in Frage, das eine Aktivierung der HO-1-Expression durch oxidativen Streß bewirken könnte: das Metall-responsive Element (metal-responsive Element; MRE). Dalton et al. (1996) beschrieben eine Regulation des Metallothioneins-Gens durch t-Butylhydrochinon über ein MRE. Diese Ergebnisse lassen die Vermutung zu, daß das putative MRE in dem HO-1-Promotor bei einer Stimulierung durch t-Butylhydrochinon und anderer oxidativer Streß-Induktoren (Häm, Cadmium- und Kobaltchlorid) funktionsfähig ist.
Für die Aktivierung der HO-1 durch T3 ist davon auszugehen, daß die vermittelte Regulation gleichfalls über das genannte DNA-Bindungselement erfolgt. Da in den bisherigen Sequenzen kein TRE identifiziert werden konnte, ist jedoch davon auszugehen, daß die T3-vermittelte HO-1 mRNA-Expression über einen indirekten Mechanismus aktiviert wird. Als Grundlage dieser Regulation wird die T3-vermittelte Steigerung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauches postuliert, die gleichzeitig mit einer Steigerung reaktiver Sauerstoffmetabolite verbunden ist.

Auf der Grundlage dieser Ergebnisse lassen sich zukünftige regulatorische Studien des HO-1-Promotors deutlich eingrenzen und die Verifizierung eines lang gesuchten "Sauerstoff-sensitiven Elementes" in dem 830 bp Fragment zu ermöglichen. Dies wird dann dazu beitragen, noch besser zu verstehen wie die Erhöhung der ROIs bei z.B. Entzündungen, extremen körperlichen Anstrengungen, Vitaminmangelzuständen mit einer Erhöhung der HO-1 Aktivität einhergeht.
 


VI. Abstract

Oxidative stress and the cellular mechanisms of defence in liver, brain and heart play a crucial role in the aetiology of several important diseases. A better understanding would help to characterise the role of oxidative stress, for instance, in ageing and inflammatory processes at the cellular level.
Of major importance in regulation of cellular homeostasis is the degradation of heme to the antioxidant biliverdin with the release of iron and the generation of carbon monoxide (CO), a reaction catalysed by the highly conserved enzyme heme oxygenase (HO; E.C. 1.14.99.3) first described by Abraham et al. (1988). The primary role of HO 1 is considered to be related to the recycling of iron from senescent red blood cells as well as red blood cells damaged in cellular stress and injury situations.
HO 1 activity is increased by the treatment with its natural substrate heme, as well as various metals and synthetic metalloporphyrins (Cruse & Maines, 1988 and Trakshel & Maines, 1989). It is an oxidative stress induced enzyme and the generation of the antioxidant biliverdin seems to be a defence mechanism against the above inductors (Ewing & Maines, 1993). Furthermore, results from Dr. T. Pillar and I. Wilke (not published) demonstrated the increase of HO 1 mRNA by treatment with thyroid hormone (3,5,3'-triiod-L-thyronin; T3).

The aim of this work was to analyse the regulation of the HO 1 in liver under oxidative stress situations and to characterise the action of thyroid hormone at the HO 1 promoter level. The investigations were carried out using primary hepatocyte culture and modern molecular biology methods (northern and western blotting, run-off transcription assays and transient transfection experiments), as well as measurement of reactive oxygen intermediates (ROIs) by confocal laser scanning microscopy (CLSM). Results from Hep3B and HepG2 permanent cell lines were taken as controls.

For induction of HO-1 mRNA and protein expression in primary hepatocytes cadmiumchloride, cobaltchloride, t-butylhydroquinone and its substrate heme were added to the cultures. These inductors were found to increase the formation of ROIs (reactive oxygen intermediates) in primary hepatocytes. Investigation at the HO-1 promoter level revealed, that the above inductors operate through different activation mechanisms but constitently stimulate mRNA and protein levels. The transient transfection experiments demonstrated that a sequenced 830 bp HO-1 promoter fragment is responsible for the inductor mediated stimulation of the HO-1 expression. These results show the presence of a DNA-binding element, which acts as an "oxygen-sensitive element" for the activation of HO-1 gene expression and the resulting formation of the antioxidant biliverdin.
Studies of T3 action of the HO-1 expression (transient transfection) have also shown, that the regulation of HO-1 by T3 has been located in the same 830 bp promoter fragment. Surprisingly a thyroid-responsible element (TRE) has not yet been identified in this sequenced rat HO-1 promoter region.

The results have shown, that all used inductors (cadmiumchloride, cobaltchloride, heme and t-butylhydroquinone) were found to generate the ROI formation in the in vivo-like primary hepatocytes, and therefore demonstrate the alteration of the oxidative status. It also have shown one of the defence mechanisms against the toxic metals cadmium and cobalt.
Furthermore it could be demonstrated for the first time that the above inductors increase HO-1 protein level. The results show, that the above inductors acts via different pathways to induce HO-1 expression. Moreover the studies have shown, that during HO-1 stimulation the inductor t-butylhydroquinone simultaneously increases the c-Jun mRNA level, to form a c-Jun homodimeric gene product (transcription factor AP1). Till now, no AP1-sequence has been found in the sequenced rat HO-1 promoter in contrast to the promoter in mice and human.
Furthermore the transient transfection assays show, that the sequenced 830 bp of the HO-1 promoter includes a crucial regulatory region for stimulating HO-1 by oxidative stress and by thyroid hormone (T3) action. The putative binding metal-responsive element (MRE) is a possible candidate for an "oxygen-sensitive element" in the HO-1 promoter which is found in this region. It seems to be possible that the increase of HO-1 by t-butylhydroquinone is mediated through MRE, as known from the literature of the metallothionein gene (Dalton et al., 1997). These results imply that the putative MRE on the HO-1 promoter is functioning, when stimulated by the t-butylhydroquinone and other already mentioned inductors.
Activation of HO-1 through T3 is likely to proceed by the same binding-element found in the 830 bp fragment of the sequenced rat HO-1 promoter. This could be the result of increased reactive oxygen intermediates (ROIs) production resulting from increased mitochondria oxygen consumption mediated by T3.

On the basis of these results future regulatory studies of the HO-1 promoter can be restricted: the verification of the "oxygen-sensitive element" in the 830 bp fragment which is also responsible for the indirect stimulation of HO-1 through T3.
In addition, the availability of other 5'-end HO-1 promoter fragments would aid a more thorough characterisation of HO-1. This would further contribute to the understanding of gene regulatory pathways used in oxidative stress and inflammation, over-exertion and vitamin deficiency.