Universitäts-Krankenhaus Eppendorf
Medizinische Kernklinik und Poliklinik
Direktor: Professor Dr. H. Greten
hnRNP C
1 Protein interagiert mit APOBEC-1 im Two-Hybrid System und inhibiert Apo B mRNA Editing in vitro
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin
dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von
Peer Rautenberg
aus Hamburg
Hamburg, 1999
Angenommen von dem Fachbereich Medizin
der Universität Hamburg am: 21. Juli 1999
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs
Medizin der Universität Hamburg
Sprecher: Prof. Dr. H.-P- Leichtweiß
Referent: Prof. Dr. H. Greten
Korreferent: -
Inhalt
1. Einleitung ........................................................................................................ |
1 |
2. Materialien und Methoden .................................................................. |
9 |
2.1. Two-Hybrid System ..................................................................................... |
9 |
2.1.1. Klonierung des GAL4bd-APOBEC-1-Fusionsproteins in pGBT9............. |
9 |
2.1.1.1. Amplifikation der APOBEC-1 cDNA............................................................ |
9 |
2.1.1.2. Analyse und Aufreinigung des PCR-Produktes............................................. |
10 |
2.1.1.3. Restriktionsenzymverdau und Phenol-/Chloroformextraktion...................... |
10 |
2.1.1.4. Ligation der APOBEC-1 cDNA in den Vektor pGBT9................................. |
12 |
2.1.1.5. Herstellung kompetenter E. coli Bakterien und Transformation des Ligationsproduktes...................................................................................................... |
12 |
2.1.1.6. Analyse der transformierten Klone................................................................ |
14 |
2.1.1.7. Einfügen eines "Spacers" zwischen die GAL4-Bindungsdomäne und APOBEC-1.................................................................................................................. |
15 |
2.1.1.8. Sequenzierung des Konstruktes pGBT9-APOBEC-1.................................... |
15 |
2.1.2. Materialien für Hefekulturen......................................................................... |
16 |
2.1.2.1. YPD Medium................................................................................................. |
16 |
2.1.2.2. SD Medium (synthetisches Dropout Medium).............................................. |
16 |
2.1.2.3. 10 x Dropout Lösung...................................................................................... |
17 |
2.1.3. Materialien für Hefentransformation........................................................... |
18 |
2.1.3.1. PEG/LiAc Lösung.......................................................................................... |
18 |
2.1.3.2. Hering-Hoden carrier DNA............................................................................ |
18 |
2.1.3.3. Vorratslösungen.............................................................................................. |
18 |
2.1.4. Materialien für b -Galaktosidase Filter Assays............................................. |
19 |
2.1.4.1. Z Puffer........................................................................................................... |
19 |
2.1.4.2. X-gal Vorratslösung....................................................................................... |
19 |
2.1.4.3. Z puffer/X-gal Lösung.................................................................................... |
19 |
2.1.4.4. Weitere Materialien........................................................................................ |
19 |
2.1.5. Überprüfung des Phänotyps der Hefenstämme HF7c und SFY526........... |
20 |
2.1.6. Präparation von Plasmid DNA der Rattenleber cDNA Genbank.............. |
21 |
2.1.7. Libraryscreening in HF7c............................................................................... |
21 |
2.1.7.1. Herstellung kompetenter HF7c-Zellen zur Library-pGBT9-APOBEC-1 Cotransformation......................................................................................................... |
21 |
2.1.7.2. pGBT9-APOBEC-1-Library-Cotransformation............................................. |
22 |
2.1.7.3. Isolierung His+-Kolonien................................................................................ |
23 |
2.1.7.4. b -Galaktosidase Assay................................................................................... |
23 |
2.1.7.5. Isolierung von Plasmid DNA aus b -Galaktosidase+-Kolonien...................... |
24 |
2.1.7.6. Transformation elektrokompetenter E. coli durch Elektroporation............... |
24 |
2.1.7.7. Analyse der Plasmid DNA der b -Galaktosidase+-Klone................................ |
25 |
2.1.8. Mutagenese....................................................................................................... |
25 |
2.2. Bakterielle Expression und Aufreinigung von hnRNP C1 Protein, M104, GST-APOBEC-1 und GST-Protein ................................ |
27 |
2.2.1. Puffer................................................................................................................ |
27 |
2.2.2. Expression und Aufreinigung von hnRNP C1 Protein................................. |
29 |
2.2.2.1. Proteiauftrennung durch SDS-PAGE............................................................. |
30 |
2.2.3. Expression und Aufreinigung von M104....................................................... |
32 |
2.2.4. Expression und Aufreinigung von GST-APOBEC-1................................... |
32 |
2.2.5. Expression und Aufreinigung von GST-Protein.......................................... |
33 |
2.3. In vitro mRNA Editing Assay .................................................................. |
34 |
2.3.1. Lösungen.......................................................................................................... |
34 |
2.3.2. Transkription von Apo B RNA (55 Nukleotide)........................................... |
36 |
2.3.3. Präparation von cytosolischem Rattendünndarm-Enteozyten-Extrakt.... |
37 |
2.3.4. Partielle Aufreinigung des Apo B mRNA Editing Enzyms aus cytosolischem Rattenenterozyten-Extrakt.............................................................. |
38 |
2.3.4.1. Chromatographie mit DEAE-Sepharose........................................................ |
38 |
2.3.4.2. Chromatographie mit Heparin-Agarose......................................................... |
38 |
2.3.5. In vitro Editing Reaktion................................................................................ |
39 |
2.3.6. Primer Extension Analyse.............................................................................. |
39 |
2.4. Oligonukleotide ............................................................................................. |
40 |
3. Ergebnisse ....................................................................................................... |
41 |
3.1. Etablierung des Two-Hybrid Systems .................................................. |
41 |
3.1.1. Positivkontrollen.............................................................................................. |
41 |
3.1.2. Negativkontrollen............................................................................................ |
42 |
3.2. Interaktion von APOBEC-1 mit hnRNP C1 Protein im Two-Hybrid System in Hefen ..................................................................................... |
42 |
3.3. Spezifität der Interaktion .......................................................................... |
46 |
3.4. hnRNP C1 Protein inhibiert partiell aus Rattenenterozyten aufgereinigtes Apo B mRNA Editing Enzym ............................................. |
49 |
4. Diskussion.......................................................................................................
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52 |
5. Zusammenfassung ..................................................................................... |
58 |
6. Literaturverzeichnis ................................................................................. |
59 |
7. Danksagung ................................................................................................... |
69 |
8. Lebenslauf ...................................................................................................... |
70 |
9. Erklärung ........................................................................................................ |
71 |
Apolipoprotein B existiert in zwei Formen. Apolipoprotein (Apo) B-100, ein 512 kDa Protein, ist das Hauptstrukturprotein der low density lipoproteins (LDL) und auch ihrer Vorläufer, den very low density lipoproteins (VLDL), die von der Leber sezerniert werden (Kane, 1983). LDL enthalten beim Menschen 60 % - 70 % des Gesamtplasmacholesterins. Sie zirkulieren im Plasma mit einer Halbwertszeit von etwa 20 h (Brown et al., 1986). Apo B-100 ist als Strukturprotein der LDL ein physiologischer Ligand des LDL-Rezeptors (Kane, 1983). Erhöhte LDL-Plasmaspiegel stellen einen der Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung einer Atherosklerose und einer koronaren Herzkrankheit (KHK) dar (Steinberg und Witzum, 1990). In großen epidemiologischen Studien konnte gezeigt werden, daß die Mortalität durch eine koronare Herzkankheit mit steigendendem Plasmacholesterin deutlich ansteigt (Smith et al., 1992). Eine medikamentöse Senkung des LDL-Cholesterins verringert die Mortalität der KHK. So wurden in der "Scandinavian Simvastatin Survival Study" (4 S) Patienten mit einer symptomatischen koronaren Herzkrankheit mit 20 – 40 mg/d Simvastatin behandelt. Es konnte dadurch das LDL-Cholesterin im Durchschnitt um 35 % und die Triglyceride um 10 % gesenkt werden, das HDL-Cholesterin stieg im Mittel um 8 % an. Die Gesamtmortalität wurde um 30 %, die Mortalität aus kardialer Ursache um 42 % gesenkt (Kjekshus et al., 1995). Die zweite Form des Apolipoproteins B , das Apo B-48 besteht aus den aminoterminalen 48 % des Apo B-100. Es ist das entscheidende Strukturprotein der Chylomikronen, die vom Darm sezerniert werden (Innerarity et al., 1996). Nach der Triglycerid-Hydrolyse haben die Chylomikronen-Remnants eine Plasmahalbwertszeit von weniger als 10 min (Havel und Kane 1989 ; Jäckle et al., 1992). Die Synthese der trunkierten Isoform Apo B-48 wird durch mRNA Editing bewirkt, einem spezifischen posttranskriptionalem Basenaustausch von C durch U in der Apo B mRNA, wodurch das Glutamin-Codon (Position 2153) CAA in ein vorzeitiges translationales Stop-Codon UAA überführt wird (Powell et al., 1987 ; Chen et al., 1987). Apo B mRNA Editing ist ein intranukleäres, posttranskriptionelles Ereignis, das im wesentlichen mit dem Spleißen und der Polyadenylierung der Apo B RNA vor dem Verlassen des Nukleus abgeschlossen ist (Lau et al., 1991). Bei Menschen und vielen anderen Säugetieren wird die Apo B mRNA in hohem Maße im Darm editiert, der Apo B-48 synthetisiert, wohingegen die Apo B mRNA in der Leber nicht editiert wird, was zur auschließlichen Produktion von Apo B-100 in diesem Organ führt (Greeve et al., 1993). In einigen Säugetieren wie etwa in Hunden, Pferden und Mäusen wird die Apo B mRNA auch in der Leber editiert. Es kommt so in diesen Spezies zur Synthese und hepatischen Exkretion von Apo B-48-haltigen VLDL und somit zu konsekutiv niedrigen LDL-Plasmaspiegeln (Greeve et al., 1993). Mutationen im LDL Rezeptor Gen verursachen beim Menschen die familiäre Hypercholesterinämie, eine Erkrankung, die durch frühzeitige Atherosklerose und stark erhöhte Plasmaspiegel von LDL und Apo B-100 charakterisiert (Goldstein et al., 1995). Bei "knock-out"-Mäusen mit einer LDL-Rezeptor-Defizienz entwickelt sich im Gegensatz zum Menschen eine nur geringfügige Hypercholesterinämie mit nur mäßiger Erhöhung der LDL-Plasmaspiegel. Eine Atherosklerose wie beim Menschen entwickelt sich nicht. Diese Mäuse sind in der Lage Apo B mRNA in ihrer Leber zu edieren und produzieren überwiegend Apo B-48-haltige Lipoproteine, die auch einen hohen Gehalt an Apo E haben und aus dem Plasma unabhängig vom LDL-Rezeptor über das "LDL Rezeptor Related Protein" (LRP) entfernt werden können (Davidson et al., 1995). "Knock-out"-Mäuse, die zusätzlich zum LDL-Rezeptordefekt Apo B RNA nicht mehr edieren können, zeigen deutlich erhöhte LDL- und Apo B-100-Plasma-Cholesterinspiegel und entwickeln eine schwere Atherosklerose (Powell-Braxton et al., 1998).
Das Editing der Apo B mRNA wird durch einen Enzymkomplex, das Apo B mRNA Editing Enzym katalysiert (Greeve et al., 1991 ; Smith et al., 1991 ; Garcia et al., 1992). Das Apo B mRNA Editing Enzym deaminiert den Cytidin-Rest an Nukleotidposition 6666, wodurch Uridin entsteht (Hodges et al., 1991 ; Johnson et al., 1993). Die RNA Signalsequenz, die den Editing Enzymkomplex zur spezifischen Deaminierung des C-6666 führt, kann in drei Abschnitte unterteilt werden. Von 3` in 5` Richtung betrachtet, ist dies die "mooring" Sequenz, eine "spacer" Sequenz sowie eine regulatorische Region, die in 5` Richtung unmittelbar dem C—6666 benachbart ist (Smith, 1993 ; Hodges et al., 1992). Das 11 Nukleotide umfassendes "mooring" Motiv, in 3`-Richtung von der Editingbase an Nukleotid-Position 6671 – 6681 gelegen, ist absolut notwendig für die Editing-Reaktion (Shah et al., 1991). Die Ligation des "mooring" Motiv in eine beliebige RNA führt zum Editing eines C`s, wenn es 3 – 5 Basen in 5` Richtung von der "mooring" Sequenz aus betrachtet lokalisiert ist (Chen et al., 1990). Die katalytische Untereinheit APOBEC-1 (Apo B editing catalytic polypeptide 1) wurde als erste Komponente des Editing-Enzyms 1993 kloniert, ist seitdem Gegenstand intensiver Forschung und bereits gut charakterisiert (Teng et al., 1993). APOBEC-1 ist ein Mitglied der Deaminase-Gen-Familie mit einem neuen RNA-Bindungs-Motiv (Navaratnam, et al., 1993 ; Anant et al., 1995 ; Navaratnam et al., 1995). APOBEC-1 agiert als ein Homodimer, benötigt jedoch für die effiziente Katalyse der Apo B mRNA-Editing-Reaktion weitere Proteine, sogenannte komplementierende Faktoren (Teng et al., 1993 ; Lau et al.,1994 ; Yamanaka et al., 1994). Im Menschen wird APOBEC-1 fast ausschließlich im Dünndarm exprimiert. Im Gegensatz dazu exprimieren Mäuse und Ratten APOBEC-1 zusätzlich in der Milz und in der Leber, weniger stark auch in den Nieren, Lungen, im Skelettmuskel und im Herzen (Teng et al., 1993 ; Lau et al., 1994 ; Nakamuta et al., 1995). In der Rattenleber kann das Ausmaß des Apo B mRNA-Editings durch Entwicklungs-, Hormon- oder Ernährungsstimuli moduliert werden, von denen die meisten das Expressionsniveau von APOBEC-1 unberührt lassen (Funahashi et al., 1995). Zwar ist die Stimulation des Editings in der Rattenleber nach einer Fastenzeit gefolgt von einer fettreichen Diät auf eine gesteigerte APOBEC-1 Expression zurückzuführen. Die Stimulierung des Apo B mRNA Editings in der Rattenleber durch eine Schilddrüsenhormonzufuhr jedoch verändert die hepatische Konzentration der APOBEC-1 RNA nicht (Inui et al., 1994). Ebenso ist die Akkumulation von Apo B-48 mRNA in der Rattenleber nach einer ethanolreichen Diät nicht von irgendeiner Veränderung der APOBEC-1 mRNA Konzentration in diesem Organ begleitet. Zudem kann das Erlangen der Fähigkeit der Rattenleber und des Rattendünndarms zum Apo B mRNA Editing während der Embryonal- und frühen Postnatalzeit nicht mit dem Erscheinen der APOBEC-1 mRNA korreliert werden (Inui et al., 1994). Apo B mRNA Editing in der Rattenleber ist also quantitativ von der Präsenz zusätzlicher Hilfskomponenten des Editing-Enzym-Komplexes abhängig. Diese Proteine sind in vielen Organen inklusive der menschlichen Leber vorhanden, in denen APOBEC-1 nicht exprimiert wird (Giannoni et al., 1994 ; Yamanaka et al., 1994 ; Driscoll und Zhang, 1994 ; Greeve et al., 1996).
In der Vergangenheit wurden verschiedene Anstrengungen unternommen die weiteren, neben APOBEC-1 bestehenden Komponenten des Apo B mRNA-Enzymkomplexes zu charakterisieren. Die Aufreinigung des Apo B mRNA Editingenzyms stellte sich aufgrund der komplexen Struktur und der geringen Quantität als sehr schwierig heraus (Greeve et al., 1991 ; Garcia et al., 1992). Zwei Apo B RNA-bindende Proteine mit Molekulargewichten von 44 kDa und 66kDa (p44, p66) wurden durch UV-Crosslinking, chromatographische Kofraktionierung, Sedimentationsanalysen und Gel-Shifts in nativen Gelen identifiziert (Harris et al., 1993 ; Driscoll et al., 1993 ; Navaratnam et al., 1993). Ein 240 kDa Protein (p240), das durch einen monoklonalen Antikörper gegen den partiell aufgereinigten Apo B mRNA Editing Enzymkomplex identifiziert wurde, stimuliert die Editing-Reaktion an der Apo B mRNA zusammen mit anderen, unbekannten Hilfsproteinen (Schocks et al., 1996). Ebenfalls 1996 konnten Mehta et al. aus Paviannieren eine Protease-sensitive Aktivität aufreinigen, die zusammen mit APOBEC-1 Apo B RNA editieren kann. Dieses komplementierende Protein mit einer Größe von etwa 65 kDa zeigte eine starke Affinität zu aufgereinigtem, rekombinantem His6-markierten APOBEC-1 (Mehta et al., 1996).
Durch Nickelaffinitätsaufreinigung konnte der Apo B mRNA Enzymkomplex aus McArdle 7777 Zellen , in denen His6-Hämaglutinin-markiertes APOBEC-1 überexprimiert wurde, partiell aufgereinigt werden. Neben vielen anderen Proteinen konnten die vorher beschriebenen p44, p66 und p240 in diesem partiell aufgereinigten Enzymkomplex detektiert werden (Yang et al., 1997a). Lau et al. entdeckten durch Two-Hybrid-Selektion in Hefen eine Spleißvariante des heterogenen Ribonukleoproteins (hnRNP) A/B, das mit APOBEC-1 interagiert und von den Autoren ABBP-1 (APOBEC-1 binding protein 1) genannt wurde (Lau et al., 1997). Durch Immundepletion des ABBP-1 aus S100-Extrakten von stabil mit ABBP-1 transfizierten HepG2-Zellen wurde die in-vitro Editingaktivität dieser Extrakte deutlich reduziert. Ebenso sank die in vitro Editingaktivität der S100-Extrakte durch vorherige Transfektion der Zellkulturen mit einem ABBP-1 Antisense-Konstrukt (Lau et al., 1997).
Zusammengenommen scheint die Struktur des Apo B mRNA Editingenzyms sehr komplex zu sein und bedarf der weiteren Charakterisierung seiner Komponenten auf molekularem Niveau.
Um neue Komponenten des Apo B mRNA Editingenzyms zu entdecken, führten auch wir Two-Hybrid-Selektion in Hefen mit APOBEC-1 als Zielprotein und einer Rattenleber cDNA Genbank durch.
Two-Hybrid-Selektion ist ein genetischer Assay in Hefen um in vivo Interaktionen zwischen Proteinen zu entdecken bzw. zu testen (Bartel et al., 1993 ; Chien et al., 1991 ; Fields and Song, 1989 ; Fritz und Green, 1992 ; Guarente, 1993 ; Fields und Sternglanz, 1994). Diese Methode beruht auf dem Prinzip, daß viele eukaryotische Transkriptionsaktivatoren, wie auch GAL4, zwei physkalisch voneinander zu trennende Domänen beinhalten. Die eine fungiert als DNA-bindende Domäne, die andere als Transkriptions-Aktivierungsdomäne (Keegan et al., 1986 ; Ma und Ptashne, 1987). Die DNA-bindende Domäne sorgt für die richtige Lokalisation des Transkriptionsfaktors an der spezifischen "upstream"-Region des Genes, das durch diesen Transkriptionsfaktor reguliert wird. Die Aktivierungsdomäne bindet weiteren Komponenten der Transkriptionsmaschinerie und initiiert somit die eigentliche Transkription. Beide Domänen sind für die reguläre Aktivierungsfunktion erforderlich und sind normalerweise Teile desselben Proteins. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß in vivo eine Rekonstitution eines funktionierenden Transkriptionsaktivators aus getrennten Domänen ein und desselben oder verschiedener Transkriptionsfaktoren stattfinden kann (Ma und Ptashne, 1988 ; Brent und Ptashne, 1985).
Im MATCHMAKER Two-Hybrid System (ClontechR) wurden die kodierenden Sequenzen für die zwei funktionellen Domänen des GAL4 Transkriptionsaktivators in zwei verschiedene Expressionsvektoren kloniert (pGBT9 und pGAD424 / pGAD10) (Bartel et al., 1993). Mit Hilfe des pGBT9-Vektors wird ein Fusions- bzw. Hybridprotein aus der GAL4 DNA-Bindungsdomäne (GAL4bd) und einem Zielprotein X, in unserer Arbeit APOBEC-1, generiert. pGBT9 enthält zudem das TRP 1 Gen, das für die Synthese der Aminosäure Tryptophan kodiert. Durch den pGAD424- bzw. pGAD10-Vektor werden Fusionsproteine aus der GAL4 Aktivierungsdomäne und potentiellen Interaktionspartnern Y des Zielproteins X synthetisiert. Die pGAD Vektoren enthalten das LEU 2 Gen, kodierend für Leucin. In der hier vorliegenden Arbeit wurde eine Rattenleber cDNA Genbank der Firma ClontechR genutzt die als Fusionslibrary mit der GAL4 Aktivierungsdomäne in dem Vektor pGAD10 vorlag. Hohe Expressionslevel der Fusionsproteine in den Hefen wurden durch den ADH 1-Promotor in den Plasmiden pGBT9 und PGAD424 bzw. PGAD10 sichergestellt. Beide Arten von Fusionsproteinen werden in den Kernen der Hefezellen lokalisiert. Die GAL4 DNA-Bindungsdomäne enthält ein Kernlokalisierungssignal (Silver et el., 1984), in den Vektoren pGAD10 und pGAD424 wurde die Kernlokalisierungssequenz des SV 40 T-Antigens zwischen den ADH1-Promotor und die GAL4 Aktivierungsdomänensequenz kloniert (Chien et al., 1991). Kommt es zu einer Interaktion der Proteine X und Y, so führt dies zu einer Rekonstitution des GAL4 Transkriptionsaktivators und damit zu einer konsekutiven Transkription der Reportergene lacZ (b -Galaktosidase) und HIS3 (codierend für Histidin), wodurch die Interaktion zu identifizieren ist. Abbildung 1soll dies verdeutlichen
Um die Rattenleber-Genbank-Proteine auf Interaktion mit APOBEC-1 zu testen, erfolgte die Cotransformation in den Hefenstamm HF7c. Dieser besitzt zwei durch GAL4 kontrollierte Reportergene, HIS3 - kodierend für die Aminosäure Histidin - und lacZ (b -Galaktosidase-Aktivität). HF7c ist auxotroph für die Aminosäuren Tryptophan und Leucin. Zum Screening wurden die cotransformierten Hefen auf einem Mangelagar, der weder Tryptophan noch Leucin noch Histidin enthält, ausgestrichen und inkubiert. Ein Wachstum von Hefekolonien war also nur möglich, wenn eine Cotransformation erfolgt war (Transformation der Gene TRP1 und LEU2) und zusätzlich eine Reportergenaktivierung mit konsekutiver Synthese der Aminosäure Histidin stattfand. Die so gewachsenen Hefekolonien wurden einer zweiten Selektionsrunde unterzogen indem sie auf b -Galaktosidase-Aktivität getestet wurden. Abbildung 2 mag das Prinzip des Screenings verdeutlichen.
Durch Two Hybrid Selektion in Hefen konnten wir das heterogene Ribonukleoprotein C1 (hnRNP C1 Protein) als Interaktionspartner für APOBEC-1 identifizieren. Rekombinantes hnRNP C1 inhibiert die in vitro Editingaktivität des partiell aufgereinigten Apo B mRNA Editingenzyms aus Rattendünndarm. Dem hnRNP C1 Protein kommt demzufolge möglicherweise eine regulative Funktion des Apo B mRNA Editings zu.
A.
Das Hybridprotein aus GAL 4 DNA- Bindungsdomäne und Protein X bindet an die GAL 1 UAS (upstream activating sequence), kann jedoch ohne die Aktivierungsdomäne keine Transkription initiieren.
B.
Das Hybridprotein aus GAL 4 Aktivierungsdomäne und Protein Y kann die GAL 1 UAS nicht lokalisieren und somit keine Transkription initiieren.
C.
Die Interaktion der Proteine X und Y rekonstituiert die GAL 4 Funktion und es resultiert die Transkription des Reportergenes
Abbildung 1
Genbank-Screening mit Two-Hybrid Selektion
2. Materialien und Methoden
2.1.Two Hybrid System
2.1.1. Klonierung des GAL4bd-APOBEC-1-Fusionsproteins in pGBT9
2.1.1.1. Amplifikation der APOBEC-1 cDNA
Die full-length cDNA des APOBEC-1 der Ratte wurde durch PCR von dem Vektor pSVL-APOBEC-1 (Greeve et al., 1996) mit den Oligonukleotiden APOBEC IX und APOBEC VI amplifiziert, wodurch der APOBEC-1 cDNA die Schnittstellen für Eco RI am 5`Ende und für Pst I am 3`Ende hinzugefügt wurden. Die PCR wurde wie folgt durchgeführt:
PCR
Zur Klonierung benötigte DNA Fragmente wurden mittels der Polymerasekettenreaktion hergestellt. Hierzu wurden ca. 20 ng Plasmid DNA, welche die zu amplifizierende Sequenz enthält, in einem Ansatz von 50 µl mit je 25 pmol der jeweiligen sense- und antisense Oligonukleotide, 1 Unit Taq-DNA-Polymerase (PharmaciaR), die Nukleotide dATP, dGTP, dCTP und dTTP in einer Konzentration von 5 mM in [1 x] PCR Puffer (PharmaciaR) in einen Reaktionsansatz zusammengegeben. Es wurden 20 der folgenden Zyklen im Thermocycler durchlaufen: 60 sec 92°C, 90 sec 52°C und 150 sec 72°C. Vorangestellt wurde eine einmalige Denaturierung der DNA für 5 min bei 92°C, nach den 20 Zyklen folgte eine Inkubation für 7 min bei 72°C. Es wurde stets eine Negativkontrolle ohne Template DNA durchgeführt. Das Reaktionsprodukt konnte bei 4°C gelagert werden.
2.1.1.2. Analyse und Aufreinigung des PCR-Produktes
Agarosegel-Elektrophorese
Ladepuffer: |
[5 x] TBE Puffer |
||
0,025 % (w/v) |
Bromophenolblau |
450 mM |
Tris-Borat, pH 8,6 |
0,025 % (w/v) |
Xelen-Cyanol |
10 mM |
EDTA, pH 8,0 |
80 % (w/v) |
Sucrose |
Zur Herstellung eines Agarosegeles wurde Agarose in einer Konzentration von 0,8 – 1,5 % (w/v) in [1x] TBE Puffer gegeben und auf ca. 80°C erhitzt, wodurch sich die Agarose löste. Nach abkühlen auf ca. 45°C, vor dem Gießen des Geles wurde Ethidiumbromid in einer Konzentration von 1 µg/ml hinzugefügt. Je nach Gelgröße und somit Abstand der Elektroden wurde die Elektrophorese bei 40 – 200 V ausgeführt. Die DNA Proben wurden vor dem Laden mit 0,1 Volumen des Ladepuffers vermischt.
Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen
Die aufzureinigende DNA-Bande wurde unter UV-Licht aus dem Agarosegel mit einem Skalpell herausgeschnitten, wobei die UV-Bestrahlungszeit so kurz wie möglich gehalten wurde. Die DNA-Extraktion aus dem Gel erfolgte mit einem "Kit" der Firma Qiagen, der Puffer und Ionenaustauschsäulen enthält ("QIAquickâ " Gel Extraktion Kit), genau den Angaben des Herstellers folgend.
2.1.1.3. Restriktionsenzymenverdau und Phenol-/Chloroformextraktion
Das PCR-Produkt wurde zunächst mit dem Restriktionsenzym Eco RI geschnitten, es folgte eine Phenol-/Chloroformextraktion und Ethanolpräzipitation. Dann wurde die DNA mit Pst I geschnitten und wie zuvor gereinigt. Der Vektor pGBT9 wurde in zwei Schritten mit ECO RI und Pst I geschnitten, wobei jeweils nach dem Restriktionsenzymverdau eine Phenol-/Chloroformextraktion und eine Ethanolpräzipitation durchgeführt wurde. Es wurde dabei wie folgt vorgegangen.
Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
Alle DNA-Spaltungen mit Restriktionsendonukleasen wurden nach den Angaben des jeweiligen Herstellers durchgeführt. Zur Spaltung von 1 µg DNA wurden 1-2 Units des Restriktionsenzyms zugesetzt und unter den jeweils empfohlenen Pufferbedingungen für 1 h bei 37°C inkubiert. Das Volumen des zugesetzten Enzyms darf dabei ein Zehntel des Gesamtvolumens nicht überschreiten.
Phenol/Chloroform Extraktion
Zur Entfernung von Proteinen aus DNA- oder RNA-Lösungen wurden Phenol/Chloroform Extraktionen durchgeführt. Es wurde das Volumen der Lösung ggf. auf 80 µl mit ddH2O aufgefüllt, um mit nicht zu kleinen Volumina arbeiten zu müssen. Es wurde dann eine äquivalente Menge eines Phenol-/Chloroform-/Isoamylalkoholgemisches (25:24:1) hinzugegeben und mittels Vortexer gründlich gemischt. Es folgte eine Zentrifugation in der Tischzentrufuge bei 13000 upm für 3 min. Es wurde dann der wäßrige, die DNA/RNA enthaltende Überstand abgehoben und in ein frisches Gefäß gegeben. Es wurde erneut die gleiche Menge des Phenol-/Chloroform-/Isoamylalkoholgemisches hinzugefügt und der Vorgang wiederholt. Die wässrige Phase wurde dann mit dem gleichen Volumen eines Chloroform-/Isoamylalkoholgemisches (24:1) auf dem Vortexer gemischt, um das in geringen Mengen in der wässrigen Phase gelöste Phenol wieder zu entfernen. Es folgte eine erneute den vorherigen entsprechende Zentrifugation. Der nun abgehobene wäßrige Überstand wurde mit Ethanol präzipitiert.
Ethanol Präzipitation von DNA und RNA
Um die DNA oder RNA aus einer Lösung zu fällen, wurde eine Ethanol Präzipitation durchgeführt. Es wurde hierzu der Lösung 3 M NaAc, pH 7,0 in einem 1/10 des Ausgangsvolumens sowie 100% Ethanol in der 3-fachen Menge des Ausgangsvolumens hinzugefügt. Mittels Vortexer wurde gründlich gemischt. Die Lösung wurde dann je nach Menge der zu präzipitierenden DNA oder RNA für unterschiedlich lange Zeit bei entweder –20°C oder auf Trockeneis inkubiert. Größere Mengen von Plasmid DNA wurden für 15 min bei –20°C, geringe Mengen von RNA wurden für 45 min auf Trockeneis inkubiert. Der Niederschlag wurde bei 13000 upm für 15 min abzentrifugiert. Das DNA Pellet wurde in ddH2O aufgenommen.
2.1.1.4. Ligation der APOBEC-1 cDNA in den Vektor pGBT9
Das mit PST I und ECO R I geschnittene PCR-Produkt wurde nun in den mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnittenen, linearisierten Vektor pGBT9 ligiert.
Ligation von DNA-Fragmenten in Vektoren
100 ng Vektor-DNA wurden mit einer äquimolaren Menge des DNA-Fragmentes in den vom Hersteller empfohlenen Pufferbedingungen in einem Gesamtansatz von 20µl mit 1 Unit T4-DNA-Ligase versetzt und für mindestens 4 h bei 16°C inkubiert.
2.1.1.5. Herstellung kompetenter E. coli Bakterien und Transformation des Ligationsproduktes
Nun wurde das Produkt der Ligasereaktion in zuvor präparierte kompetente E. coli transformiert
Herstellung kompetenter E. coli Bakterien (DH5a )
TB-Lösung (filtersterilisiert):
10 mM |
Pipes-KOH, pH 6,7 |
15 mM |
CaCl2 |
250 mM |
KCl |
55 mM |
MnCl2 |
SOB-Medium:
20 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 10 mmol NaCl und 2,5 mmol KCl wurden in einem Geamtvolumen von 1 l in destilliertem Wasser gelöst, auf einen pH von 7,0 eingestellt und autoklaviert. Danach wurden 10 mmol MgCl2 aus einer 2 M filter-sterilisierten Vorratslösung zugegeben.
10 ml SOB-Medium wurden mit einer Kolonie frisch ausgestrichener E. coli Bakterien (DH5a ) angeimpft und über Nacht bei 37°C und ~220 upm inkubiert. 1 ml der Übernachtkultur wurde dann in 250 ml SOB-Medium in einem 2-Liter-Erlenmeyerkolben inokuliert. Es folgte eine Inkubation bei 37°C und ~220 upm bis eine OD600 von 0,5 erreicht war (ca. 4 – 8 h). Die Kultur wurde dann ca. 10 min auf Eis gekühlt. Alle folgenden Arbeiten wurden im Kühlraum (4°C) durchgeführt. Die Bakterien wurden bei ca. 2000 g für 15 min in sterilen 50 ml Röhrchen pelletiert. Die Pellets wurden dann in je 10 ml eiskalter TB-Lösung resuspendiert. Es folgte eine Inkubation für 10 min auf Eis. Die Bakterien wurden dann wie oben beschrieben abzentrifugiert und in insgesamt 25 ml eiskalter TB-Lösung resuspendiert. Die Bakterien wurden erneut für 10 min auf Eis inkubiert. Es wurde dann nicht gekühltes DMSO (Sigma) in einer Endkonzentration von 7 % (v/v) hinzugegeben. Die Bakterien wurden dann in Aliquots von 200 µl in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert. Mit dieser Methode wurde eine Transformationseffizienz von ca. 108 cfu/µg Plasmid DNA erreicht.
Transformation kompetenter Zellen
10 µl des Ligationsansatzes (ca. 50 ng DNA) wurden mit 100 µl kompetenten Zellen 45 min auf Eis inkubiert. Dann wurde der Reaktionsansatz für 90 sec auf 42°C erhitzt und sogleich für weitere 5 min auf Eis abgekühlt. Es wurden dann pro Reaktionsansatz 900 µl LB-Medium ohne Antibiotikum zugegeben und die Suspension für 45 min bei 37°C inkubiert. Nachdem die Bakterien durch kurze Zentrifugation pelletiert waren, wurden sie in 50 µl LB-Medium resuspendiert und auf den zuvor auf 37°C vorgewärmten LBAMP-Agarplatten mit Ampicillin ausgestrichen. Die benötigten Agarplatten und das LB-Medium wurden wie folgt angefertigt.
LB-Medium
10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt und 10 g NaCl wurden in 1 l destilliertem Wasser gelöst, auf einen pH von 7,0 eingestellt und autoklaviert.
LBAMP-Agarplatten
10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 10 g NaCl und 15 g Agarose wurden in 1 l destilliertem Wasser gelöst (pH 7,0) und die Lösung wurde autoklaviert. Nach Abkühlen auf 55°C wurde das Antibiotikum Ampicillin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml zugegeben und die Lösung unter sterilen Bedingungen auf 10 cm2 Petrischalen ausgegossen. Die Platten konnten dann bei 4°C gelagert werden.
2.1.1.6. Analyse der transformierten Klone
Von einigen gewachsenen Bakterienkolonien wurden nun DNA Minipräparationen angefertigt Durch Restriktionsenzymverdau und folgende Agarosegal-Elektrophorese konnten mehrere die APOBEC-1 cDNA beinhaltende Klone identifiziert werden. Die DNA Minipräparationen wurden wie folgt durchgeführt.
DNA-Minipräparation
Puffer 1: |
50 mM |
Tris-HCl, pH 8,0 |
Puffer 2: |
0,2 M |
NaOH |
10 mM |
EDTA, pH 8,0 |
1 % |
SDS |
||
100 µg/ml |
Rnase A |
||||
Puffer 3: |
3,0 M |
KAc, pH 5,5 |
1 ml Bakterien-Übernachtkultur in LB-Amp wurde 1 min in einer Tischzentrifuge mit ca 7000 upm abzentrifugiert und in 200 µl Puffer 1 resuspendiert. Zur Denaturierung der Bakterien wurden 200 µl Puffer 2 hinzugegeben und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde mit 200 µl Puffer 3 neutralisiert und 5 – 10 min bei Raumtemperarur inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation für 10 min bei 13000 upm in einer Tischzentrifuge. 450µl des Überstandes wurden mit 900 µl Ethanol versetzt und erneut bei 13000 upm für 15 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 70 % Ethanol gewaschen und in 50 µl TE Puffer aufgenommen.
2.1.1.7. Einfügen eines "Spacers" zwischen die GAL4 Bindungsdömäne und APOBEC-1
Um den korrekten Leserahmen herzustellen und um einen "Spacer" zwischen die GAL4 Bindungsdomäne und APOBEC-1 einzufügen wurden die komplementären Oligonukleotide GAP 1 und GAP 2 in das mit Eco RI linearisierte Plasmid ligiert. Die Oligonukleotide GAP 1 und GAP 2 wurden so gewählt, daß nach dem Annealing der komplementären Sequenzen kompatible Enden für Eco RI entstanden. Um bei diesem Klonierungsschritt eine intramolekulare Verbindung des mit Eco R I linearisierten Plasmids zu verhindern, wurde eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase durchgeführt.
Abspaltung von 5`-Phosphaten durch alkalische Phosphatase
Die Vektor-DNA wurde in 100 µl TE gelöst und 1 h bei 37°C mit alkalischer Phosphatase (1 U/µg DNA) inkubiert. Die Vektor-DNA wurde anschließend durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation gereinigt.
Das Ligationsprodukt wurde transformiert und DNA-Minipräparationen einiger Bakterienkolonien wurden angefertigt.
2.1.1.8. Sequenzierung des Konstruktes pGBT9-APOBEC-1
Das wie oben beschrieben konstruierte Plasmid pGBT9-APOBEC-1 wurde mit dem Oligonukleotid 5`BD sequenziert
DNA Sequenzierung
DNA Sequenzierungen wurden mit Hilfe des ABI PRISMÔ Dye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction Kit (Perkin Elmer) durchgeführt. Es wurden dabei 1 – 2 µg der zu sequenzierenden Plasmid DNA mit 15 pmol des jeweiligen Oligonukleotids mit 8 µl des taq und fluoreszierende Nukleotide enthaltenden Reaktionsmixes des "Kits" in einem Gesamtvolumen von 20 µl zusammengegeben. Es folgte eine Erhitzung auf 96°C für 1 min und 25 Zyklen mit folgenden Einstellungen im Thermo-Cycler: 10 sec 96°C, 5 sec 50°C, 4 min 60°C. Die DNA wurde dann durch Zugabe von 50 µl Ethanol präzipitiert. Die Sequenz wurde maschinell gelesen.
Es konnte so der korrekte Leserahmen für APOBEC-1 innerhalb des Plasmids pGBT9-APOBEC-1 als Fusionsprotein mit der GAL4 DNA-Bindungsdomäne sichergestellt werden. Es wurden nun DNA-Maxipräparationen dieses Klones exakt nach dem Protokoll und mit den Ionenaustauschsäulen der Firma Qiagen angefertigt, um über größere Mengen DNA verfügen zu können.
2.1.2. Materialien für Hefekulturen
2.1.2.1. YPD Medium
20 g Difco Peptone, 10 g Hefeextrakt und 18 g Agar (für die Herstellung von Agarplatten) wurden in einem Gesamtvolumen von 950 ml in destilliertem Wasser gelöst, auf pH 5,8 eingestellt und autoklaviert. Nach Abkühlen der Lösung auf 55°C wurden 50 ml einer zuvor filter-sterilisierten 40 % Glucoselösung (2 % Endkonzentration) hinzugegeben. Die Agarlösung wurde dann sogleich in sterile Petrischalen gegossen.
2.1.2.2. SD Medium (synthetisches Dropout Medium)
SD Medium wurde als Mangelmedium für die Selektion nach Transformation der Hefen genutzt. Sie besteht aus einer aminosäurefreien Stickstoffbasis aus Hefen und aus einer sogenannten Dropout Lösung. Die Dropout Lösung enthält Nukleotide und Aminosäuren, von denen eine oder mehrere fehlen, so daß nur transformierte Hefen wachsen können.
Zur Herstellung von 1 l SD Medium wurden 6,7 g Difco Stickstoffbasis aus Hefen ohne Aminosäuren und 15 – 20 g Agar (falls für Agarplatten benötigt) in einem Gesamtvolumen von 850 ml in destilliertem Wasser gelöst, auf pH 5,8 eingestellt und autoklaviert. Nach Abkühlen auf ca. 55°C wurden 50 ml einer 40 % filter-sterilisierten Glucose Lösung und 100 ml der entsprechenden autoklavierten 10 x Dropout Lösung hinzugegeben. Agarlösung wurde in sterile Petrischalen ausgegossen.
2.1.2.3. 10 x Dropout Lösung
Zur Herstellung einer 10 x Dropout Lösung wurden folgende Komponenten in den angegebenen Konzentrationen gelöst und autoklaviert. Es wurden folgende Dropout Lösungen angefertigt:
L-Isoleucin |
300 mg/l |
L-Valin |
1500 mg/l |
L-Adenin Hemisulfat Salz |
200 mg/l |
L-Arginin HCl |
200 mg/l |
L-Histidin HCl Monohydrat |
200 mg/l |
L-Leucin |
1000 mg/l |
L-Lysin HCl |
300 mg/l |
L-Methionin |
200 mg/l |
L-Phenylalanin |
500 mg/l |
L-Threonin |
2000 mg/l |
L-Tryptophan |
200 mg/l |
L-Tyrosin |
300 mg/l |
L-Uracil |
200 mg/l |
2.1.3. Materialien für Hefentransformation
2.1.3.1. PEG/LiAc Lösung
Diese Lösung wurde unmittelbar vor jeder Transformation frisch aus den Vorratslösungen wie folgt hergestellt:
Endkonzentration |
für 10 ml Lösung |
|
PEG 4000 |
40 % |
8 ml 50 % PEG |
TE Puffer |
1 x |
1 ml 10 x TE |
LiAc |
1 x |
1 ml 10 x LiAc |
2.1.3.2. Hering-Hoden carrier DNA
Hering-Hoden DNA (Sigma) wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in destilliertem Wasser gelöst und soniziert, bis eine deutliche Reduktion der Viskosität erreicht war. Nach Phenol/Chloroform Extraktion und Ethanol Präzipitation wurde die DNA in einer Konzentration von 10 mg/ml in 1 x TE Puffer gelöst und bei –20°C gelagert.
2.1.3.3. Vorratslösungen
2.1.4. Materialien für b -Galaktosidase Filter Assays
2.1.4.1. Z Puffer
Folgende Substanzen wurden in den angegebenen Konzentrationen in destilliertem Wasser gelöst, der pH von ~7,0 überprüft und autoklaviert.
Na2HPO4 * 7 H2O |
16,1 g/l |
NaH2PO4 * H2O |
5,5 g/l |
KCl |
0,75 g/l |
MgSO4 * 7 H2O |
0,246 g/l |
2.1.4.2. X-gal Vorratslösung
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b -D-Galactopyranosid (X-GAL) wurde in einer Konzentration von 20 mg/ml in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und dunkel bei –20°C gelagert.
2.1.4.3. Z Puffer/X-gal Lösung
Unmittelbar vor Durchführung des b -Galaktosidaseassays angefertigt:
100 |
ml |
Z Puffer |
0,27 |
ml |
b -Mercaptorthanol |
1,67 |
ml |
X-gal Vorratslösung |
2.1.4.4. Weitere Materialien
2.1.5. Überprüfung des Phänotyps der Hefenstämme HF7c und SFY526
Bevor mit dem Genbank-Screening begonnen werden konnte, wurde der Phänotyp der eingesetzten Hefenstämme HF7c und SFY526 zu überprüfen. Hierzu wurden verschiedene Mangelagar hergestellt und des Wachstumsverhalten der Hefen beobachtet. Damit das Selektionsprinzip funktionieren konnte, war es absolut notwendig, daß die Hefen kein eigenständiges Wachstum ohne vorherige Transformation mit den Plasmiden pGBT9 und pGAD auf den entsprechenden Mangelagarplatten zeigten.
Zunächst wurden die von der Firma ClontechR gelieferten Hefen auf frischen YPD-Platten ausgestrichen und für 3 Tage bei 30°C inkubiert. Die so gewonnenen Arbeitskulturen wurden mit Parafilm abgedeckt und konnten für 2 Monate bei 4°C gelagert werden. Alle weiteren Arbeiten wurden mit Kolonien dieser Platten durchgeführt.
Unter sterilen Bedingungen wurden einzelne Kolonien beider Hefenstämme auf folgenden SD Medien ausgestrichen und bei 30°C inkubiert: SD(-Trp), SD(-Leu), SD(-His) und SD(-Ura). Das Wachstum der Hefen wurde für 6 Tage beobachtet, es zeigten sich folgende Ergebnisse:
SD Medium |
SFY 526 |
HF7c |
-Trp |
- |
- |
-Leu |
- |
- |
-His |
- |
-* |
-Ura |
+ |
+ |
*
HF7c zeigten ein sehr langsames Wachstum auf dem SD(-His) Medium, bedingt durch eine schwache, basale Expression des HIS3 Reportergens. Es erschienen kleine Kolonien nach etwa 5 Tagen.
2.1.6. Präparation von Plasmid DNA der Rattenleber cDNA Genbank
Die Rattenleber MATCHMAKER cDNA Genbank im Vektor pGAD10 wurde von der Firma ClontechR erworben. Die Rattenleber cDNA wurde in die Eco RI Schnittstelle ligiert. Vor dem Screening mit Two Hybrid Selektion war es notwendig die Genbank zu titrieren. Hierzu verdünnten wir die E. Coli Suspension von 1:10 bis 1:106 und inkubierten die Verdünnungen auf LBAMP Agar. Nach Zählung der gewachsenen Kolonien ergab sich ein nach den Angaben des Herstellers ausreichender Titer von 4x108 cfu/ml (cfu = colony forming units). Bei diesem Titer der cDNA Genbank war nach Angaben des Herstellers mit etwa 106 unabhängigen Klonen und damit mit einer ausreichenden Repräsentanz der Genbank zu rechnen. Die Genbank wurde in LB Medium mit 25 % Glycerol aliquotiert, auf Trockeneis schockgefroren und in bei –80°C gelagert.
Zur Präparation von Genbank DNA plattierten wir die Coli Bakterien auf 15 – 20 etwa 20 x 20 cm großen LBAMP Agarplatten so aus, daß einzelne Kolonien wachsen konnten. Die am Folgetag geernteten Bakterien wurden entsprechend dem QiagenR Maxi Prep Protokoll präpariert. Wir konnten so von 0,3 – 1x106 Klonen 1 – 3 mg Plasmid DNA präparieren. Etwa 500 ng Plasmid DNA wurden mit Eco RI zur Analyse gespalten. Im Agarose Gel konnten wir eine homogene Verteilung der Insertgrößen zwischen 500 und 3000 bp sehen.
2.1.7. Libraryscreening in HF7c
2.1.7.1. Herstellung kompetenter HF7c-Zellen zur Libary-pGBT9-APOBEC-1-Cotransformation (in Klammern [] die Angaben für small-scale Transformationen)
Zunächst wurden 30 150 mm Agarplatten mit SD-Medium (-LTH) sowie eine 100 mm Agarplatte mit SD-Medium (-LT) vorbereitet. Eine Kolonie der HF7c-Zellen wurde in 50 ml [0,5 ml] YPD Medium resuspendiert und über Nacht bei 30°C mit ~230 upm geschüttelt bis die Zellen zu einer optischen Dichte (OD600 ) von 1,5 – 2,0 herangewachsen waren. Je 500 ml [150 ml] YPD Medium wurden in zwei 2l [500 ml]-Erlenmeyerkolben gegeben und dann so viel von der Übernachtkultur hinzugefügt, bis eine OD600 von 0,2 – 0,3 erreicht war. Die Zellen wurden dann für weitere 4 h bei 30°C und ~230 upm inkubiert. Die Kultur wurde dann 5 min bei Raumtemperatur und 1000 g pelletiert. Nach Abgießen des Überstandes wurden die Zellen in 500 ml [50 ml] 1 x TE Puffer resuspendiert und erneut für 5 min bei 1000 g zentrifugiert.
Der Überstand wurde dekantiert und die Zellen in 8 ml [1,5 ml] 1 x LiAc/TE Lösung aufgenommen. Die Zellen waren nun kompetent und für etwa 2 – 3 h bei Raumtemperatur zu verwenden.
2.1.7.2. pGBT9-APOBEC-1-Library-Cotransformation (in Klammern [] smale-scale)
Der DNA-Mix wurde wie folgt hergestellt: 20 mg [0,1 mg] [denaturierter Hering-Hoden DNA wurden mit je 500 µg Library Plasmid DNA und pGBT9-APOBEC-1 Plasmid DNA vermischt [100 ng je Plasmid]. 8 ml [0,1 ml] kompetente Zellen wurden zur DNA Mixtur hinzugegeben und gemischt. 60 ml [0,6 ml] PEG/LiAc Lösung wurden hinzugefügt und erneut gemischt. Die Zellsuspension wurde bei 30°C und ~230 upm für 30 min inkubiert.
Es wurden dann 7,6 ml [70 µl] DMSO zu einer Endkonzentration von 10 % hinzugefügt. Die Suspension wurde im Wasserbad für 15 min auf 42°C erhitzt und dabei gelegentlich gemixt. Die Zellen wurden für 5 min auf Eis gestellt und dann bei 1000 g für 5 min zentrifugiert [5 sec 13000 upm]. Das Zellpellet wurde in 50 ml [0,5 ml] 1 x TE Puffer aufgenommen und wie zuvor zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und die Zellen zum Ausstreichen in 10 ml [0,5 ml] 1 x TE Puffer resuspendiert.
Zur Kontrolle der Transformationseffizienz wurden 10 µl der Suspension auf einer 100 mm SD(-LT)-Agarplatte ausgestrichen. Je ~300 µl der Zellsuspension wurden auf insgesamt 30 150 mm SD(-LTH)-Agarplatten ausgestrichen [100 µl/100 mm Platte]. Die Platten wurden bei 30°C inkubiert.
2.1.7.3. Isolierung His+-Kolonien
Nach 2 – 3 Tagen erschienen die ersten Kolonien auf den SD(-LTH)-Platten, die auf einer frischen SD(-LTH)-Platte (Masterplate) und auf einem Master-Nitrocellulose-Filter, das einer entsprechenden Mangelagarplatte aufgelegt wurde, erneut angeimpft wurden. Auch Kolonien, die bis etwa nach sechs Tagen erschienen und eventuell einer schwächeren Interaktion entsprachen, wurden auf die Masterplate und das Nitrocellulose –Filter übertragen. Alle Kolonien wurden numeriert.
2.1.7.4. b -Galaktosidase Assay
Nach weiteren zwei Tagen wurden die HIS+-Kolonien mittels des b -Galaktosidase Assays auf Aktivierung Reportergens lacZ getestet. Wenn eine Interaktion zwischen einem Library-Protein und APOBEC-1 vorlag, sollte auch das zweite GAL4 abhängige Reportergen der HF7c-Zellen aktiviert werden. Dieser Assay wurde wie folgt durchgeführt. Zunächst wurde die Z Puffer/X gal Lösung wie beschrieben hergestellt.
Whatman #5 Papier wurde in einer Petrischale mit der Z Puffer/X gal Lösung bis zu Sättigung befeuchtet (~3,5 ml pro 150 mm Platte).
Der Master-Nitrocellulose-Filter wurde vorsichtig von der Mangelagarplatte abgehoben. Zum Teil wurden die Kolonien auch von der Agarplatte mit einem Blatt Nitrocellulose abgehoben, indem die Nitrocellulose kurz auf die Kolonien gedrückt wurde. Der Nitrocellulose-Filter wurde dann mit den Kolonien nach oben für 10 sec in flüssigen Stickstoff gegeben. Der Filter wurde bei Raumtemperatur wieder aufgetaut und dann mit den Kolonien nach oben auf das vorbereitete Whatman #5 Papier gelegt.
Es folgte eine Inkubation bei 30°C für maximal 8 h. Positive Kolonien färbten sich blau. Eine Positivkontrolle zur technischen Überprüfung des Assays wurde mitgetestet. Hierzu wurde eine mit dem Plasmid pCL1, das für das Wildtyp GAL4 Protein codiert, transformierte Hefekolonie genutzt. Die Positivkontrolle färbte sich innerhalb von ~15 min blau.
2.1.7.5. Isolierung von Plasmid DNA aus b -Galaktosidase+-Kolonien
Lyselösung
2 |
% |
Triton X-100 |
1 |
% |
SDS |
100 |
mM |
NaCl |
10 |
mM |
Tris HCl, ph 8,0 |
1 |
mM |
EDTA |
Die nach folgendem Protokoll präparierte Plasmid DNA konnte zur Transformation von E. coli mittels Elektroporation genutzt werden. Sie war jedoch ungeeignet für Restriktionsanalysen oder herkömmliche Transformation von E. coli.
2 ml YPD Medium wurden mit einer b -Galktosidase+-Kolonie direkt von der Masterplatte angeimpft und über Nacht bei 30°C und ~230 upm inkubiert. 1,5 ml der Übernachtkultur wurden in einer Tischzentrifuge pelletiert, der Überstand dekantiert und das Pellet in der verbleibenden Flüssigkeit resuspendiert. Zunächst wurden 200 µl der Lyselösung, dann 200 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und 0,3 g der säuregewaschenen glass beads (425-600 µm, Sigma) hinzugefügt. Das Gemisch wurde auf dem Vortexer für 2 min gründlich gemixt und dabei die Hefezellen mechanisch rupturiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 14000 upm für 5 min. Der Überstand wurde in ein frisches Tube transferiert und Ethanol präzipitiert (1/10 Volumen 3 M NaOAc pH 5,3 und 2,5 Volumen 100 % Ethanol). Nach der üblichen Zentrifugation wurde das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 µl 1 x TE Puffer gelöst.
2.1.7.6. Transformation elektrokompetenter E. coli durch Elektroporation
1µl der DNA Präparation aus den b -Galaktosidase+ Kolonien wurde mit 40 µl elektrokompetenten Zellen (DH5a ) vermischt und in eine spezielle Küvette zur Elektroporation gegeben. Unter folgenden Einstellungen wurde Elektroporation durchgeführt: Spannung 1,8 kV, Kapazität 25 µFD, Widerstand 200 W . Es wurden 1 ml LB-Medium ohne Antibiotikum zugegeben und die Bakterien in einem sterilen Gefäß für 45 min bei 37°C inkubiert. Die Bakterien wurden pelletiert und auf vorgewärmten LBAMP-Platten ausgestrichen.
2.1.7.7. Analyse der Plasmid DNA der b -Galaktosidase+-Klone
Von jeweils mehreren nach der Elektroporation gewachsenen Kolonien wurde eine DNA-Minipräparation angefertigt und mittels Restriktionsverdau (Eco RI) analysiert. Durch Eco RI Spaltung konnte das entsprechende Insert aus dem Library Plasmid geschnitten werden. Der Library Vektor pGAD10 erschien als 6,65 kb Bande im Agarose Gel. Das pGBT9-APOBEC-1 Konstrukt wurde durch Eco RI Spaltung linearisiert und erschien im Agarose Gel als 6,3 kb Bande. Außerdem konnte durch PCR mit den Oligonukleotiden 5`AD und 3`AD das entsprechende Insert amplifiziert werden. 5`AD und 3`AD annealen stromaufwärts bzw. stromabwärts der pGAD10 Library Cloning site.
Die so identifizierten und isolierten b -Galktosidase+ Klone wurden nun in einem small-scale Ansatz mit pGBT9-APOBEC-1 in beide Hefestämme HF7c und SFY526 cotransformiert und erneut auf Interaktion getestet: Wachstum auf dem Mangelagar und Testung auf b -Galaktosidaseaktivität.
Die Klone, deren Interaktion mit APOBEC-1 ein zweites Mal mit Two Hybrid Selektion bestätigt werden konnte, wurden mit den Oligonukleotiden 5`AD und 3`AD nach dem Protokoll des "ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction Kit" sequenziert. Von diesen Klonen wurden DNA Maxipräparationen nach dem Protokoll und mit den Ionenaustauschsäulen der Firma Qiagen angefertigt.
2.1.8. Mutagenese
Um die Spezifität der Interaktion von APOBEC-1 und hnRNP C1 genauer zu untersuchen, klonierten wir Trunkierungen des APOBEC-1 und des hnRNP C1 Proteins und testeten diese im Two Hybrid System auf Interaktion. Zudem war es notwendig, die volle Länge der hnRNP C1 cDNA in das Plasmid pGAD 424 zu klonieren und auf Interaktion mit APOBEC-1 zu testen. Es wurden folgende Proteintrunkierungen kloniert:
Die PCR-Produkte aller drei APOBEC Trunkierungen wurden über ein Agarosegel gereinigt und mit PstI geschnitten. Sie wurden dann in den zuvor mit PstI geschnittenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten Vektor pGBT9 ligiert. Es wurden Minipräparationen von Plasmid DNA jeweils mehrerer Klone angefertigt und durch Restriktionsanalyse mit PstI und Sequenzierung mit dem Oligonukleotid 5`BD auf die richtige Orientierung und den korrekten Leserahmen untersucht.
Die volle Länge der hnRNP C1 cDNA wurde mittels PCR mit den Oligonukleotiden Cs und Ca von dem Plasmid pHC12 (Swanson et al., 1987) amplifiziert. Das PCR Produkt wurde über ein Agarosegel gereinigt und mit BamHI geschnitten. Die Klonierung und Überprüfung auf richtige Orientierung und den korrekten Leserahmen erfolgte entsprechend der Klonierung von hnRNP C(1 – 93).
Die Plasmide wurden nach dem small-scale Protokoll in beide Hefenstämme SFY526 und HF7c cotransformiert.
2.2. Bakterielle Expression und Aufreinigung von hnRNP C1 Protein, M104, GST-APOBEC-1 und GST-Protein
2.2.1. Puffer
Extraktionspuffer:
50 mM |
HEPES-KOH, pH 7,5 |
500 mM |
NaCl |
10 mM |
NaS2O5 |
1 mM |
Dithiothreitol |
1 mM |
NaEDTA |
1µg/ml |
Leupeptin |
1 µg/ml |
Pepstatin |
0,5 % |
Aprotinin |
10 % (v/v) |
Glycerol |
H0-Puffer:
10 mM |
HEPES-KOH, pH 7,5 |
0,2 mM |
NaEDTA |
10 % (v/v) |
Glycerol |
ssDNA Puffer:
50 mM |
Na2HPO4, Na(H2PO4)2, pH 7,5 |
500 mM |
NaCl |
0,5 mM |
Dithiothreitol |
0,2 mM |
NaEDTA |
10 % (v/v) |
Glycerol |
Prä-Elutionspuffer: ssDNA Puffer + 1mg/ml Heparin
Elutionspuffer:
50 mM |
Na2HPO4, Na(H2PO4)2, pH 7,5 |
2 M |
NaCl |
0,5 mM |
Dithiothreitol |
0,2 mM |
NaEDTA |
10 % (v/v) |
Glycerol |
H150-Puffer:
10 mM |
HEPES-KOH, pH 7,5 |
0,2 mM |
NaEDTA |
150 mM |
NaCl |
10 % (v/v) |
Glycerol |
D-Puffer:
20 mM |
HEPES, pH 7,5 |
50 mM |
KCl |
0,5 mM |
EDTA |
10 % |
Glycerol |
PBS (Gibco)
2.2.2. Expression und Aufreinigung von hnRNP C1
ProteinDas Plasmid pExC1 wurde uns freundlicherweise von Dr. M. Göhrlach, Institut für Molekulare Biotechnologie e.V., Jena, zur Verfügung gestellt. pExC1 codiert für die volle Länge des hnRNP C1 Proteins in dem hitzeinduzierberem Expressionssystem mit dem Vektor pRC23 (Crowl et al., 1985).
Das Plasmid pExC1 wurde in den E. Coli Stamm RR1 transformiert. 50 ml LB(AMP) Medium wurden mit einer Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei Raumtemperatur und ~200 upm inkubiert. Die OD600 der Übernachtkultur sollte einen Wert von 0,6 nicht überschreiten. Die Bakterien wurden für 10 min bei 1000 g pelletiert und in 500 ml LB(AMP) Medium resuspendiert. Es folgte eine Inkubation bei 30°C und ~200 upm für weitere 4 – 6 h bis eine OD600 von 0,5 erreicht war. Die Bakterien wurden nun einem Hitzeschock unterzogen indem die Kultur durch Zugabe von ~250 ml frischem, auf 60°C vorgewärmten LB Medium auf 42°C erhitzt wurde, wodurch die Überexpression von hnRNP C1 gestartet wurde. Entsprechend der zugesetzten Menge LB Mediums wurde Ampicillin zu einer Endkonzentration von 50 µg/ml hinzugefügt. Die Kultur wurde für weitere 4 h bei 42°C und ~200 upm inkubiert. Die Bakterien wurden nun durch Zentrifugation für 10 min bei 1000 g bei 4°C pelletiert. Alle weiteren Schritte wurden bei 4°C oder auf Eis durchgeführt. Das Pellet wurde in 50 ml eiskaltem Extraktionspuffer aufgenommen. Um das intrazellulär lokalisierte hnRNP C1 Protein freizusetzen wurde die Bakteriensuspension soniziert. Es wurden hierzu je 5 ml eiskalter Suspension mit je 20 Schallzyklen von 1 sec Länge und einer Leistung von 60 W behandelt. Es folgte eine Zentrifugation für 1 h bei 100000 g in einem BeckmannR SW 40 Rotor. Der Überstand wurde nun mit einem Fluß von 1 ml/min auf eine Parmacia XK 16 DEAE-Cellulosesäule (c. 25 ml) geladen, die zuvor mit dem Extraktionspuffer äquilibriert wurde. Der "flow through" wurde direkt auf eine 10 ml große, ebenfalls mit dem Extraktionspuffer äquilibrierten ssDNA-Cellulosesäule geladen. Die ssDNA- Säule wurde gründlich mit ssDNA Puffer gewaschen, bis die OD280 des "flow through" auf die Extinktionswerte für den Puffer gesunken waren. Es folgte nun ein Prä-Elutionsschritt, indem ein Säulenvolumen des Prä-Elutionspuffers, der 1 mg/ml Heparin enthält, mit einem Fluß von 1 ml/min über die Säule gegeben wurde. Die Elution des rekombinanten hnRNP C1 erfolgte mit dem 2 M Salz enthaltenden Elutionspuffer. Die Elution wurde fraktioniert gesammelt und die Fraktionen mit der größten OD280 wurden gepoolt. Die Reinheit des rekombinanten Proteins wurde durch SDS-PAGE auf einem 15 % Polyacrylamidgel und anschließender Coomassie-Färbung abgeschätzt und betrug etwa 95 %. Die Proteinlösung wurde gegen D-Puffer dialysiert und über eine mit diesem Puffer äquilibrierte Superose 12 Säule (Pharmacia) zur Homogenität gereinigt. Das aufgereinigte Protein wurde erneut mittels SDS-PAGE analysiert. Dabei wurde wie folgt vorgegangen.
2.2.2.1 Proteinauftrennung durch SDS-PAGE
Zur Auftrennung von Proteinen wurde die denaturierende Gelelektrophorese in Polyacrylamidgelen durchgeführt (Laemmli et al., 1970 ; Studier et al., 1973). Es wurden 10 %, 15 % und 17,5 % Polyacrylamidgele mit 5 % Obergelen in einer Größe von 10 x 10 cm mit dem Gelsystem von HoeferR wie folgt hergestellt:
10% (15%) (17,5%)Gel:
10 % |
15 % |
17,5 % |
|
10 ml |
15 ml |
17,5 ml |
Acrylamid-bis (30 % [w/v] Acrylamid 0,8 % [w/v] Bis-Acrylamid) |
7,5 ml |
7,5 ml |
7,5 ml |
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 |
11,8 ml |
6,8 ml |
4,5 ml |
ddH2O |
0,6 ml |
0,6 ml |
0,6 ml |
10 % (w/v) SDS |
0,2 ml |
0,2 ml |
0,2 ml |
10 % (w/v) Ammoniumpersulfat |
10 µl |
10 µl |
10 µl |
TEMED (Biorad) |
Die Komponenten wurden zusammengegeben, gemixt und das Gel konnte in die vorbereitete Glasplattenapparatur gegossen werden. Nach der Polymerisation wurde das Obergel angefertigt.
5 % Obergel:
3,32 ml |
Acrylamid-bis (30 % [w/v] Acrylamid 0,8 % [w/v] Bis-Acrylamid) |
5 ml |
05, M Tris-Hcl, pH 6,8 |
11,4 ml |
ddH2O |
0,2 ml |
10 % (w/v) SDS |
0,3 ml |
10 % (w/v) Ammoniumpersulfat |
10 µl |
TEMED (Biorad) |
Die Lösung für das 5 % Obergel wurde auf das bereits 10 % oder 15 % Gel gegeben, der die Taschen formende Kamm wurde eingefügt. Nach ca. 20 min konnte das Gel benutzt werden.
[5x] Ladepuffer
0,1 M |
Tris-HCl, pH 6,8 |
2 % (w/v) |
SDS |
20 % (v/v) |
Glycerol |
0,01 % (w/v) |
Bromophenol Blau |
1 % (v/v) |
b -Mercaptoethanol |
Die Proben wurden nun in [1x] Ladepuffer in einem maximalen Volumen von 100 µl für 5 min auf 95°C erhitzt und konnten dann auf das Gel geladen werden.
[10x] Laufpuffer
200 mM |
Tris-Glycin, pH 8,8 |
0,8 % |
SDS |
Die Gelelektrophorese wurde in [1x] Laufpuffer mit einer Stromstärke von 40 mA durchgeführt.
Die Gele wurden dann in 25 % Methanol und 10 % Eisessig für 45 min bei Raumtemperatur zur Fixation inkubiert. Es folgte eine Färbung für 30 min mit Coomassie Blau. Die Gele wurden dann in 10 % Methanol und 10 % Eisessig über 6 – 8
h entfärbt, bis die Proteinbanden gut sichtbar waren.
2.2.3. Expression und Aufreinigung von M104
Das Plasmid M104pET11A, das für die Aminosäuren 1 – 104 des hnRNP C1 codiert, wurde uns ebenfalls freundlicherweise von Dr. M. Görlach zur Verfügung gestellt.
Zunächst wurden von dem E. coli Stamm BL21 frische kompetente Zellen mit der Calciumchlorid-Methode hergestellt. Das Plasmid wurde transformiert und am folgenden Tag eine 50 ml Übernachtkultur mit einer einzelnen Kolonie angeimpft, die bei 37°C inkubiert wurde. Die Zellen der Übernachtkultur wurden in 500 ml frischem LBAMP Medium resuspendiert und bei 37°C und ~220 upm inkubiert, bis eine OD600 von 0,5 erreicht war. Die Expression des rekombinaten Protein wurde dann durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,1 mM induziert und die Inkubation für weitere 4 h fortgesetzt. Die Kultur wurde für 10 min auf Eis gekühlt und bei 4°C für 10 min zentrifugiert. Die pelletierten Bakterien wurden dann in 50 ml eiskaltem Extraktionpuffer aufgenommen und in der gleichen Weise soniziert, wie zuvor für das rekombinante hnRNP C1 beschrieben. Es wurde dann die Natriumchlorid-Konzentration durch Zugabe von 116 ml des salzfreien H0-Puffers auf 150 mM gesenkt. Die Suspension wurde nun für 1 h bei 100000g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine mit H150-Puffer äquilibrierte Pharmacia XK 16 DEAE-Cellulosesäule gegeben. Der "flow-through" wurde direkt auf eine 10 ml ssDNA-Cellulosesäule gegeben, die dann gründlich mit einem nur 150 mM NaCl enthaltenden ssDNA-Puffer gewaschen wurde, bis die OD280 des "flow-through" auf Extinktionswerte für den Puffer gesunken war. Eluiert wurde mit dem 500 mM NaCl enthaltenden ssDNA-Puffer. Die Elution wurde entsprechend der hnRNP C1-Aufreinigung fraktioniert und mit SDS-PAGE analysiert. Die Proteinlösung wurde ebenfalls gegen D-Puffer dialysiert.
2.2.4. Expression und Aufreinigung von GST-APOBEC-1
Das Plasmid pGEX2T-APOBEC-1 wurde uns freundlicherweise von Dr. N. Navaratnam, Imperial School of Medicine, London, U.K., zur Verfügung gestellt.
In diesem Vektor ist die volle Länge der APOBEC-1 cDNA in den Vektor pGEX2T (PharmaciaR) kloniert, so daß für ein Fusionsprotein aus Gluthationtransferase und APOBEC-1 codiert wird. Die Aufreinigung des Fusionsproteins erfolgt durch Affinitätschromatographie mit Gluthationspharose-Säulen. Eluiert wird das rekombinante Protein durch eine Gluthationlösung.
Eine Übernachtkultur von 50 ml LBAMP wurde mit einer einzelnen Kolonie von frisch transformierten DH5a angeimpft und bei 37°C und ~220 upm inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 1000 g pelletiert und in 500 ml frischem LBAMP Medium resuspendiert. Es folgte nun eine Inkubation bei 37°C und ~220 upm für etwa 2 h, bis eine OD600 von 0,75 erreicht war. Zur Induktion der Expression von GST-APOBEC-1 wurde nun IPTG zu einer Enkonzentration vom 0,1 mmol/l hinzugefügt. Die Bakterien wurden nun für weitere 4 h wie vorher inkubiert. Die Zellen wurden wie oben beschrieben pelletiert und in 50 ml eiskaltem PBS aufgenommen. Zur Freisetzung des intrazellulär lokalisierten Proteins wurden die Bakterien soniziert. Es wurden hierzu je 5 ml eiskalter Suspension mit je 20 Schallzyklen von 1 sec Länge und einer Leistung von 60 W behandelt. Es wurden dann 5 ml einer 10% Triton X-100 in PBS Lösung hinzugefügt und die Suspension wurde für 30 min leicht schüttelnd bei 4°C inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 30000 g für 15 min. Der Überstand wurde auf eine Gluthation-Sepharose Redi PackR Column (Pharmacia) geladen. Es wurde also eine Affinitätschromatographie mit dem an Sepharose gebundenen Substrat des GST-Anteils des Fusionsproteins durchgeführt. Die Säule wurde mit 40 ml eiskalter PBS Lösung gewaschen. Die Elution erfolgte mit 6 ml einer Lösung von 1 mM reduziertem Gluthation in PBS. Die Proteinlösung wurde gegen D-Puffer dialysiert. Es erfolgte eine Analyse des rekombinanten Proteins mittels SDS-PAGE.
2.2.5. Expression und Aufreinigung von GST-Protein
Das Plasmid pGEX2T-APOBEC-1 wurde mit BamHI geschnitten, wodurch die APOBEC-1 cDNA aus dem Vektor herausgeschnitten wurde. Die pGEX2T Vektorbande wurde über ein Agarosegel gereinigt und religiert. Nach Transformation des Ligationsproduktes in E. coli (DH5a ), Plasmid DNA Präparation und Restriktionsanalyse zeigte sich das Plasmid pGEX2T (Pharmacia). Die Expression und Aufreinigung des GST-Proteins erfolgte exakt so, wie für GST-APOBEC-1 beschrieben.
2.3. In vitro mRNA Editing Assay
2.3.1. Lösungen
[10x] RNA-Polymerase Puffer:
400 |
mM |
Tris-HCl, pH 8,0 |
60 |
mM |
MgCl2 |
40 |
mM |
Spermidine |
50 |
mM |
NaCl |
100 |
mM |
DTT |
1 |
mg/ml |
Rinderserum-Albumin |
[10x] 4-NTP-Mix:
5 |
mM |
ATP |
5 |
mM |
GTP |
5 |
mM |
CTP |
5 |
mM |
UTP |
Puffer A:
96 |
mM |
NaCl |
1,5 |
mM |
KCl |
27 |
mM |
Natriumzitrat |
8 |
mM |
KH2PO4 |
5,6 |
mM |
Na2HPO4 |
pH 7,3 |
Puffer B:
137 |
mM |
NaCl |
2,7 |
mM |
KCl |
8,1 |
mM |
Na2HPO4 |
1,5 |
mM |
KH2PO4 |
1,5 |
mM |
EDTA |
0,25 |
mM |
DTT |
Puffer C:
10 |
mM |
HEPES |
10 |
mM |
KCl |
1,5 |
mM |
MgCl2 |
0,25 |
mM |
DTT |
pH 7,9 |
Puffer D:
20 |
mM |
HEPES |
100 |
mM |
KCl |
0,5 |
mM |
EDTA |
20 |
% (v/v) |
Glycerol |
pH 7,5 |
Stop Lösung:
100 |
mM |
Tris-HCl pH 8,0 |
1 |
% (w/v) |
SDS |
400 |
mM |
NaCl |
0,3 |
mg/ml |
Proteinase K |
0,6 |
mg/ml |
tRNA |
Primer extension Puffer:
50 |
mM |
Tris-HCl pH 8,2 |
6 |
mM |
MgCl2 |
10 |
mM |
DTT |
1 |
mM |
dATP |
1 |
mM |
dCTP |
1 |
mM |
dTTP |
1 |
mM |
ddGTP |
Sequencing dye:
75 |
% (v/v) |
deionisiertes Formamid |
0,1 |
% (w/v) |
Bromophenol Blau |
0,1 |
% (w/v) |
Xelen Cyanol |
2.3.2. Transkription von Apo B RNA (55 Nukleotide)
Für die Arbeiten mit RNA wurden ausschließlich Rnase-freie Reagenzien verwendet.
2 µg der zuvor mit HindIII geschnittenen pBS55 DNA (Greeve et al., 1991) wurden in einem Gesamtansatz von 20 µl mit [1x] 4-NTP-Mix, [1x] RNA-Polymerase Puffer, 1,5 µl RNA guardâ (Pharmacia) und 20 U T3-RNA-Polymerase für 1 h bei 37°C inkubiert. Es wurden dann 10 U RNase-freie DNase I hinzugefügt und die Inkubation für 15 min fortgesetzt. Das Volumen wurde dann auf 100 µl aufgefüllt und es folgten zwei Phenol/Chloroform Extraktionen sowie eine Chloroform Extraktion. Um die Nukleotide aus der RNA-Lösung zu entfernen, wurde eine spin-column Chromatographie mit Sephadex G50 Säulen (Pharmacia) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Es folgte dann eine Ethanol Präzipitation für 1 h auf Trockeneis. Nach 15 min Zentrifugation bei 13000 upm in einer Tischzentrifuge wurde das Pellet in 10 µl ddH2O aufgenommen. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte mittels der OD260. Es folgte zur Kontrolle des DNase-Verdaus und bedingt als bedingte Kontrolle der RNA Synthese eine Auftrennung von 1 µl auf einem 0,8 % Agarosegel.
2.3.3. Präparation von cytosolischem Rattendünndarm-Enterozyten-Extrakt
Nach Äthernarkose wurden 8 – 10 männliche CD-Ratten durch cervicale Dislokation getötet. Der Dünndarm inkl. Duodenum wurde entnommen und gründlich mit isotoner Kochsalzlösung gewaschen. Der Dünndarm wurde mit Puffer A gefüllt und 15 min bei 37°C in isotoner Kochsalzlösung inkubiert. Puffer A wurde durch Puffer B ersetzt und der Dünndarm für weitere 10 min wie zuvor inkubiert. Durch vorsichtige Manipulation wurden die Mucosazellen von der Darmwand gelöst und waren dann im Lumen des Darmes sichtbar. Der die Mucosazellen enthaltende Puffer B wurde auf Eis gesammelt. Alle weiteren Arbeitsschritte wurden bei 0 – 4°C ausgeführt.
Die Zellen wurden in einem "swinging bucket" Rotor bei ca. 100 g für 5 min pelletiert und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde in 4 Volumen des Puffers C resuspendiert und für 10 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden durch 25 Hübe in einem Dounce Homogenisator lysiert. Die Ruptur der Zellen wurde durch Lichtmikroskopie kontrolliert. Die Zellkerne und übrigen Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation für 10 min bei 2500 g in einem "swinging bucket" Roter entfernt. Der trübe Überstand wurde mit 1 M KCl Lösung auf 50 mM Kcl eingestellt und für 1 h bei 100000 g und 4 °C in einem Beckmann 70 Ti Rotor zentrifugiert. Der klare Überstand wurde für 4 – 6 h bei 4°C gegen Puffer D dialysiert und in kleinen Aliquots (50 µl – 100 µl) bei –20°C gelagert. Die Extrakte waren so für einige Monate stabil, wiederholtes auftauen und einfrieren wurde vermieden. Die Proteinkonzentration betrug nach dem Bradford Assay (Biorad) etwa 10 – 20 mg/ml.
2.3.4. Partielle Aufreinigung des Apo B mRNA Editing Enzyms aus cytosolischem Rattenenterozyten-Extrakt
2.3.4.1. Chromatographie mit DEAE-Sepharose
Das Editing Enzym wurde aus dem cytosolischen Rattenenterozytenextrakt durch Chromatographie mit einer DEAE-Sepharose-Säule (Pharmacia) wie folgt partiell aufgereinigt:
100 ml des Enterozytenextrakt mit einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml wurden in einem Puffer aus 20 mM HEPES, pH 7,3, 50 mM KCl und 1 mM EDTA auf eine 8 cm x 2,5 cm große, mit diesem Puffer äquilibrierte DEAE-Sepharose-Säule mit einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min geladen.
Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis die OD280 auf die Extinktionswerte für den Puffer zürückgekehrt war. Die gebundenen Proteine wurden mit einem Puffer aus 20 mM HEPES, pH 7,3, 300 mM KCl und 1 mM EDTA eluiert, wobei die Elution in Fraktionen von 5 ml gesammelt wurde. Die proteinreichen Fraktionen wurden gepoolt und gegen einen Puffer aus 20 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 1 mM EDTA und 20 % (v/v) Glycerol dialysiert.
Das über die DEAE-Säule partiell aufgereinigte Editing Enzym wurde in kleinen Aliquots (50µl – 100 µl) bei –20°C gelagert und auf in vitro Editing Aktivität getestet.
2.3.4.2. Chromatographie mit Heparin-Agarose
Zunächst wurde eine High TrapR Heparin-Säule (Pharmacia) mit einem Puffer aus 20 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 20 % (v/v) Glycerol, pH 7,3 äquilibriert. Die im in vitro Editingassay aktiven Fraktionen nach der Aufreinigung über die DEAE-Sepharose wurden in diesem Puffer mit einer Flußrate von 0,5 ml/min auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit demselben Puffer gewaschen bis die OD280 auf die Extinktionwerte für den Puffer gesunken waren. Eluiert wurde in einem Schritt, indem die KCl Konzentration auf 300 mM erhöht wurde. Die proteinreichen Fraktionen wurden gepoolt und gegen einen Puffer aus 20 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 1 mM EDTA und 20 % (v/v) Glycerol dialysiert. Es wurde dann die Aktivität im Editingassay geprüft. Das über die Heparin-Säule partiell aufgereingte Editing Enzym wurde in kleinen Aliquots bei –20°C gelagert. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren wurde vermieden.
2.3.5. In vitro Editing Reaktion
10 – 20 µg des S100 Rattendünndarm Extraktes bzw. entsprechende Mengen des partiell aufgereinigten Apo B mRNA Editing Enzymkomplexes mit oder ohne zusätzlich hinzugefügte rekombinante Proteine wurden in einem Gesamtansatz von 20 µl mit 1 nM RNA Substrat, 10 mM HEPES, pH 8,0, 50 mM KCl, 50 mM EDTA und 10 % Glycerol mit 10 U RNase Inhibitor für 2 h bei 30°C inkubiert.
Dann wurden in den Reaktionsansatz 40 µl Stop Puffer und 40 µl ddH2O gegeben. Die Lösung wurde von Proteinen durch zwei aufeinanderfolgende Phenol/Chloroform-Extraktionen und eine Chloroform-Extraktion gereinigt. Die RNA wurde durch Zugabe von 10 µl 3 M Natriumazetat, pH 7,0 und 300 µl Ethanol für 30 min auf Trockeneis gefällt. Durch 15 min Zentrifugation bei 13000 upm in einer Tischzentrifuge wurde die RNA pelletiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde das Pellet luftgetrocknet.
2.3.6. Primer Extension Analyse
Markieren des Oligonukleotids DD3 mit g -[ 32P] ATP: 20 ng Oligonukleotid DD3 (komplementär zur Apo B RNA Sequenz [antisense] von Position 6708 bis Position 6674) wurden mit 10 U Polynukleotidkinase und 50 µCi g -[ 32P] ATP in 10 µl 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 6 mM MgCl2 für 1 h bei 37°C inkubiert.
Das kinasierte Oligonukleotid wurde durch spin-column Chromatographie mit einer Sephadex G50 Säule (PharmaciaR) den Angaben des Herstellers folgend aufgereinigt. Die spezifische Aktivität betrug in etwa 106 dpm/ng DNA.
Das RNA Pellet der in vitro Editing Reaktion wurde in 8 µl 1 x Primer extension Puffer mit etwa 105 dpm kinasiertem Oligonukleotid aufgenommen. Die Lösung wurde für 10 min bei 65°C zum Denaturieren der RNA inkubiert. Es folgte eine Inkubation für 5 min bei 42°C zum Annealing. Es wurden 0,5 U T4 Reverse Transkriptase in 2 µl ddH2O hinzugegeben und der Ansatz für 60 min bei 42°C inkubiert.
Der Reaktionsansatz wurde in einem Vakuumtrockner eingetrocknet und in 8 µl Sequencing dye aufgenommen und auf ein 8 % Polyacrylamid, 7 M Harnstoff, [1x] TBE, Sequenzgel geladen. Die Elektrophorese wurde bei 1500 V durchgeführt und das Gel im Anschluß bei 80°C unter Vakuum getrocknet. Die Autoradiographie des Gels erfolgte für ca. 8 h bei –80°C.
2.4. Oligonukleotide
Für die Klonierungen, Sequenzierungen und Primer-Extension Analysen wurden folgende Oligonukleotide verwendet, die im Institut für Zellbiochemie und Neurobiologie des Universitäts-Krankenhauses Eppendorf synthetisiert wurden. Alle Oligonukleotide in 5`-3` Richtung:
APOBEC IX |
ATGAATTCCGAGACAGGCCCTGTAGCTGTT |
APOBEC VI |
CGCTGCAGTCCCAGAAGTCATTTCAACCCTGTGGCCCA |
APOBEC XXI |
CGCCTGCAGTACGTACAGCCTCACACACAG |
APOBEC XXII |
CGCCTGCAGAGTTACATGGGGGTATCGGCACAA |
APOBEC XXIII |
GCTGCAGAAAGATACTTTTGTCCAAACACCAGA |
APOBEC XXIV |
GCTGCAGAGAGCAAGATGAGTTCCGAGACA |
GAPI |
AATTCTGCAGAACAATG |
GAPII |
AATTCATTGTTCTGCAG |
Cs |
gggatccaaatggccagcaacgttaccaacaag |
Ca |
cggatcctcatcctccattggcgctgtctct |
63-BamH |
AGGGATCCTCGGTTCACTTTTGGCTCTGC |
5`AD |
AACACTACAATGGATGATGTATATAAC |
3`AD |
GGTGAAGTGAACTTGCGGGG |
5`BD |
TCATCGGAAGAGAGTAG |
DD3 |
AATCATGTAAATCATAACTATCTTTAATATACTGA |
3. Ergebnisse
Zunächst wurde getestet, ob das Two-Hybrid System, wie es von der Firma ClontechR geliefert wurde, funktionsfähig war. Es mußte in der Lage sein, positive Ergebnisse zu produzieren. Hierzu wurden folgende Plasmide, von denen eine Aktivierung des GAL4-Promotors bekannt ist, in die Hefestämme HF7c und SFY526 transformiert. Es wurde dann über die Testung auf b -Galaktosidaseaktivität die Aktivierung des GAL4-Promotors verifiziert.
Plasmide:
pCL1: |
Wildtyp des GAL4 Transkriptionsaktivators, LEU2, Amp |
pVA3: |
p53 (72 – 390) der Maus in pGBT9, TRP1, Amp |
pTD1: |
SV40 large T-Antigen (84 – 708) in pGAD3F, LEU 2, Amp |
pLAM5`: |
Lamin C (66 – 230) des Menschen in pGBT9, TRP1, Amp |
Folgende Transformationen mit folgendem Ergebnis für b -Galaktosidaseaktivität wurden durchgeführt:
Plasmid 1 |
Plasmid 2 |
Selektionsmedium |
b -Galaktosidase-Aktivität |
|
HF7c |
SFY526 |
|||
pCL1 |
-L |
+ |
+ |
|
pVA3 |
pTD1 |
-LT |
+ |
+ |
pLAM5` |
pCL1 |
-LT |
+ |
+ |
Es konnte also mit unserem Two-Hybrid-System B-Galaktosidaseaktivität für bekannte Aktivatoren des GAL4-Promotors nachgewiesen werden.
Zudem mußte sichergestellt werden, daß die Transformation des Konstruktes pGBT9-APOBEC-1 allein nicht zu einer GAL4-Promotoraktivierung führt. Gleiches gilt für die alleinige oder die Cotransformation der Plasmide pGBT9 und pGAD424. Es wurden folgend Transformationen mit folgendem Ergebnis für die b -Galaktosidaseaktivität durchgeführt:
Plasmid 1 |
Plasmid 2 |
Selektionsmedium |
b -Galaktosidase-Aktivität |
|
HF7c |
SFY526 |
|||
pGBT9 |
-T |
- |
- |
|
pGAD424 |
-L |
- |
- |
|
pGBT9-APOBEC-1 |
-T |
- |
- |
|
pGBT9 |
pGAD424 |
-LT |
- |
- |
pGBT9-APOBEC-1 |
pGAD424 |
-LT |
- |
- |
Damit konnte hinreichend eine unerwünschte GAL4-Promotoraktivierung durch die eingesetzten Plasmide ausgeschlossen werden
3.2. Interaktion von APOBEC-1 mit hnRNPC1 Protein im Two Hybrid System in Hefen
Die cDNA von APOBEC-1 wurde in voller Länge in den Vektor pGBT9 kloniert, um als Zielprotein eine Rattenleber cDNA Library (MATCHMAKER rat liver library in pGAD10, ClontechR), die eine Komplexität von 106 unabhängigen Klonen unfasst, nach potentiellen Interaktionspartnern zu durchsuchen. Das Screening wurde im Hefestamm HF7c durch Cotransformation gleicher Mengen der pGAD10 Library Plasmide und pGBT9-APOBEC-1 durchgeführt. Insgesamt wurden 16 Librarytransformationen durchgeführt. Dabei wurden insgesamt 5950 µg Rattenleber-library DNA aus 6 unterschiedlichen Präparationen mit insgesamt 5,5 x 106 unabhängigen Klonen und die entsprechende Menge pGBT9-APOBEC-1 DNA eingesetzt. Die Transformationseffizienz variierte von 2 x 103 – 7 x 103 cfu/µg DNA. Durchschnittlich wurde eine Transformationseffizienz von etwa 5 x 103/µg DNA erreicht. Insgesamt wurden etwa 3 x 107 Hefen mit Plasmiden für die DNA-Bindungsdomäne und für die Aktivierungsdomäne cotransformiert. Durchschnittlich wurde also von jedem Klon der Rattenleber cDNA Library ca. 5,5 mal Plasmid DNA präpariert, die dann ca. 5,5fach zusammen mit pGBT9-APOBEC-1 in eine Hefezelle transformiert wurde. 1629 Hefekolonien wuchsen auf dem SD(-LTH) Agar und wurden auf b -Galaktosidaseaktivität getestet. 12 Klone zeigten durch eine Blaufärbung im b -Galaktosidaseassay eine Reportergenaktivierung an. Die Plasmid DNA dieser 12 Klone wurde durch Elektroporation in E. Coli transformiert und die pGAD10 Plasmid DNA isoliert. Alle 12 Klone wurden durch small-scale Cotransformation mit pGBT9-APOBEC-1 in den Hefenstämmen HF7c und SFY526 auf Echtheit der zuvor gezeigten Reportergenaktivierung getestet. Zwei Klone rekonstituierten die Reportergenaktivierung für HIS3 und lacZ und wurden mit den Oligonukleotiden 5`AD und 3`AD sequenziert (ABI PRISMR Cycle Sequencing ready Reaction Kit). Beide Klone codierten für Homologe des hnRNP C1 Protein der Ratte. Der eine Klon enthielt die cDNA für die Aminosäuren 1 – 223, der andere Klon für die Aminosäuren 1 – 229.
Die alleinige Transformation der für die Homologe des hnRNP C1 codierenden Plasmide in die Hefestämme HF7c und SFY526 hatte keine Reportergenaktivierung zur Folge ; es zeigte sich keine Blaufärbung im b -Galaktosidaseassay. Die Interaktion der beiden hnRNP C1 Homologe mit APOBEC-1, angezeigt durch lacZ-Positivität, ließ sich verläßlich in beiden Hefestämmen reproduzieren. Die zwei folgenden Abbildungen sollen die Ergebnisse des Genbankscreenings verdeutlichen.
3.3. Spezifität der Interaktion
Zur Überprüfung der Spezifität der Interaktion von APOBEC-1 und hnRNP C1 Protein führten wir eine Mutagenese-Untersuchung durch. Wir klonierten mehrere Trunkierungen der beiden Proteine in die entsprechenden Vektoren des Two-Hybrid Systems und testeten sie auf Protein-Protein-Interaktionen. Drei Trunkierungen von APOBEC-1 wurden in das Plasmid pGBT9 kloniert: APOBEC(1 –112), APOBEC(1 – 180), APOBEC(73 – 229), in Klammern jeweils der Bereich der Aminosäuren im offenen Leserahmen der cDNA.
Vom hnRNP C1 Protein klonierten wir zusätzlich zu den zwei im Two-Hybrid System als Interaktionspartner von APOBEC-1 identifizierten Trunkierungen eine weitere in den Vektor pGAD 424: hnRNP C(1 – 93). Zudem überprüften wir, ob der menschliche hnRNP C1 full-length-clone in dem Hefensystem mit APOBEC-1 interagiert. Dazu war es notwendig, die volle Länge der hnRNP C1 cDNA in das Plasmid pGAD 424 zu klonieren und auf Interaktion mit APOBEC-1 zu testen. Die Trunkierungen sind im Folgenden graphisch dargestellt:
Abbildung 5
Es wurde folgende Proteinkombinationen auf Interaktion getestet:
Proteinkombination |
Wachstum in HF7c SD(-LTH) |
b -Galaktosidaseaktivität in HF7c |
b -Galaktosidaseaktivität in SFY526 |
APOBEC-1 + hnRNP C1 |
+ |
+ |
+ |
APOBEC-1 + hnRNP C(1-223) |
+ |
+ |
+ |
APOBEC-1 + hnRNP C(1-93) |
+ |
- |
- |
APOBEC(1-112) + hnRNP C1 |
+ |
- |
- |
APOBEC(1-180) + hnRNP C1 |
+ |
- |
- |
APOBEC(73-229) + hnRNP C1 |
+ |
- |
- |
Eine Rekonstitution der b -Galaktosidaseaktivität stellte sich nur bei den Kombinationen von APOBEC-1 in voller Länge und hnRNP C1 entweder auch in voller Länge oder in Form der Trunkierung ein, die aus der Library herausselektioniert wurde. Alle anderen Trunkierungen zeigten keine Interaktion im Two Hybrid System.
3.4. hnRNP C1 Protein inhibiert partiell aus Rattenenterozyten aufgereinigtes Apo B mRNA Editing Enzym
Um die funktionelle Bedeutung der durch Two Hybrid Selektion identifizierten Interaktion zwischen APOBEC-1 und hnRNP C1 zu untersuchen, exprimierten wir hnRNP C1 in E. coli und reinigten das Protein säulenchromatographisch über DEAE-Säulen und ssDNA-Cellulose-Säulen auf. Durch anschließende size-exclusion Chromatographie über eine Superose 12 FPLC (PharmaciaR) Säule konnte ein sehr hoher Reinheitsgrad erreicht werden. Die hnRNP C1 Deletionsmutante M104, die nur die ersten 104 Aminosäuren und damit die RNA Bindungsdomäne umfaßt, wurde ebenfalls in E. Coli exprimiert und säulenchromatographisch aufgereinigt. Die Aufreinigungen von hnRNP C1 und M104 wurden im wesentlichen wie von Görlach, M. et al. 1994 beschrieben durchgeführt. APOBEC-1 exprimierten wir als GST (Glutathiontransferase) –Fusionsprotein (GST-APOBEC-1) in E. coli und reinigten das Protein durch Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose. Zudem exprimierten wir als Kontrollprotein GST-Protein alleine in E. Coli und reinigten es ebenfalls durch Affinitätschromatographie auf. Das Apo B mRNA Editing Enzym wurde aus Rattenenterozyten wie von Greeve et al. 1991 beschrieben zunächst über eine DEAE-Sepharose-Säule, dann über Heparin-Agarose partiell aufgereinigt.
Wir testeten den Einfluß von rekombinantem hnRNP C1 Protein und seiner Deletionsmutante M 104 sowie von rekombinantem GST-APOBEC-1 und des Gluthationtransferaseanteils (GST) dieses Fusionsproteins auf die Editingreaktion. Hierzu wurden mehrfach in vitro Editingreaktionen durchgeführt, wobei die rekombinanten Proteine in unterschiedlichen Konzentrationen dem partiell aufgereinigten Apo B mRNA Editing Enzym zugesetzt wurden. Ein repräsentatives Autoradiogramm zeigt Abbildung 6. Diese Abbildung zeigt in Bahn 1 und 2 zunächst die Aktivität der Heparinfraktion. Der Puffer allein als Negativkontrolle hat keine Editingaktivität (Abb. 6, Bahn 3). 0,1 µg hnRNP C1 Protein veränderte die Aktivität der Heparin-Fraktion nicht wesentlich (Abb. 6, Bahn 4). Durch Zugabe von 0,5 µg hnRNP C1 Protein zu 8 µg der Heparin-Fraktion ließ sich die Editingreaktion vollständig inhibieren (Abb. 6, Bahn 5). Ebenso ließ sich nach Zugabe von 1,0 µg und 1,5 µg hnRNP C1 Protein keine Editingaktivität mehr detektieren (Abb. 6, Bahn 6 – 7). Nach Zugabe von 1,5 µg GST-Protein zeigte sich keine Änderung der Editingaktivität (Abb. 6, Bahn 8). GST-Protein diente als Kontrollprotein für das rekombinante GST-APOBEC-1, um einen Einfluß des Gluthationtransferaseanteils des Fusionsproteins auszuschließen. Wir gaben 0,5 µg rekombinantes GST-APOBEC-1 zu der Heparin-Fraktion hinzu und beobachteten eine deutliche Steigerung der Editingaktivität (Abb. 6, Bahn 9). Bereits durch Zugabe von 100 ng hnRNP C1 Protein zu dem Mix aus Heparin-Fraktion und GST-APOBEC-1 zeigte sich eine Minderung der Editing Enzym-Aktivität, die in etwa der Ausgangsaktivität der Heparin-Fraktion entsprach (Abb. 6, Bahn 10). Nachdem die zugegebene Menge des hnRNP C1 Protein auf 0,5 µg oder 1,0 µg gesteigert wurde konnte keine Editingaktivität mehr detektiert werden (Abb. 6, Bahn 11 -12).
Um die Inhibition des Apo B mRNA Editings durch rekombinantes hnRNP C1 Protein genauer zu charakterisieren untersuchten wir die Auswirkungen der hnRNP C1 Deletionsmutante M104 auf die Editingaktivität. M104 umspannt die RNA-Bindungsdomäne des hnRNP C1 Protein. Ein repräsentatives Autoradiogramm zeigt Abbildung 7. Die durch 0,5 µg APOBEC-1 stimulierte Heparin-Fraktion wurde mit 0,25 µg, 0,5 µg, 1,0 µg und 1,5 µg hnRNP C1 Protein versetzt. Bereits durch Zugabe von 0,25 µg hnRNP C1 Protein wurde die Editingaktivität auf ein gerade noch zu detektierendes Maß reduziert (Abb. 7, Bahn 4). Nach Zugabe von 0,5µg oder mehr hnRNP C1 Protein war keine Editingaktivität mehr darstellbar (Abb. 7, Bahn 5 – 7). M104 wurde ebenfalls in Mengen von 0,25 µg, 0,5 µg, 1,0 µg und 1,5 µg zu der durch 0,5 µg GST-APOBEC-1 verstärkten Heparin-Fraktion hinzugefügt. Es zeigte sich für keine der angegebenen Konzentrationen eine Inhibition der Editingaktivität (Abb. 7, Bahn 8 – 11). GST-APOBEC-1 (0,5 µg) alleine ist nicht in der Lage Apo B mRNA zu editieren (Abb. 7, Bahn 12). GST-APOBEC-1 (0,5 µg) und hnRNP C1 Protein (0,5 µg und 1,0 µg) entwickelten genauso wie GST-APOBEC-1 (0,5 µg) und M104 (0,5 µg und 1,0 µg) ohne Zugabe von partiell aufgereinigtem Apo B mRNA Editing Enzym keine Editingaktivität (Abb.7, Bahn 13 - 16).
Abbildung 6
Abbildung 7
4. Diskussion
Um Proteine zu entdecken, die neben APOBEC-1 in den Prozeß des Apo B mRNA Editings involviert sind, führten wir Two-Hybrid-Selektion in Hefen durch. Two-Hybrid-Selektion ist ein modernes genetisches Screening-System zur Identifizierung von Interaktionen zwischen Proteinen. Durch Anwendung dieser Methode gelang bereits in der Vergangenheit der Nachweis zahlreicher Protein-Protein-Interaktionen von physiologischer Relevanz. So wurde beispielsweise die Interaktion zwischen den Onkoproteinen RAS und RAF mit Two-Hybrid Selektion indentifiziert (van Aelst et al., 1993). Wir untersuchten mit Two-Hybrid-Selektion 5,5 x 106 unabhängige Rattenleber cDNA Genbank Klone auf Bindung an APOBEC-1 und konnten eine Interaktion von hnRNP C1 Protein mit APOBEC-1 identifizieren. Der Nachweis der Interaktion gelang durch zwei Genbank-Klone, die Homologe des hnRNP C1 Protein der Ratte (Aminosäuren 1 – 223 bzw. 1 – 229) darstellen. Die zwei interagierenden Klone wurden in unterschiedlichen Screening-Experimenten und verschiedenen Genbank cDNA Präparationen isoliert. Die Bindung der beiden Proteine im Two-Hybrid-System bestätigte sich durch den Nachweis einer Interaktion von APOBEC-1 mit dem "full-length" hnRNP C1 Protein des Menschen. In Mutageneseexperimenten konnten wir das hohe Maß der Spezifität dieser Interaktion zeigen. Drei Trunkierungen von APOBEC-1 (Aminosäuren 1 – 112, 1 – 180 bzw. 73 – 229) zeigten keine Interaktion mit hnRNP C1 Protein. Auch eine weitere Trunkierung des hnRNP C1 Protein(Aminosäuren 1 – 93) interagierte nicht mit APOBEC-1 in den Hefezellen. hnRNP C1 Protein ist ein hochexprimiertes Kernprotein, das in Form von (C1)3 C2 –Tetrameren während der Transkription naszierende prä-mRNA bindet (Dreyfuss, 1986 ; Dreyfuss et al., 1993 ; McAffe et al., 1996). hnRNP C1 Protein inhibiert in vitro sehr effizient die enzymatische Aktivität des partiell aufgereinigten Apo B mRNA-Editing Enzymkomplexes. Zudem bindet hnRNP C1 Protein spezifisch an eine Apo B sense RNA von 55 Nukleotiden, welche die für das Editing notwendige Sequenz enthält (Greeve et al., 1998). Die Inhibierung des Apo B mRNA Editings in vitro beruht nicht auf einem das RNA-Substrat maskierenden Effekt durch ein RNA-Bindungsprotein, wie durch die Versuche mit der die RNA-Bindungsdomäne des hnRNP C1 Proteins enthaltenden Deletionsmutante M 104 gezeigt werden konnte. M104 bindet stark an die Apo B RNA, inhibiert jedoch nicht die Editingreaktion (Greeve et al., 1998). In Sedimentationsanalysen von nukleären Rattenleberextrakten sedimentierte das hnRNP C1 Protein ausschließlich in 40S hnRNP Komplexen, der Apo B mRNA Editing Enzym-Komplex jedoch im Bereich von 22 – 27S. Damit konnte gezeigt werden, daß das hnRNP C1 Protein kein Bestandteil des Apo B mRNA Enzym-Komplexes ist (Greeve et al., 1998). Das hnRNP C1 Protein könnte während der RNA-Prozessierung eine regulative, das Apo B mRNA-Editing limitierende Funktion haben.
Unsere Ergebnisse lassen sich gut mit denen von Lau et al., 1997 vereinbaren, die ebenfalls durch Two-Hybrid-Selektion eine Interaktion von APOBEC-1 mit ABBP-1 identifiziert haben. ABBP-1 ist ein 331 Aminosäuren umfassendes RNA-Bindungsprotein der Ratte, das bis auf eine Insertion am C-terminalen Ende identisch ist mit dem hnRNP A/B Protein des Menschen (Lau et al., 1997). Durch Immundepletion von ABBP-1 vermindert sich die in vitro Editingaktivität in S 100 Extrakten von stabil mit APOBEC-1 transfizierten HeG2-Zellen. Die Rate des endogenen Apo B mRNA Editings dieser Zellen wurde durch Transfektion eines ABBP-1 cDNA Antisensekonstruktes deutlich vermindert (Lau et al., 1997). hnRNP C1 Protein und hnRNP A/B haben in hohem Maße Sequenzhomologien (Burd et al., 1989). Es wurde gezeigt, das hnRNP C1 und hnRNP A1 Proteine an repetitive AUUUA Sequenzen in der nichttranslatierten 3` Region (3`UTR) verschiedener labiler mRNAs binden (Hamilton et al., 1993). Die hnRNP Proteine A1 und C scheinen durch die Bindung an diese repetitiven Pentanukleotide modulierend auf den zytoplasmatischen mRNA Umsatz und die Translationseffizienz einzuwirken (Hamilton et al., 1993). Für die hnRNP C Proteine wurde eine spezifische Interaktion mit stromabwärts (downstream) der Polyadenylierungs-Schnittstelle gelegenen RNA Sequenzen gezeigt (Wilusz et al., 1988). hnRNP C Proteine binden an ein 29 Nukleotide umfassendes, AU-reiches Motiv in der nichttranslatierten 3`Region (3`UTR) der mRNA des APP (amyloid precursor protein) und tragen damit zu einer Stabilisierung der mRNA bei (Zaidi et al., 1995). In der Apo B RNA existieren ein alternatives Polyadenylierungs-Signal und eine Polyadenylierungs-Schnittstelle stromabwärts des C-6666 gelegen, die sowohl in edierter wie auch in unedierter Apo B RNA genutzt werden können und zur Synthese von Apo B-48 in stabil mit einem Apo B-100 Minigen transfizierten Ratten-Hepatom-Zellen führen (Heinemann et al., 1994). Lau et al. entdeckten 1990 durch Crosslinking Experimente ein 40 kDa Protein aus nukleären Rattenleberextrakten, das spezifisch an synthetische Apo B RNAs mit einer Länge von 26 bis 65 Nukleotiden um die Editing-"site" gelegen bindet. Dieses 40 kDa Protein ist nie genauer charakterisiert worden. Eventuell handelte es sich um das hnRNP C1 Protein der Ratte, von dem gezeigt zeigen konnten, daß es sehr stark und spezifisch die Apo B RNA bindet (Greeve et al, 1998). In der Apo B mRNA existiert ein AUUUA-Motiv (Nukeotidposition 6697 – 6701) in unmittelbarer Nachbarschaft mit zwei AGUUA-Sequenzen (Nukleotidposition 6690 – 6694 und 6706 – 6711). Diese AU-reiche Region ist stromabwärts des C-6666 und der "mooring"-Sequenz (6671 – 6681) gelegen (Knott et al., 1986). APOBEC-1 bindet relativ unspezifisch an eine innerhalb und stromabwärts der "mooring"-Sequenz gelegene AU-reiche Region (Nukleotide 6680 – 6703), wie durch UV Crosslinking gezeigt werden konnte (Navaratnam et al., 1995 ; Navaratnam et al., 1998). Es existieren also drei Proteine, von denen gezeigt wurde, daß sie an den AU-reichen Abschnitt der Apo B mRNA stromabwärts der Editing-"site" (Nukleotidposition 6680 – 6711) binden: APOBEC-1, ABBP-1 und hnRNP C1 Protein. Eine mögliche Erklärung der starken Inhibition der in vitro Editingaktivität des partiell aufgereinigten Apo B mRNA Editing Enzyms durch hnRNP C1 Protein könnte also auf einer Verdrängung von APOBEC-1 oder ABBP-1 aus ihren RNA-Bindungen liegen. Denkbar wäre jedoch auch eine auf der Protein-Protein-Interaktion zwischen APOBEC-1 und hnRNP C1 Protein beruhende Inhibition der Editingaktivität. hnRNP C1 Protein könnte einerseits die Anlagerung von APOBEC-1 an das RNA-Substrat behindern oder andererseits die für die enzymatische Aktivität notwendige Dimerisierung von APOBEC-1 verhindern (Lau et al., 1994 ; Navaratnam et al., 1998). Ein Argument für die ursächliche Bedeutung der Protein-Protein-Interaktionen für die Inhibition des Editings liefert die hnRNP C1 Deletionsmutante M104, die trotz starker, wenn auch unspezifischer RNA-Bindung nicht zu einer Inhibition der in vitro Editingaktivität führt (Greeve et al., 1998). M104 enthält die RNA-Bindungsdomäne des hnRNP C1 Proteins und konkurriert somit gleichsam mit APOBEC-1 und ABBP-1 um die Bindung an die Apo B RNA.
Durch Greeve et al. konnte zudem gezeigt werden, daß auch 40S hnRNP Komplexe, die aus nukleären Rattenleberextrakten präpariert wurden, die Editingreaktion in gleichem Maße inhibieren wie rekombinantes hnRNP C1 Protein (Greeve et al., 1998). Zusammengenommen deuten die hier gezeigten Ergebnisse, insbesondere auch die Inhibition des Apo B mRNA Editings durch native 40S hnRNP Komplexe, darauf hin, daß es sich bei der Interaktion von hnRNP C1 Protein und APOBEC-1 um eine Interaktion von funktioneller Bedeutung in vivo handelt. Apo B mRNA Editing bedarf einer strengen Regulation. Bei transgenen Tieren, die APOBEC-1 in der Leber überexprimieren scheint dieses Regulationsgleichgewicht aufgehoben zu sein. Diese Tiere entwickeln hepatozelluläre Karzinome (Yamanaka et al., 1995). hnRNP C1 Protein könnte ein das Apo B mRNA Editing limitierender Faktor sein. Die funktionelle Bedeutung für die mRNA Prozessierung, die für die hnRNP C Proteine gezeigt ist, legt nahe, daß möglicherweise bisher nicht bekannte Mechanismen während der prä-mRNA Prozessierung das Apo B mRNA Editing regulieren und limitieren (Choi et al., 1986 ; Dreyfuss et al., 1993). Basierend auf einem Vergleich der Effizienz des Editing für verschiedene Transkripte formulierten Sowden et al. die Hypothese, daß eine RNA nur eine begrenzte Gelegenheit hat, ediert zu werden (Sowden et al., 1996a). Diese "Population Gating Hypothese" besagt, daß der Anteil edierter RNAs einer "RNA-Population" bestimmt wird durch multiple in das Spleißen der prä-mRNA involvierte Faktoren. Sowden erklärte mit dieser Hypothese das Paradoxon, daß obwohl das Expressionsniveau von APOBEC-1 limitierend für das APO B mRNA Editing ist, der Anteil edierter, endogener Apo B mRNA in McArdle7777-Zellen unabhängig davon ist, ob zusätzlich noch exogene, transfizierte Apo B RNA exprimiert und ediert wurde. Es zeigte sich, daß die Anzahl und Dichte der Introns in der Apo B RNA einen negativen Einfluß auf die Effizienz des Editing hat. Für voll prozessierte RNA Substrate zeigte sich die höchste Editing-Effizienz (Sowden et al., 1996a). Die hnRNP C Proteine sind hochexprimierte prä-mRNA Bindungsproteine und haben eine wichtige Funktion für die RNA Prozessierung (Choi et al., 1986 ; Dreyfuss et al., 1993). (C1)3C2-Tetramere assoziieren mit naszierender prä-mRNA während der Transkription und bilden neben anderen hnRNP Proteinen die Core-Proteine der 40S heterogenen nukleären Ribonukleoprotein Partikel vor der Formierung der Spleißosomen (Choi et al., 1986 ; Bennett et al., 1992 ; Huang et al., 1994). In den Spleißosomen haben die hnRNP C Proteine eine entscheidende Funktion in deren katalytischer Aktivierung indem sie durch Induktion der Spaltung der Basenpaarungen der U4-U6 snRNAs (small nuclear RNA) ein Loslösen der U4 snRNA vermitteln (Forne et al., 1995). Die Fähigkeit zur Interaktion mit APOBEC-1 und die Inhibition der in vitro Editingaktivität von partiell aufgereinigtem Apo B mRNA Editing Enzym machen hnRNP C1 Protein zu einem guten Kandidaten als "gate-keeper" für das Apo B mRNA Editing im Sinne der Hypothese Sowdens. Mit Hel-N1 und AUF1 wurden zwei weitere Proteine beschrieben die AU-reiche RNAs binden und in der Lage sind, spezifisch an die Apo B RNA zu binden und Apo B mRNA Editing in vitro zu inhibieren (Anant et al., 1997). Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, das während der mRNA Prozessierung Apo B mRNA Editing durch prä-mRNA Bindungsproteine wie hnRNPC1 inhibiert wird und somit die Aktivität von APOBEC-1 auf einzelne Edierungen begrenzt wird.
hnRNP C Proteine sind im Gegensatz zu anderen hnRNP Proteinen ausschließlich im Zellkern lokalisiert. hnRNP A1 etwa ist in den mRNA Export in das Cytoplasma involviert und pendelt zwischen Nukleus und Cytoplasma (Michael et al., 1995 ; Nakielny und Dreyfuss, 1996). Im Gegensatz zu hnRNP A1, das ein Kernexportsignal (NES) beinhaltet, haben die hnRNP C Proteine ein starkes Kernlokalisationssignal (NLS) (Michael et al., 1995a/b ; Nakielny und Dreyfuss, 1996). Wie das Kernlokalisationssignal zu einer Retention der hnRNP C Proteine im Nukleus führt ist ebenso nicht bekannt wie der Mechanismus der Loslösung der hnRNP C Proteine von der mRNA vor deren Export in das Cytoplasma (Nakielny und Dreyfuss, 1996). Für APOBEC-1, das ganz überwiegen im Zellkern lokalisiert ist wurde kürzlich gezeigt, daß es ein Kernexportsignal trägt (Yang et al., 1997b). Lau et al. konnten zeigen, daß Apo B mRNA Editing im wesentlichen im Zellkern stattfindet (Lau et al., 1991). Es zeigte sich, daß hoch aufgereinigte polyadenylierte und gespleißte Apo B mRNA in dem gleichen Ausmaß (53 %) ediert ist wie die gesamte Apo B RNA (56 %) und die polysomale Apo B RNA (62 %) (Lau et al., 1991). Im Einklang mit der "Population Gating Hypothese von Sowden et al. (1996a) nehmen wir an, daß Apo B RNA Editing erst stattfinden kann, nachdem die sich die hnRNP C Proteine innerhalb der RNA Prozessierung von der RNA gelöst haben und bevor die Apo B mRNA in das Cytoplasma exportiert wird. Nur eine künstliche Überexpression von APOBEC-1 überwindet diese starke negative Regulierung des Apo B mRNA Editing und führt zu Hyperediting von Apo B RNA und anderen RNAs und damit schließlich zur Tumorentwicklung bei den transgenen Tieren (Yamanaka et al., 1995, 1996, 1997 ; Sowdwn et al., 1996b). Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Interaktion von APOBEC-1 mit hnRNP C1 Protein eine Verbindung zwischen der Regulation des Apo B mRNA Editings und RNA Prozessierung schafft. Apo B mRNA Editing steht unter starker restriktiver Kontrolle um eine größtmögliche Spezifität der zu edierenden RNA-Base zu ermöglichen. Mit hnRNP C1 Protein ist ein guter Kandidat identifiziert, der möglicherweise zur Vermittlung dieser Spezifität beiträgt. Eine weitere Charakterisierung des Apo B mRNA Editing Enzymkomplexes wird vielleicht weitere Proteine identifizieren, die nicht nur eine Funktion für das Editing erfüllen, sondern auch noch eine Rolle in der RNA Prozessierung spielen.
5. Zusammenfassung
Apolipoprotein (Apo) B kann in zwei verschiedenen Formen exprimiert werden: Apo B-100, das Hauptstrukturmolekül der LDL und das die aminoterminalen 48 % umfassende Apo B-48, ein wichtiger Bestandteil der Chylomikronen. Im menschlichen Dünndarm sowie in der Leber der Ratte und anderer Säuger kann in der Apo B mRNA an Nukleotidposition 6666 Cytidin durch Deaminierung in Uridin umgewandelt werden, wodurch aus dem für die Aminosäure Glutamin kodierenden Triplet ein translationales Stop-Codon entsteht. Diese Form der posttranskriptionellen Modifikation der Apo B mRNA – genannt Apo B mRNA Editing - wird durch einen Enzymkomplex katalysiert. Bisher konnte nur dessen katalytische Untereinheit APOBEC-1 ( Apo B mRNA editing enzyme component 1) kloniert und ausführlich charakterisiert werden. In der vorliegenden Untersuchung wurde mittels Two-Hybrid-Selektion in Hefen eine Rattenleber cDNA-Genbank nach weiteren Komponenten des Apo B mRNA Editing Enzymkomplexes durchsucht. Wir konnten so eine Interaktion von APOBEC-1 mit dem hnRNP C1 Protein nachweisen. Eine Mutagenese-Untersuchung, in der verschiedene Trunkierungen von APOBEC-1 und von hnRNP C1 in dem Hefesystem nicht miteinander interagierten, zeigte das hohe Maß an Spezifität der identifizierten Interaktion. Wir konnten zeigen, daß rekombinantes hnRNP C1 Protein die enzymatische Aktivität des partiell aus Rattendünndarm aufgereinigtem Apo B mRNA Editing Enzymkomplex inhibiert. Die hnRNP C1 Deletionsmutante M104, welche die RNA-Bindungsdomäne des Proteins umfaßt, bewirkte in gleichartigen Experimenten keine Inhibition der Editingreaktion. So konnte ausgeschlossen werden, daß der inhibierende Effekt auf die Editingreaktion auf einer unspezifischen Substratbindung durch hnRNP C1 Protein beruht. hnRNP C1 Protein ist ein hochexprimiertes Kernprotein, das naszierende RNA während der Transkription bindet und eine wichtige Rolle bei der Formierung von Spleißosomen spielt. hnRNP C1 scheint zudem eine regulative, möglicherweise Spezifität vermittelnde Funktion für das Apo B mRNA Editing zu haben.
6. Literaturverzeichnis
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7. Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Jobst Greeve für die wissenschaftliche Betreuung während meiner Doktorarbeit. Meinem Freund Heinrich Lellek danke ich für die gute und fruchtbare Zusammenarbeit. Zudem möchte ich meiner Mutter und Herrn Günter Filter für die großzügige Unterstützung danken.
8. Lebenslauf
Peer Rautenberg
Tangstedter Str. 51
25462 Rellingen
Persönliche Angaben:
Familienstand: ledig
Geburtsdatum: 11.02.1968
Geburtsort: Hamburg
Ausbildung:
Grundschule Vizelinstraße, Hamburg 1974 – 1978
Carl-von-Ossietzky Gymnasium, Hamburg 1978 – 1987
Ein Semester Studium der Anglistik, Universität Hamburg 1987 – 1988
Studium der Medizin, Universität Hamburg 1990 – 1997
Promotion:
Experimenteller Teil: Identifikation und Charakterisierung des
hnRNP C1 Proteins als Inhibitor des Apo B mRNA Editings im
Labor von Herrn Dr. J. Greeve, Medizinische Kernklinik und
Poliklinik, Universitäts-Krankenhaus Eppendorf 1995 – 1997
Klinische Tätigkeit:
Arzt im Praktikum in der Medizinischen Kernklinik und
Poliklinik des Universitäts-Krankenhauses Eppendorf 1997 – 1999
Wehr-/Ersatzdienst:
Zivildienst im Pflegeheim Westerrönfeld, Kreis Rendsburg 1988 – 1990
9. Erklärung
Ich versichere ausdrücklich, daß ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfaßt, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich gemacht habe, und daß ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung zur Promotion beworben habe.