* HF7c zeigten ein sehr langsames Wachstum auf dem SD(-His) Medium, bedingt durch eine schwache, basale Expression des HIS3 Reportergens. Es erschienen kleine Kolonien nach etwa 5 Tagen.

Die Rattenleber MATCHMAKER cDNA Genbank im Vektor pGAD10 wurde von der Firma Clontech^R erworben. Die Rattenleber cDNA wurde in die Eco RI Schnittstelle ligiert. Vor dem Screening mit Two Hybrid Selektion war es notwendig die Genbank zu titrieren. Hierzu verdünnten wir die E. Coli Suspension von 1:10 bis 1:10⁶ und inkubierten die Verdünnungen auf LB_AMP Agar. Nach Zählung der gewachsenen Kolonien ergab sich ein nach den Angaben des Herstellers ausreichender Titer von 4x10⁸ cfu/ml (cfu = colony forming units). Bei diesem Titer der cDNA Genbank war nach Angaben des Herstellers mit etwa 10⁶ unabhängigen Klonen und damit mit einer ausreichenden Repräsentanz der Genbank zu rechnen. Die Genbank wurde in LB Medium mit 25 % Glycerol aliquotiert, auf Trockeneis schockgefroren und in bei –80°C gelagert.

Zur Präparation von Genbank DNA plattierten wir die Coli Bakterien auf 15 – 20 etwa 20 x 20 cm großen LB_AMP Agarplatten so aus, daß einzelne Kolonien wachsen konnten. Die am Folgetag geernteten Bakterien wurden entsprechend dem Qiagen^R Maxi Prep Protokoll präpariert. Wir konnten so von 0,3 – 1x10⁶ Klonen 1 – 3 mg Plasmid DNA präparieren. Etwa 500 ng Plasmid DNA wurden mit Eco RI zur Analyse gespalten. Im Agarose Gel konnten wir eine homogene Verteilung der Insertgrößen zwischen 500 und 3000 bp sehen.

2.1.7.1. Herstellung kompetenter HF7c-Zellen zur Libary-pGBT9-APOBEC-1-Cotransformation (in Klammern [] die Angaben für small-scale Transformationen)

Zunächst wurden 30 150 mm Agarplatten mit SD-Medium (-LTH) sowie eine 100 mm Agarplatte mit SD-Medium (-LT) vorbereitet. Eine Kolonie der HF7c-Zellen wurde in 50 ml [0,5 ml] YPD Medium resuspendiert und über Nacht bei 30°C mit ~230 upm geschüttelt bis die Zellen zu einer optischen Dichte (OD₆₀₀ ) von 1,5 – 2,0 herangewachsen waren. Je 500 ml [150 ml] YPD Medium wurden in zwei 2l [500 ml]-Erlenmeyerkolben gegeben und dann so viel von der Übernachtkultur hinzugefügt, bis eine OD₆₀₀ von 0,2 – 0,3 erreicht war. Die Zellen wurden dann für weitere 4 h bei 30°C und ~230 upm inkubiert. Die Kultur wurde dann 5 min bei Raumtemperatur und 1000 g pelletiert. Nach Abgießen des Überstandes wurden die Zellen in 500 ml [50 ml] 1 x TE Puffer resuspendiert und erneut für 5 min bei 1000 g zentrifugiert.

Der Überstand wurde dekantiert und die Zellen in 8 ml [1,5 ml] 1 x LiAc/TE Lösung aufgenommen. Die Zellen waren nun kompetent und für etwa 2 – 3 h bei Raumtemperatur zu verwenden.

2.1.7.2. pGBT9-APOBEC-1-Library-Cotransformation (in Klammern [] smale-scale)

Der DNA-Mix wurde wie folgt hergestellt: 20 mg [0,1 mg] [denaturierter Hering-Hoden DNA wurden mit je 500 µg Library Plasmid DNA und pGBT9-APOBEC-1 Plasmid DNA vermischt [100 ng je Plasmid]. 8 ml [0,1 ml] kompetente Zellen wurden zur DNA Mixtur hinzugegeben und gemischt. 60 ml [0,6 ml] PEG/LiAc Lösung wurden hinzugefügt und erneut gemischt. Die Zellsuspension wurde bei 30°C und ~230 upm für 30 min inkubiert.

Es wurden dann 7,6 ml [70 µl] DMSO zu einer Endkonzentration von 10 % hinzugefügt. Die Suspension wurde im Wasserbad für 15 min auf 42°C erhitzt und dabei gelegentlich gemixt. Die Zellen wurden für 5 min auf Eis gestellt und dann bei 1000 g für 5 min zentrifugiert [5 sec 13000 upm]. Das Zellpellet wurde in 50 ml [0,5 ml] 1 x TE Puffer aufgenommen und wie zuvor zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und die Zellen zum Ausstreichen in 10 ml [0,5 ml] 1 x TE Puffer resuspendiert.

Zur Kontrolle der Transformationseffizienz wurden 10 µl der Suspension auf einer 100 mm SD(-LT)-Agarplatte ausgestrichen. Je ~300 µl der Zellsuspension wurden auf insgesamt 30 150 mm SD(-LTH)-Agarplatten ausgestrichen [100 µl/100 mm Platte]. Die Platten wurden bei 30°C inkubiert.

Nach 2 – 3 Tagen erschienen die ersten Kolonien auf den SD(-LTH)-Platten, die auf einer frischen SD(-LTH)-Platte (Masterplate) und auf einem Master-Nitrocellulose-Filter, das einer entsprechenden Mangelagarplatte aufgelegt wurde, erneut angeimpft wurden. Auch Kolonien, die bis etwa nach sechs Tagen erschienen und eventuell einer schwächeren Interaktion entsprachen, wurden auf die Masterplate und das Nitrocellulose –Filter übertragen. Alle Kolonien wurden numeriert.

Nach weiteren zwei Tagen wurden die HIS⁺-Kolonien mittels des b -Galaktosidase Assays auf Aktivierung Reportergens lacZ getestet. Wenn eine Interaktion zwischen einem Library-Protein und APOBEC-1 vorlag, sollte auch das zweite GAL4 abhängige Reportergen der HF7c-Zellen aktiviert werden. Dieser Assay wurde wie folgt durchgeführt. Zunächst wurde die Z Puffer/X gal Lösung wie beschrieben hergestellt.

Whatman #5 Papier wurde in einer Petrischale mit der Z Puffer/X gal Lösung bis zu Sättigung befeuchtet (~3,5 ml pro 150 mm Platte).

Der Master-Nitrocellulose-Filter wurde vorsichtig von der Mangelagarplatte abgehoben. Zum Teil wurden die Kolonien auch von der Agarplatte mit einem Blatt Nitrocellulose abgehoben, indem die Nitrocellulose kurz auf die Kolonien gedrückt wurde. Der Nitrocellulose-Filter wurde dann mit den Kolonien nach oben für 10 sec in flüssigen Stickstoff gegeben. Der Filter wurde bei Raumtemperatur wieder aufgetaut und dann mit den Kolonien nach oben auf das vorbereitete Whatman #5 Papier gelegt.

Es folgte eine Inkubation bei 30°C für maximal 8 h. Positive Kolonien färbten sich blau. Eine Positivkontrolle zur technischen Überprüfung des Assays wurde mitgetestet. Hierzu wurde eine mit dem Plasmid pCL1, das für das Wildtyp GAL4 Protein codiert, transformierte Hefekolonie genutzt. Die Positivkontrolle färbte sich innerhalb von ~15 min blau.

2	%	Triton X-100
1	%	SDS
100	mM	NaCl
10	mM	Tris HCl, ph 8,0
1	mM	EDTA

Die nach folgendem Protokoll präparierte Plasmid DNA konnte zur Transformation von E. coli mittels Elektroporation genutzt werden. Sie war jedoch ungeeignet für Restriktionsanalysen oder herkömmliche Transformation von E. coli.

2 ml YPD Medium wurden mit einer b -Galktosidase⁺-Kolonie direkt von der Masterplatte angeimpft und über Nacht bei 30°C und ~230 upm inkubiert. 1,5 ml der Übernachtkultur wurden in einer Tischzentrifuge pelletiert, der Überstand dekantiert und das Pellet in der verbleibenden Flüssigkeit resuspendiert. Zunächst wurden 200 µl der Lyselösung, dann 200 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und 0,3 g der säuregewaschenen glass beads (425-600 µm, Sigma) hinzugefügt. Das Gemisch wurde auf dem Vortexer für 2 min gründlich gemixt und dabei die Hefezellen mechanisch rupturiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 14000 upm für 5 min. Der Überstand wurde in ein frisches Tube transferiert und Ethanol präzipitiert (1/10 Volumen 3 M NaOAc pH 5,3 und 2,5 Volumen 100 % Ethanol). Nach der üblichen Zentrifugation wurde das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 µl 1 x TE Puffer gelöst.

1µl der DNA Präparation aus den b -Galaktosidase⁺ Kolonien wurde mit 40 µl elektrokompetenten Zellen (DH5a ) vermischt und in eine spezielle Küvette zur Elektroporation gegeben. Unter folgenden Einstellungen wurde Elektroporation durchgeführt: Spannung 1,8 kV, Kapazität 25 µFD, Widerstand 200 W . Es wurden 1 ml LB-Medium ohne Antibiotikum zugegeben und die Bakterien in einem sterilen Gefäß für 45 min bei 37°C inkubiert. Die Bakterien wurden pelletiert und auf vorgewärmten LB_AMP-Platten ausgestrichen.

2.1.7.7. Analyse der Plasmid DNA der b -Galaktosidase⁺-Klone

Von jeweils mehreren nach der Elektroporation gewachsenen Kolonien wurde eine DNA-Minipräparation angefertigt und mittels Restriktionsverdau (Eco RI) analysiert. Durch Eco RI Spaltung konnte das entsprechende Insert aus dem Library Plasmid geschnitten werden. Der Library Vektor pGAD10 erschien als 6,65 kb Bande im Agarose Gel. Das pGBT9-APOBEC-1 Konstrukt wurde durch Eco RI Spaltung linearisiert und erschien im Agarose Gel als 6,3 kb Bande. Außerdem konnte durch PCR mit den Oligonukleotiden 5`AD und 3`AD das entsprechende Insert amplifiziert werden. 5`AD und 3`AD annealen stromaufwärts bzw. stromabwärts der pGAD10 Library Cloning site.

Die so identifizierten und isolierten b -Galktosidase⁺ Klone wurden nun in einem small-scale Ansatz mit pGBT9-APOBEC-1 in beide Hefestämme HF7c und SFY526 cotransformiert und erneut auf Interaktion getestet: Wachstum auf dem Mangelagar und Testung auf b -Galaktosidaseaktivität.

Die Klone, deren Interaktion mit APOBEC-1 ein zweites Mal mit Two Hybrid Selektion bestätigt werden konnte, wurden mit den Oligonukleotiden 5`AD und 3`AD nach dem Protokoll des "ABI PRISM^TM Dye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction Kit" sequenziert. Von diesen Klonen wurden DNA Maxipräparationen nach dem Protokoll und mit den Ionenaustauschsäulen der Firma Qiagen angefertigt.

Um die Spezifität der Interaktion von APOBEC-1 und hnRNP C₁ genauer zu untersuchen, klonierten wir Trunkierungen des APOBEC-1 und des hnRNP C₁ Proteins und testeten diese im Two Hybrid System auf Interaktion. Zudem war es notwendig, die volle Länge der hnRNP C₁ cDNA in das Plasmid pGAD 424 zu klonieren und auf Interaktion mit APOBEC-1 zu testen. Es wurden folgende Proteintrunkierungen kloniert:

1. APOBEC_{(1 – 112)}, das die Aminosäuren 1 – 112 als Fusionsprotein mit der DNA Bindungsdomäne im Plasmid pGBT9 umfaßt. Das cDNA Fragment wurde durch PCR mit den Oligonukleotiden APOBEC XXIV und APOBEC XXIV von dem Plasmid pSVL-APOBEC-1 amplifiziert.
2. APOBEC_{(1 – 180)}, das die Aminosäuren 1 – 180 als Fusionsprotein mit der DNA Bindungsdomäne im Plasmid pGBT9 umfaßt. Das cDNA Fragment wurde durch PCR mit den Oligonukleotiden APOBEC XXIV und APOBEC XXI von dem Plasmid pSVL-APOBEC-1 amplifiziert.
3. APOBEC_{(73 – 229)}, das die Aminosäuren 73 - 229 als Fusionsprotein mit der DNA Bindungsdomäne im Plasmid pGBT9 umfaßt. Das cDNA Fragment wurde durch PCR mit den Oligonukleotiden APOBEC XXIII und APOBEC VI von dem Plasmid pSVL-APOBEC-1 amplifiziert.

Die PCR-Produkte aller drei APOBEC Trunkierungen wurden über ein Agarosegel gereinigt und mit PstI geschnitten. Sie wurden dann in den zuvor mit PstI geschnittenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten Vektor pGBT9 ligiert. Es wurden Minipräparationen von Plasmid DNA jeweils mehrerer Klone angefertigt und durch Restriktionsanalyse mit PstI und Sequenzierung mit dem Oligonukleotid 5`BD auf die richtige Orientierung und den korrekten Leserahmen untersucht.

4. hnRNP C_{(1 – 93)}, das die Aminosäuren 1 – 93 als Fusionsprotein mit der Aktivierungsdomäne im Plasmid pGAD424 enthält. Die cDNA wurde durch PCR mit den Oligonukleotiden 5`AD und 63-BamH von dem Plasmid pGAD10-63 amplifiziert. Das PCR Produkt wurde über ein Agarose gereinigt und mit BamHI geschnitten. Es wurde dann in den mit BamHI geschnittenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten Vektor PGAD424 ligiert. Es wurden ebenfalls DNA Minipräparationen mehrerer Klone angefertigt und durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung mit dem Oligonukleotid 5`AD auf die richtige Orientierung und den richtigen Leserahmen untersucht.

Die volle Länge der hnRNP C₁ cDNA wurde mittels PCR mit den Oligonukleotiden C_s und C_a von dem Plasmid pHC12 (Swanson et al., 1987) amplifiziert. Das PCR Produkt wurde über ein Agarosegel gereinigt und mit BamHI geschnitten. Die Klonierung und Überprüfung auf richtige Orientierung und den korrekten Leserahmen erfolgte entsprechend der Klonierung von hnRNP C_{(1 – 93)}.

Die Plasmide wurden nach dem small-scale Protokoll in beide Hefenstämme SFY526 und HF7c cotransformiert.

50 mM	HEPES-KOH, pH 7,5
500 mM	NaCl
10 mM	NaS2O5
1 mM	Dithiothreitol
1 mM	NaEDTA
1µg/ml	Leupeptin
1 µg/ml	Pepstatin
0,5 %	Aprotinin
10 % (v/v)	Glycerol

10 mM	HEPES-KOH, pH 7,5
0,2 mM	NaEDTA
10 % (v/v)	Glycerol

50 mM	Na2HPO4, Na(H2PO4)2, pH 7,5
500 mM	NaCl
0,5 mM	Dithiothreitol
0,2 mM	NaEDTA
10 % (v/v)	Glycerol

Prä-Elutionspuffer: ssDNA Puffer + 1mg/ml Heparin

50 mM	Na2HPO4, Na(H2PO4)2, pH 7,5
2 M	NaCl
0,5 mM	Dithiothreitol
0,2 mM	NaEDTA
10 % (v/v)	Glycerol

10 mM	HEPES-KOH, pH 7,5
0,2 mM	NaEDTA
150 mM	NaCl
10 % (v/v)	Glycerol

20 mM	HEPES, pH 7,5
50 mM	KCl
0,5 mM	EDTA
10 %	Glycerol

2.2.2. Expression und Aufreinigung von hnRNP C₁ Protein

Das Plasmid pExC₁ wurde uns freundlicherweise von Dr. M. Göhrlach, Institut für Molekulare Biotechnologie e.V., Jena, zur Verfügung gestellt. pExC₁ codiert für die volle Länge des hnRNP C₁ Proteins in dem hitzeinduzierberem Expressionssystem mit dem Vektor pRC23 (Crowl et al., 1985).

Das Plasmid pExC₁ wurde in den E. Coli Stamm RR₁ transformiert. 50 ml LB_(AMP) Medium wurden mit einer Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei Raumtemperatur und ~200 upm inkubiert. Die OD₆₀₀ der Übernachtkultur sollte einen Wert von 0,6 nicht überschreiten. Die Bakterien wurden für 10 min bei 1000 g pelletiert und in 500 ml LB_(AMP) Medium resuspendiert. Es folgte eine Inkubation bei 30°C und ~200 upm für weitere 4 – 6 h bis eine OD₆₀₀ von 0,5 erreicht war. Die Bakterien wurden nun einem Hitzeschock unterzogen indem die Kultur durch Zugabe von ~250 ml frischem, auf 60°C vorgewärmten LB Medium auf 42°C erhitzt wurde, wodurch die Überexpression von hnRNP C₁ gestartet wurde. Entsprechend der zugesetzten Menge LB Mediums wurde Ampicillin zu einer Endkonzentration von 50 µg/ml hinzugefügt. Die Kultur wurde für weitere 4 h bei 42°C und ~200 upm inkubiert. Die Bakterien wurden nun durch Zentrifugation für 10 min bei 1000 g bei 4°C pelletiert. Alle weiteren Schritte wurden bei 4°C oder auf Eis durchgeführt. Das Pellet wurde in 50 ml eiskaltem Extraktionspuffer aufgenommen. Um das intrazellulär lokalisierte hnRNP C₁ Protein freizusetzen wurde die Bakteriensuspension soniziert. Es wurden hierzu je 5 ml eiskalter Suspension mit je 20 Schallzyklen von 1 sec Länge und einer Leistung von 60 W behandelt. Es folgte eine Zentrifugation für 1 h bei 100000 g in einem Beckmann^R SW 40 Rotor. Der Überstand wurde nun mit einem Fluß von 1 ml/min auf eine Parmacia XK 16 DEAE-Cellulosesäule (c. 25 ml) geladen, die zuvor mit dem Extraktionspuffer äquilibriert wurde. Der "flow through" wurde direkt auf eine 10 ml große, ebenfalls mit dem Extraktionspuffer äquilibrierten ssDNA-Cellulosesäule geladen. Die ssDNA- Säule wurde gründlich mit ssDNA Puffer gewaschen, bis die OD₂₈₀ des "flow through" auf die Extinktionswerte für den Puffer gesunken waren. Es folgte nun ein Prä-Elutionsschritt, indem ein Säulenvolumen des Prä-Elutionspuffers, der 1 mg/ml Heparin enthält, mit einem Fluß von 1 ml/min über die Säule gegeben wurde. Die Elution des rekombinanten hnRNP C₁ erfolgte mit dem 2 M Salz enthaltenden Elutionspuffer. Die Elution wurde fraktioniert gesammelt und die Fraktionen mit der größten OD₂₈₀ wurden gepoolt. Die Reinheit des rekombinanten Proteins wurde durch SDS-PAGE auf einem 15 % Polyacrylamidgel und anschließender Coomassie-Färbung abgeschätzt und betrug etwa 95 %. Die Proteinlösung wurde gegen D-Puffer dialysiert und über eine mit diesem Puffer äquilibrierte Superose 12 Säule (Pharmacia) zur Homogenität gereinigt. Das aufgereinigte Protein wurde erneut mittels SDS-PAGE analysiert. Dabei wurde wie folgt vorgegangen.

Zur Auftrennung von Proteinen wurde die denaturierende Gelelektrophorese in Polyacrylamidgelen durchgeführt (Laemmli et al., 1970 ; Studier et al., 1973). Es wurden 10 %, 15 % und 17,5 % Polyacrylamidgele mit 5 % Obergelen in einer Größe von 10 x 10 cm mit dem Gelsystem von Hoefer^R wie folgt hergestellt:

10% (15%) (17,5%)Gel:

10 %	15 %	17,5 %
10 ml	15 ml	17,5 ml	Acrylamid-bis (30 % [w/v] Acrylamid 0,8 % [w/v] Bis-Acrylamid)
7,5 ml	7,5 ml	7,5 ml	1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
11,8 ml	6,8 ml	4,5 ml	ddH2O
0,6 ml	0,6 ml	0,6 ml	10 % (w/v) SDS
0,2 ml	0,2 ml	0,2 ml	10 % (w/v) Ammoniumpersulfat
10 µl	10 µl	10 µl	TEMED (Biorad)

Die Komponenten wurden zusammengegeben, gemixt und das Gel konnte in die vorbereitete Glasplattenapparatur gegossen werden. Nach der Polymerisation wurde das Obergel angefertigt.

5 % Obergel:

3,32 ml	Acrylamid-bis (30 % [w/v] Acrylamid 0,8 % [w/v] Bis-Acrylamid)
5 ml	05, M Tris-Hcl, pH 6,8
11,4 ml	ddH2O
0,2 ml	10 % (w/v) SDS
0,3 ml	10 % (w/v) Ammoniumpersulfat
10 µl	TEMED (Biorad)

Die Lösung für das 5 % Obergel wurde auf das bereits 10 % oder 15 % Gel gegeben, der die Taschen formende Kamm wurde eingefügt. Nach ca. 20 min konnte das Gel benutzt werden.

[5x] Ladepuffer

0,1 M	Tris-HCl, pH 6,8
2 % (w/v)	SDS
20 % (v/v)	Glycerol
0,01 % (w/v)	Bromophenol Blau
1 % (v/v)	b -Mercaptoethanol

Die Proben wurden nun in [1x] Ladepuffer in einem maximalen Volumen von 100 µl für 5 min auf 95°C erhitzt und konnten dann auf das Gel geladen werden.

[10x] Laufpuffer

200 mM	Tris-Glycin, pH 8,8
0,8 %	SDS

Die Gelelektrophorese wurde in [1x] Laufpuffer mit einer Stromstärke von 40 mA durchgeführt.

Die Gele wurden dann in 25 % Methanol und 10 % Eisessig für 45 min bei Raumtemperatur zur Fixation inkubiert. Es folgte eine Färbung für 30 min mit Coomassie Blau. Die Gele wurden dann in 10 % Methanol und 10 % Eisessig über 6 – 8

h entfärbt, bis die Proteinbanden gut sichtbar waren.

Das Plasmid M104pET11A, das für die Aminosäuren 1 – 104 des hnRNP C₁ codiert, wurde uns ebenfalls freundlicherweise von Dr. M. Görlach zur Verfügung gestellt.

Zunächst wurden von dem E. coli Stamm BL21 frische kompetente Zellen mit der Calciumchlorid-Methode hergestellt. Das Plasmid wurde transformiert und am folgenden Tag eine 50 ml Übernachtkultur mit einer einzelnen Kolonie angeimpft, die bei 37°C inkubiert wurde. Die Zellen der Übernachtkultur wurden in 500 ml frischem LB_AMP Medium resuspendiert und bei 37°C und ~220 upm inkubiert, bis eine OD₆₀₀ von 0,5 erreicht war. Die Expression des rekombinaten Protein wurde dann durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,1 mM induziert und die Inkubation für weitere 4 h fortgesetzt. Die Kultur wurde für 10 min auf Eis gekühlt und bei 4°C für 10 min zentrifugiert. Die pelletierten Bakterien wurden dann in 50 ml eiskaltem Extraktionpuffer aufgenommen und in der gleichen Weise soniziert, wie zuvor für das rekombinante hnRNP C₁ beschrieben. Es wurde dann die Natriumchlorid-Konzentration durch Zugabe von 116 ml des salzfreien H0-Puffers auf 150 mM gesenkt. Die Suspension wurde nun für 1 h bei 100000g zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine mit H150-Puffer äquilibrierte Pharmacia XK 16 DEAE-Cellulosesäule gegeben. Der "flow-through" wurde direkt auf eine 10 ml ssDNA-Cellulosesäule gegeben, die dann gründlich mit einem nur 150 mM NaCl enthaltenden ssDNA-Puffer gewaschen wurde, bis die OD₂₈₀ des "flow-through" auf Extinktionswerte für den Puffer gesunken war. Eluiert wurde mit dem 500 mM NaCl enthaltenden ssDNA-Puffer. Die Elution wurde entsprechend der hnRNP C₁-Aufreinigung fraktioniert und mit SDS-PAGE analysiert. Die Proteinlösung wurde ebenfalls gegen D-Puffer dialysiert.

Das Plasmid pGEX2T-APOBEC-1 wurde uns freundlicherweise von Dr. N. Navaratnam, Imperial School of Medicine, London, U.K., zur Verfügung gestellt.

In diesem Vektor ist die volle Länge der APOBEC-1 cDNA in den Vektor pGEX2T (Pharmacia^R) kloniert, so daß für ein Fusionsprotein aus Gluthationtransferase und APOBEC-1 codiert wird. Die Aufreinigung des Fusionsproteins erfolgt durch Affinitätschromatographie mit Gluthationspharose-Säulen. Eluiert wird das rekombinante Protein durch eine Gluthationlösung.

Eine Übernachtkultur von 50 ml LB_AMP wurde mit einer einzelnen Kolonie von frisch transformierten DH5a angeimpft und bei 37°C und ~220 upm inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 1000 g pelletiert und in 500 ml frischem LB_AMP Medium resuspendiert. Es folgte nun eine Inkubation bei 37°C und ~220 upm für etwa 2 h, bis eine OD₆₀₀ von 0,75 erreicht war. Zur Induktion der Expression von GST-APOBEC-1 wurde nun IPTG zu einer Enkonzentration vom 0,1 mmol/l hinzugefügt. Die Bakterien wurden nun für weitere 4 h wie vorher inkubiert. Die Zellen wurden wie oben beschrieben pelletiert und in 50 ml eiskaltem PBS aufgenommen. Zur Freisetzung des intrazellulär lokalisierten Proteins wurden die Bakterien soniziert. Es wurden hierzu je 5 ml eiskalter Suspension mit je 20 Schallzyklen von 1 sec Länge und einer Leistung von 60 W behandelt. Es wurden dann 5 ml einer 10% Triton X-100 in PBS Lösung hinzugefügt und die Suspension wurde für 30 min leicht schüttelnd bei 4°C inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation bei 30000 g für 15 min. Der Überstand wurde auf eine Gluthation-Sepharose Redi Pack^R Column (Pharmacia) geladen. Es wurde also eine Affinitätschromatographie mit dem an Sepharose gebundenen Substrat des GST-Anteils des Fusionsproteins durchgeführt. Die Säule wurde mit 40 ml eiskalter PBS Lösung gewaschen. Die Elution erfolgte mit 6 ml einer Lösung von 1 mM reduziertem Gluthation in PBS. Die Proteinlösung wurde gegen D-Puffer dialysiert. Es erfolgte eine Analyse des rekombinanten Proteins mittels SDS-PAGE.

Das Plasmid pGEX2T-APOBEC-1 wurde mit BamHI geschnitten, wodurch die APOBEC-1 cDNA aus dem Vektor herausgeschnitten wurde. Die pGEX2T Vektorbande wurde über ein Agarosegel gereinigt und religiert. Nach Transformation des Ligationsproduktes in E. coli (DH5a ), Plasmid DNA Präparation und Restriktionsanalyse zeigte sich das Plasmid pGEX2T (Pharmacia). Die Expression und Aufreinigung des GST-Proteins erfolgte exakt so, wie für GST-APOBEC-1 beschrieben.

400	mM	Tris-HCl, pH 8,0
60	mM	MgCl2
40	mM	Spermidine
50	mM	NaCl
100	mM	DTT
1	mg/ml	Rinderserum-Albumin

5	mM	ATP
5	mM	GTP
5	mM	CTP
5	mM	UTP

96	mM	NaCl
1,5	mM	KCl
27	mM	Natriumzitrat
8	mM	KH2PO4
5,6	mM	Na2HPO4
		pH 7,3

137	mM	NaCl
2,7	mM	KCl
8,1	mM	Na2HPO4
1,5	mM	KH2PO4
1,5	mM	EDTA
0,25	mM	DTT

10	mM	HEPES
10	mM	KCl
1,5	mM	MgCl2
0,25	mM	DTT
		pH 7,9

20	mM	HEPES
100	mM	KCl
0,5	mM	EDTA
20	% (v/v)	Glycerol
		pH 7,5

100	mM	Tris-HCl pH 8,0
1	% (w/v)	SDS
400	mM	NaCl
0,3	mg/ml	Proteinase K
0,6	mg/ml	tRNA

50	mM	Tris-HCl pH 8,2
6	mM	MgCl2
10	mM	DTT
1	mM	dATP
1	mM	dCTP
1	mM	dTTP
1	mM	ddGTP

75	% (v/v)	deionisiertes Formamid
0,1	% (w/v)	Bromophenol Blau
0,1	% (w/v)	Xelen Cyanol

Für die Arbeiten mit RNA wurden ausschließlich Rnase-freie Reagenzien verwendet.

2 µg der zuvor mit HindIII geschnittenen pBS55 DNA (Greeve et al., 1991) wurden in einem Gesamtansatz von 20 µl mit [1x] 4-NTP-Mix, [1x] RNA-Polymerase Puffer, 1,5 µl RNA guardâ (Pharmacia) und 20 U T₃-RNA-Polymerase für 1 h bei 37°C inkubiert. Es wurden dann 10 U RNase-freie DNase I hinzugefügt und die Inkubation für 15 min fortgesetzt. Das Volumen wurde dann auf 100 µl aufgefüllt und es folgten zwei Phenol/Chloroform Extraktionen sowie eine Chloroform Extraktion. Um die Nukleotide aus der RNA-Lösung zu entfernen, wurde eine spin-column Chromatographie mit Sephadex G50 Säulen (Pharmacia) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Es folgte dann eine Ethanol Präzipitation für 1 h auf Trockeneis. Nach 15 min Zentrifugation bei 13000 upm in einer Tischzentrifuge wurde das Pellet in 10 µl ddH₂O aufgenommen. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte mittels der OD₂₆₀. Es folgte zur Kontrolle des DNase-Verdaus und bedingt als bedingte Kontrolle der RNA Synthese eine Auftrennung von 1 µl auf einem 0,8 % Agarosegel.

Nach Äthernarkose wurden 8 – 10 männliche CD-Ratten durch cervicale Dislokation getötet. Der Dünndarm inkl. Duodenum wurde entnommen und gründlich mit isotoner Kochsalzlösung gewaschen. Der Dünndarm wurde mit Puffer A gefüllt und 15 min bei 37°C in isotoner Kochsalzlösung inkubiert. Puffer A wurde durch Puffer B ersetzt und der Dünndarm für weitere 10 min wie zuvor inkubiert. Durch vorsichtige Manipulation wurden die Mucosazellen von der Darmwand gelöst und waren dann im Lumen des Darmes sichtbar. Der die Mucosazellen enthaltende Puffer B wurde auf Eis gesammelt. Alle weiteren Arbeitsschritte wurden bei 0 – 4°C ausgeführt.

Die Zellen wurden in einem "swinging bucket" Rotor bei ca. 100 g für 5 min pelletiert und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde in 4 Volumen des Puffers C resuspendiert und für 10 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden durch 25 Hübe in einem Dounce Homogenisator lysiert. Die Ruptur der Zellen wurde durch Lichtmikroskopie kontrolliert. Die Zellkerne und übrigen Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation für 10 min bei 2500 g in einem "swinging bucket" Roter entfernt. Der trübe Überstand wurde mit 1 M KCl Lösung auf 50 mM Kcl eingestellt und für 1 h bei 100000 g und 4 °C in einem Beckmann 70 Ti Rotor zentrifugiert. Der klare Überstand wurde für 4 – 6 h bei 4°C gegen Puffer D dialysiert und in kleinen Aliquots (50 µl – 100 µl) bei –20°C gelagert. Die Extrakte waren so für einige Monate stabil, wiederholtes auftauen und einfrieren wurde vermieden. Die Proteinkonzentration betrug nach dem Bradford Assay (Biorad) etwa 10 – 20 mg/ml.

Das Editing Enzym wurde aus dem cytosolischen Rattenenterozytenextrakt durch Chromatographie mit einer DEAE-Sepharose-Säule (Pharmacia) wie folgt partiell aufgereinigt:

100 ml des Enterozytenextrakt mit einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml wurden in einem Puffer aus 20 mM HEPES, pH 7,3, 50 mM KCl und 1 mM EDTA auf eine 8 cm x 2,5 cm große, mit diesem Puffer äquilibrierte DEAE-Sepharose-Säule mit einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min geladen.

Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis die OD₂₈₀ auf die Extinktionswerte für den Puffer zürückgekehrt war. Die gebundenen Proteine wurden mit einem Puffer aus 20 mM HEPES, pH 7,3, 300 mM KCl und 1 mM EDTA eluiert, wobei die Elution in Fraktionen von 5 ml gesammelt wurde. Die proteinreichen Fraktionen wurden gepoolt und gegen einen Puffer aus 20 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 1 mM EDTA und 20 % (v/v) Glycerol dialysiert.

Das über die DEAE-Säule partiell aufgereinigte Editing Enzym wurde in kleinen Aliquots (50µl – 100 µl) bei –20°C gelagert und auf in vitro Editing Aktivität getestet.

Zunächst wurde eine High Trap^R Heparin-Säule (Pharmacia) mit einem Puffer aus 20 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 20 % (v/v) Glycerol, pH 7,3 äquilibriert. Die im in vitro Editingassay aktiven Fraktionen nach der Aufreinigung über die DEAE-Sepharose wurden in diesem Puffer mit einer Flußrate von 0,5 ml/min auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit demselben Puffer gewaschen bis die OD₂₈₀ auf die Extinktionwerte für den Puffer gesunken waren. Eluiert wurde in einem Schritt, indem die KCl Konzentration auf 300 mM erhöht wurde. Die proteinreichen Fraktionen wurden gepoolt und gegen einen Puffer aus 20 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 1 mM EDTA und 20 % (v/v) Glycerol dialysiert. Es wurde dann die Aktivität im Editingassay geprüft. Das über die Heparin-Säule partiell aufgereingte Editing Enzym wurde in kleinen Aliquots bei –20°C gelagert. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren wurde vermieden.

10 – 20 µg des S100 Rattendünndarm Extraktes bzw. entsprechende Mengen des partiell aufgereinigten Apo B mRNA Editing Enzymkomplexes mit oder ohne zusätzlich hinzugefügte rekombinante Proteine wurden in einem Gesamtansatz von 20 µl mit 1 nM RNA Substrat, 10 mM HEPES, pH 8,0, 50 mM KCl, 50 mM EDTA und 10 % Glycerol mit 10 U RNase Inhibitor für 2 h bei 30°C inkubiert.

Dann wurden in den Reaktionsansatz 40 µl Stop Puffer und 40 µl ddH₂O gegeben. Die Lösung wurde von Proteinen durch zwei aufeinanderfolgende Phenol/Chloroform-Extraktionen und eine Chloroform-Extraktion gereinigt. Die RNA wurde durch Zugabe von 10 µl 3 M Natriumazetat, pH 7,0 und 300 µl Ethanol für 30 min auf Trockeneis gefällt. Durch 15 min Zentrifugation bei 13000 upm in einer Tischzentrifuge wurde die RNA pelletiert. Nach Entfernen des Überstandes wurde das Pellet luftgetrocknet.

Markieren des Oligonukleotids DD₃ mit g -[ ³²P] ATP: 20 ng Oligonukleotid DD₃ (komplementär zur Apo B RNA Sequenz [antisense] von Position 6708 bis Position 6674) wurden mit 10 U Polynukleotidkinase und 50 µCi g -[ ³²P] ATP in 10 µl 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 6 mM MgCl₂ für 1 h bei 37°C inkubiert.

Das kinasierte Oligonukleotid wurde durch spin-column Chromatographie mit einer Sephadex G50 Säule (Pharmacia^R) den Angaben des Herstellers folgend aufgereinigt. Die spezifische Aktivität betrug in etwa 10⁶ dpm/ng DNA.

Das RNA Pellet der in vitro Editing Reaktion wurde in 8 µl 1 x Primer extension Puffer mit etwa 10⁵ dpm kinasiertem Oligonukleotid aufgenommen. Die Lösung wurde für 10 min bei 65°C zum Denaturieren der RNA inkubiert. Es folgte eine Inkubation für 5 min bei 42°C zum Annealing. Es wurden 0,5 U T4 Reverse Transkriptase in 2 µl ddH₂O hinzugegeben und der Ansatz für 60 min bei 42°C inkubiert.

Der Reaktionsansatz wurde in einem Vakuumtrockner eingetrocknet und in 8 µl Sequencing dye aufgenommen und auf ein 8 % Polyacrylamid, 7 M Harnstoff, [1x] TBE, Sequenzgel geladen. Die Elektrophorese wurde bei 1500 V durchgeführt und das Gel im Anschluß bei 80°C unter Vakuum getrocknet. Die Autoradiographie des Gels erfolgte für ca. 8 h bei –80°C.

Für die Klonierungen, Sequenzierungen und Primer-Extension Analysen wurden folgende Oligonukleotide verwendet, die im Institut für Zellbiochemie und Neurobiologie des Universitäts-Krankenhauses Eppendorf synthetisiert wurden. Alle Oligonukleotide in 5`-3` Richtung:

1. Etablierung des Two-Hybrid Systems

1. Positivkontrollen

Zunächst wurde getestet, ob das Two-Hybrid System, wie es von der Firma Clontech^R geliefert wurde, funktionsfähig war. Es mußte in der Lage sein, positive Ergebnisse zu produzieren. Hierzu wurden folgende Plasmide, von denen eine Aktivierung des GAL4-Promotors bekannt ist, in die Hefestämme HF7c und SFY526 transformiert. Es wurde dann über die Testung auf b -Galaktosidaseaktivität die Aktivierung des GAL4-Promotors verifiziert.

Plasmide:

pCL1:	Wildtyp des GAL4 Transkriptionsaktivators, LEU2, Amp
pVA3:	p53 (72 – 390) der Maus in pGBT9, TRP1, Amp
pTD1:	SV40 large T-Antigen (84 – 708) in pGAD3F, LEU 2, Amp
pLAM5`:	Lamin C (66 – 230) des Menschen in pGBT9, TRP1, Amp

Folgende Transformationen mit folgendem Ergebnis für b -Galaktosidaseaktivität wurden durchgeführt:

Plasmid 1	Plasmid 2	Selektionsmedium	b -Galaktosidase-Aktivität
			HF7c	SFY526
pCL1		-L	+	+
pVA3	pTD1	-LT	+	+
pLAM5`	pCL1	-LT	+	+

Es konnte also mit unserem Two-Hybrid-System B-Galaktosidaseaktivität für bekannte Aktivatoren des GAL4-Promotors nachgewiesen werden.

2. Negativkontrollen

Zudem mußte sichergestellt werden, daß die Transformation des Konstruktes pGBT9-APOBEC-1 allein nicht zu einer GAL4-Promotoraktivierung führt. Gleiches gilt für die alleinige oder die Cotransformation der Plasmide pGBT9 und pGAD424. Es wurden folgend Transformationen mit folgendem Ergebnis für die b -Galaktosidaseaktivität durchgeführt:

Damit konnte hinreichend eine unerwünschte GAL4-Promotoraktivierung durch die eingesetzten Plasmide ausgeschlossen werden

Die cDNA von APOBEC-1 wurde in voller Länge in den Vektor pGBT9 kloniert, um als Zielprotein eine Rattenleber cDNA Library (MATCHMAKER rat liver library in pGAD10, Clontech^R), die eine Komplexität von 10⁶ unabhängigen Klonen unfasst, nach potentiellen Interaktionspartnern zu durchsuchen. Das Screening wurde im Hefestamm HF7c durch Cotransformation gleicher Mengen der pGAD10 Library Plasmide und pGBT9-APOBEC-1 durchgeführt. Insgesamt wurden 16 Librarytransformationen durchgeführt. Dabei wurden insgesamt 5950 µg Rattenleber-library DNA aus 6 unterschiedlichen Präparationen mit insgesamt 5,5 x 10⁶ unabhängigen Klonen und die entsprechende Menge pGBT9-APOBEC-1 DNA eingesetzt. Die Transformationseffizienz variierte von 2 x 10³ – 7 x 10³ cfu/µg DNA. Durchschnittlich wurde eine Transformationseffizienz von etwa 5 x 10³/µg DNA erreicht. Insgesamt wurden etwa 3 x 10⁷ Hefen mit Plasmiden für die DNA-Bindungsdomäne und für die Aktivierungsdomäne cotransformiert. Durchschnittlich wurde also von jedem Klon der Rattenleber cDNA Library ca. 5,5 mal Plasmid DNA präpariert, die dann ca. 5,5fach zusammen mit pGBT9-APOBEC-1 in eine Hefezelle transformiert wurde. 1629 Hefekolonien wuchsen auf dem SD(-LTH) Agar und wurden auf b -Galaktosidaseaktivität getestet. 12 Klone zeigten durch eine Blaufärbung im b -Galaktosidaseassay eine Reportergenaktivierung an. Die Plasmid DNA dieser 12 Klone wurde durch Elektroporation in E. Coli transformiert und die pGAD10 Plasmid DNA isoliert. Alle 12 Klone wurden durch small-scale Cotransformation mit pGBT9-APOBEC-1 in den Hefenstämmen HF7c und SFY526 auf Echtheit der zuvor gezeigten Reportergenaktivierung getestet. Zwei Klone rekonstituierten die Reportergenaktivierung für HIS3 und lacZ und wurden mit den Oligonukleotiden 5`AD und 3`AD sequenziert (ABI PRISM^R Cycle Sequencing ready Reaction Kit). Beide Klone codierten für Homologe des hnRNP C₁ Protein der Ratte. Der eine Klon enthielt die cDNA für die Aminosäuren 1 – 223, der andere Klon für die Aminosäuren 1 – 229.

Die alleinige Transformation der für die Homologe des hnRNP C₁ codierenden Plasmide in die Hefestämme HF7c und SFY526 hatte keine Reportergenaktivierung zur Folge ; es zeigte sich keine Blaufärbung im b -Galaktosidaseassay. Die Interaktion der beiden hnRNP C₁ Homologe mit APOBEC-1, angezeigt durch lacZ-Positivität, ließ sich verläßlich in beiden Hefestämmen reproduzieren. Die zwei folgenden Abbildungen sollen die Ergebnisse des Genbankscreenings verdeutlichen.

Zur Überprüfung der Spezifität der Interaktion von APOBEC-1 und hnRNP C₁ Protein führten wir eine Mutagenese-Untersuchung durch. Wir klonierten mehrere Trunkierungen der beiden Proteine in die entsprechenden Vektoren des Two-Hybrid Systems und testeten sie auf Protein-Protein-Interaktionen. Drei Trunkierungen von APOBEC-1 wurden in das Plasmid pGBT9 kloniert: APOBEC_{(1 –112)}, APOBEC_{(1 – 180)}, APOBEC_{(73 – 229)}, in Klammern jeweils der Bereich der Aminosäuren im offenen Leserahmen der cDNA.

Vom hnRNP C₁ Protein klonierten wir zusätzlich zu den zwei im Two-Hybrid System als Interaktionspartner von APOBEC-1 identifizierten Trunkierungen eine weitere in den Vektor pGAD 424: hnRNP C_{(1 – 93)}. Zudem überprüften wir, ob der menschliche hnRNP C₁ full-length-clone in dem Hefensystem mit APOBEC-1 interagiert. Dazu war es notwendig, die volle Länge der hnRNP C₁ cDNA in das Plasmid pGAD 424 zu klonieren und auf Interaktion mit APOBEC-1 zu testen. Die Trunkierungen sind im Folgenden graphisch dargestellt:

Abbildung 5

Es wurde folgende Proteinkombinationen auf Interaktion getestet:

Eine Rekonstitution der b -Galaktosidaseaktivität stellte sich nur bei den Kombinationen von APOBEC-1 in voller Länge und hnRNP C₁ entweder auch in voller Länge oder in Form der Trunkierung ein, die aus der Library herausselektioniert wurde. Alle anderen Trunkierungen zeigten keine Interaktion im Two Hybrid System.

Um die funktionelle Bedeutung der durch Two Hybrid Selektion identifizierten Interaktion zwischen APOBEC-1 und hnRNP C₁ zu untersuchen, exprimierten wir hnRNP C₁ in E. coli und reinigten das Protein säulenchromatographisch über DEAE-Säulen und ssDNA-Cellulose-Säulen auf. Durch anschließende size-exclusion Chromatographie über eine Superose 12 FPLC (Pharmacia^R) Säule konnte ein sehr hoher Reinheitsgrad erreicht werden. Die hnRNP C₁ Deletionsmutante M104, die nur die ersten 104 Aminosäuren und damit die RNA Bindungsdomäne umfaßt, wurde ebenfalls in E. Coli exprimiert und säulenchromatographisch aufgereinigt. Die Aufreinigungen von hnRNP C1 und M104 wurden im wesentlichen wie von Görlach, M. et al. 1994 beschrieben durchgeführt. APOBEC-1 exprimierten wir als GST (Glutathiontransferase) –Fusionsprotein (GST-APOBEC-1) in E. coli und reinigten das Protein durch Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose. Zudem exprimierten wir als Kontrollprotein GST-Protein alleine in E. Coli und reinigten es ebenfalls durch Affinitätschromatographie auf. Das Apo B mRNA Editing Enzym wurde aus Rattenenterozyten wie von Greeve et al. 1991 beschrieben zunächst über eine DEAE-Sepharose-Säule, dann über Heparin-Agarose partiell aufgereinigt.

Wir testeten den Einfluß von rekombinantem hnRNP C₁ Protein und seiner Deletionsmutante M 104 sowie von rekombinantem GST-APOBEC-1 und des Gluthationtransferaseanteils (GST) dieses Fusionsproteins auf die Editingreaktion. Hierzu wurden mehrfach in vitro Editingreaktionen durchgeführt, wobei die rekombinanten Proteine in unterschiedlichen Konzentrationen dem partiell aufgereinigten Apo B mRNA Editing Enzym zugesetzt wurden. Ein repräsentatives Autoradiogramm zeigt Abbildung 6. Diese Abbildung zeigt in Bahn 1 und 2 zunächst die Aktivität der Heparinfraktion. Der Puffer allein als Negativkontrolle hat keine Editingaktivität (Abb. 6, Bahn 3). 0,1 µg hnRNP C₁ Protein veränderte die Aktivität der Heparin-Fraktion nicht wesentlich (Abb. 6, Bahn 4). Durch Zugabe von 0,5 µg hnRNP C₁ Protein zu 8 µg der Heparin-Fraktion ließ sich die Editingreaktion vollständig inhibieren (Abb. 6, Bahn 5). Ebenso ließ sich nach Zugabe von 1,0 µg und 1,5 µg hnRNP C₁ Protein keine Editingaktivität mehr detektieren (Abb. 6, Bahn 6 – 7). Nach Zugabe von 1,5 µg GST-Protein zeigte sich keine Änderung der Editingaktivität (Abb. 6, Bahn 8). GST-Protein diente als Kontrollprotein für das rekombinante GST-APOBEC-1, um einen Einfluß des Gluthationtransferaseanteils des Fusionsproteins auszuschließen. Wir gaben 0,5 µg rekombinantes GST-APOBEC-1 zu der Heparin-Fraktion hinzu und beobachteten eine deutliche Steigerung der Editingaktivität (Abb. 6, Bahn 9). Bereits durch Zugabe von 100 ng hnRNP C₁ Protein zu dem Mix aus Heparin-Fraktion und GST-APOBEC-1 zeigte sich eine Minderung der Editing Enzym-Aktivität, die in etwa der Ausgangsaktivität der Heparin-Fraktion entsprach (Abb. 6, Bahn 10). Nachdem die zugegebene Menge des hnRNP C₁ Protein auf 0,5 µg oder 1,0 µg gesteigert wurde konnte keine Editingaktivität mehr detektiert werden (Abb. 6, Bahn 11 -12).

Um die Inhibition des Apo B mRNA Editings durch rekombinantes hnRNP C₁ Protein genauer zu charakterisieren untersuchten wir die Auswirkungen der hnRNP C₁ Deletionsmutante M104 auf die Editingaktivität. M104 umspannt die RNA-Bindungsdomäne des hnRNP C₁ Protein. Ein repräsentatives Autoradiogramm zeigt Abbildung 7. Die durch 0,5 µg APOBEC-1 stimulierte Heparin-Fraktion wurde mit 0,25 µg, 0,5 µg, 1,0 µg und 1,5 µg hnRNP C₁ Protein versetzt. Bereits durch Zugabe von 0,25 µg hnRNP C₁ Protein wurde die Editingaktivität auf ein gerade noch zu detektierendes Maß reduziert (Abb. 7, Bahn 4). Nach Zugabe von 0,5µg oder mehr hnRNP C₁ Protein war keine Editingaktivität mehr darstellbar (Abb. 7, Bahn 5 – 7). M104 wurde ebenfalls in Mengen von 0,25 µg, 0,5 µg, 1,0 µg und 1,5 µg zu der durch 0,5 µg GST-APOBEC-1 verstärkten Heparin-Fraktion hinzugefügt. Es zeigte sich für keine der angegebenen Konzentrationen eine Inhibition der Editingaktivität (Abb. 7, Bahn 8 – 11). GST-APOBEC-1 (0,5 µg) alleine ist nicht in der Lage Apo B mRNA zu editieren (Abb. 7, Bahn 12). GST-APOBEC-1 (0,5 µg) und hnRNP C₁ Protein (0,5 µg und 1,0 µg) entwickelten genauso wie GST-APOBEC-1 (0,5 µg) und M104 (0,5 µg und 1,0 µg) ohne Zugabe von partiell aufgereinigtem Apo B mRNA Editing Enzym keine Editingaktivität (Abb.7, Bahn 13 - 16).

Abbildung 6

Abbildung 7

Um Proteine zu entdecken, die neben APOBEC-1 in den Prozeß des Apo B mRNA Editings involviert sind, führten wir Two-Hybrid-Selektion in Hefen durch. Two-Hybrid-Selektion ist ein modernes genetisches Screening-System zur Identifizierung von Interaktionen zwischen Proteinen. Durch Anwendung dieser Methode gelang bereits in der Vergangenheit der Nachweis zahlreicher Protein-Protein-Interaktionen von physiologischer Relevanz. So wurde beispielsweise die Interaktion zwischen den Onkoproteinen RAS und RAF mit Two-Hybrid Selektion indentifiziert (van Aelst et al., 1993). Wir untersuchten mit Two-Hybrid-Selektion 5,5 x 10⁶ unabhängige Rattenleber cDNA Genbank Klone auf Bindung an APOBEC-1 und konnten eine Interaktion von hnRNP C₁ Protein mit APOBEC-1 identifizieren. Der Nachweis der Interaktion gelang durch zwei Genbank-Klone, die Homologe des hnRNP C₁ Protein der Ratte (Aminosäuren 1 – 223 bzw. 1 – 229) darstellen. Die zwei interagierenden Klone wurden in unterschiedlichen Screening-Experimenten und verschiedenen Genbank cDNA Präparationen isoliert. Die Bindung der beiden Proteine im Two-Hybrid-System bestätigte sich durch den Nachweis einer Interaktion von APOBEC-1 mit dem "full-length" hnRNP C₁ Protein des Menschen. In Mutageneseexperimenten konnten wir das hohe Maß der Spezifität dieser Interaktion zeigen. Drei Trunkierungen von APOBEC-1 (Aminosäuren 1 – 112, 1 – 180 bzw. 73 – 229) zeigten keine Interaktion mit hnRNP C₁ Protein. Auch eine weitere Trunkierung des hnRNP C₁ Protein(Aminosäuren 1 – 93) interagierte nicht mit APOBEC-1 in den Hefezellen. hnRNP C₁ Protein ist ein hochexprimiertes Kernprotein, das in Form von (C₁)₃ C₂ –Tetrameren während der Transkription naszierende prä-mRNA bindet (Dreyfuss, 1986 ; Dreyfuss et al., 1993 ; McAffe et al., 1996). hnRNP C₁ Protein inhibiert in vitro sehr effizient die enzymatische Aktivität des partiell aufgereinigten Apo B mRNA-Editing Enzymkomplexes. Zudem bindet hnRNP C₁ Protein spezifisch an eine Apo B sense RNA von 55 Nukleotiden, welche die für das Editing notwendige Sequenz enthält (Greeve et al., 1998). Die Inhibierung des Apo B mRNA Editings in vitro beruht nicht auf einem das RNA-Substrat maskierenden Effekt durch ein RNA-Bindungsprotein, wie durch die Versuche mit der die RNA-Bindungsdomäne des hnRNP C₁ Proteins enthaltenden Deletionsmutante M 104 gezeigt werden konnte. M104 bindet stark an die Apo B RNA, inhibiert jedoch nicht die Editingreaktion (Greeve et al., 1998). In Sedimentationsanalysen von nukleären Rattenleberextrakten sedimentierte das hnRNP C₁ Protein ausschließlich in 40S hnRNP Komplexen, der Apo B mRNA Editing Enzym-Komplex jedoch im Bereich von 22 – 27S. Damit konnte gezeigt werden, daß das hnRNP C₁ Protein kein Bestandteil des Apo B mRNA Enzym-Komplexes ist (Greeve et al., 1998). Das hnRNP C₁ Protein könnte während der RNA-Prozessierung eine regulative, das Apo B mRNA-Editing limitierende Funktion haben.

Unsere Ergebnisse lassen sich gut mit denen von Lau et al., 1997 vereinbaren, die ebenfalls durch Two-Hybrid-Selektion eine Interaktion von APOBEC-1 mit ABBP-1 identifiziert haben. ABBP-1 ist ein 331 Aminosäuren umfassendes RNA-Bindungsprotein der Ratte, das bis auf eine Insertion am C-terminalen Ende identisch ist mit dem hnRNP A/B Protein des Menschen (Lau et al., 1997). Durch Immundepletion von ABBP-1 vermindert sich die in vitro Editingaktivität in S 100 Extrakten von stabil mit APOBEC-1 transfizierten HeG2-Zellen. Die Rate des endogenen Apo B mRNA Editings dieser Zellen wurde durch Transfektion eines ABBP-1 cDNA Antisensekonstruktes deutlich vermindert (Lau et al., 1997). hnRNP C₁ Protein und hnRNP A/B haben in hohem Maße Sequenzhomologien (Burd et al., 1989). Es wurde gezeigt, das hnRNP C₁ und hnRNP A₁ Proteine an repetitive AUUUA Sequenzen in der nichttranslatierten 3` Region (3`UTR) verschiedener labiler mRNAs binden (Hamilton et al., 1993). Die hnRNP Proteine A₁ und C scheinen durch die Bindung an diese repetitiven Pentanukleotide modulierend auf den zytoplasmatischen mRNA Umsatz und die Translationseffizienz einzuwirken (Hamilton et al., 1993). Für die hnRNP C Proteine wurde eine spezifische Interaktion mit stromabwärts (downstream) der Polyadenylierungs-Schnittstelle gelegenen RNA Sequenzen gezeigt (Wilusz et al., 1988). hnRNP C Proteine binden an ein 29 Nukleotide umfassendes, AU-reiches Motiv in der nichttranslatierten 3`Region (3`UTR) der mRNA des APP (amyloid precursor protein) und tragen damit zu einer Stabilisierung der mRNA bei (Zaidi et al., 1995). In der Apo B RNA existieren ein alternatives Polyadenylierungs-Signal und eine Polyadenylierungs-Schnittstelle stromabwärts des C-6666 gelegen, die sowohl in edierter wie auch in unedierter Apo B RNA genutzt werden können und zur Synthese von Apo B-48 in stabil mit einem Apo B-100 Minigen transfizierten Ratten-Hepatom-Zellen führen (Heinemann et al., 1994). Lau et al. entdeckten 1990 durch Crosslinking Experimente ein 40 kDa Protein aus nukleären Rattenleberextrakten, das spezifisch an synthetische Apo B RNAs mit einer Länge von 26 bis 65 Nukleotiden um die Editing-"site" gelegen bindet. Dieses 40 kDa Protein ist nie genauer charakterisiert worden. Eventuell handelte es sich um das hnRNP C₁ Protein der Ratte, von dem gezeigt zeigen konnten, daß es sehr stark und spezifisch die Apo B RNA bindet (Greeve et al, 1998). In der Apo B mRNA existiert ein AUUUA-Motiv (Nukeotidposition 6697 – 6701) in unmittelbarer Nachbarschaft mit zwei AGUUA-Sequenzen (Nukleotidposition 6690 – 6694 und 6706 – 6711). Diese AU-reiche Region ist stromabwärts des C-6666 und der "mooring"-Sequenz (6671 – 6681) gelegen (Knott et al., 1986). APOBEC-1 bindet relativ unspezifisch an eine innerhalb und stromabwärts der "mooring"-Sequenz gelegene AU-reiche Region (Nukleotide 6680 – 6703), wie durch UV Crosslinking gezeigt werden konnte (Navaratnam et al., 1995 ; Navaratnam et al., 1998). Es existieren also drei Proteine, von denen gezeigt wurde, daß sie an den AU-reichen Abschnitt der Apo B mRNA stromabwärts der Editing-"site" (Nukleotidposition 6680 – 6711) binden: APOBEC-1, ABBP-1 und hnRNP C₁ Protein. Eine mögliche Erklärung der starken Inhibition der in vitro Editingaktivität des partiell aufgereinigten Apo B mRNA Editing Enzyms durch hnRNP C₁ Protein könnte also auf einer Verdrängung von APOBEC-1 oder ABBP-1 aus ihren RNA-Bindungen liegen. Denkbar wäre jedoch auch eine auf der Protein-Protein-Interaktion zwischen APOBEC-1 und hnRNP C₁ Protein beruhende Inhibition der Editingaktivität. hnRNP C₁ Protein könnte einerseits die Anlagerung von APOBEC-1 an das RNA-Substrat behindern oder andererseits die für die enzymatische Aktivität notwendige Dimerisierung von APOBEC-1 verhindern (Lau et al., 1994 ; Navaratnam et al., 1998). Ein Argument für die ursächliche Bedeutung der Protein-Protein-Interaktionen für die Inhibition des Editings liefert die hnRNP C₁ Deletionsmutante M104, die trotz starker, wenn auch unspezifischer RNA-Bindung nicht zu einer Inhibition der in vitro Editingaktivität führt (Greeve et al., 1998). M104 enthält die RNA-Bindungsdomäne des hnRNP C₁ Proteins und konkurriert somit gleichsam mit APOBEC-1 und ABBP-1 um die Bindung an die Apo B RNA.

Durch Greeve et al. konnte zudem gezeigt werden, daß auch 40S hnRNP Komplexe, die aus nukleären Rattenleberextrakten präpariert wurden, die Editingreaktion in gleichem Maße inhibieren wie rekombinantes hnRNP C₁ Protein (Greeve et al., 1998). Zusammengenommen deuten die hier gezeigten Ergebnisse, insbesondere auch die Inhibition des Apo B mRNA Editings durch native 40S hnRNP Komplexe, darauf hin, daß es sich bei der Interaktion von hnRNP C1 Protein und APOBEC-1 um eine Interaktion von funktioneller Bedeutung in vivo handelt. Apo B mRNA Editing bedarf einer strengen Regulation. Bei transgenen Tieren, die APOBEC-1 in der Leber überexprimieren scheint dieses Regulationsgleichgewicht aufgehoben zu sein. Diese Tiere entwickeln hepatozelluläre Karzinome (Yamanaka et al., 1995). hnRNP C₁ Protein könnte ein das Apo B mRNA Editing limitierender Faktor sein. Die funktionelle Bedeutung für die mRNA Prozessierung, die für die hnRNP C Proteine gezeigt ist, legt nahe, daß möglicherweise bisher nicht bekannte Mechanismen während der prä-mRNA Prozessierung das Apo B mRNA Editing regulieren und limitieren (Choi et al., 1986 ; Dreyfuss et al., 1993). Basierend auf einem Vergleich der Effizienz des Editing für verschiedene Transkripte formulierten Sowden et al. die Hypothese, daß eine RNA nur eine begrenzte Gelegenheit hat, ediert zu werden (Sowden et al., 1996a). Diese "Population Gating Hypothese" besagt, daß der Anteil edierter RNAs einer "RNA-Population" bestimmt wird durch multiple in das Spleißen der prä-mRNA involvierte Faktoren. Sowden erklärte mit dieser Hypothese das Paradoxon, daß obwohl das Expressionsniveau von APOBEC-1 limitierend für das APO B mRNA Editing ist, der Anteil edierter, endogener Apo B mRNA in McArdle7777-Zellen unabhängig davon ist, ob zusätzlich noch exogene, transfizierte Apo B RNA exprimiert und ediert wurde. Es zeigte sich, daß die Anzahl und Dichte der Introns in der Apo B RNA einen negativen Einfluß auf die Effizienz des Editing hat. Für voll prozessierte RNA Substrate zeigte sich die höchste Editing-Effizienz (Sowden et al., 1996a). Die hnRNP C Proteine sind hochexprimierte prä-mRNA Bindungsproteine und haben eine wichtige Funktion für die RNA Prozessierung (Choi et al., 1986 ; Dreyfuss et al., 1993). (C₁)₃C₂-Tetramere assoziieren mit naszierender prä-mRNA während der Transkription und bilden neben anderen hnRNP Proteinen die Core-Proteine der 40S heterogenen nukleären Ribonukleoprotein Partikel vor der Formierung der Spleißosomen (Choi et al., 1986 ; Bennett et al., 1992 ; Huang et al., 1994). In den Spleißosomen haben die hnRNP C Proteine eine entscheidende Funktion in deren katalytischer Aktivierung indem sie durch Induktion der Spaltung der Basenpaarungen der U4-U6 snRNAs (small nuclear RNA) ein Loslösen der U4 snRNA vermitteln (Forne et al., 1995). Die Fähigkeit zur Interaktion mit APOBEC-1 und die Inhibition der in vitro Editingaktivität von partiell aufgereinigtem Apo B mRNA Editing Enzym machen hnRNP C₁ Protein zu einem guten Kandidaten als "gate-keeper" für das Apo B mRNA Editing im Sinne der Hypothese Sowdens. Mit Hel-N1 und AUF1 wurden zwei weitere Proteine beschrieben die AU-reiche RNAs binden und in der Lage sind, spezifisch an die Apo B RNA zu binden und Apo B mRNA Editing in vitro zu inhibieren (Anant et al., 1997). Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, das während der mRNA Prozessierung Apo B mRNA Editing durch prä-mRNA Bindungsproteine wie hnRNPC₁ inhibiert wird und somit die Aktivität von APOBEC-1 auf einzelne Edierungen begrenzt wird.

hnRNP C Proteine sind im Gegensatz zu anderen hnRNP Proteinen ausschließlich im Zellkern lokalisiert. hnRNP A₁ etwa ist in den mRNA Export in das Cytoplasma involviert und pendelt zwischen Nukleus und Cytoplasma (Michael et al., 1995 ; Nakielny und Dreyfuss, 1996). Im Gegensatz zu hnRNP A₁, das ein Kernexportsignal (NES) beinhaltet, haben die hnRNP C Proteine ein starkes Kernlokalisationssignal (NLS) (Michael et al., 1995a/b ; Nakielny und Dreyfuss, 1996). Wie das Kernlokalisationssignal zu einer Retention der hnRNP C Proteine im Nukleus führt ist ebenso nicht bekannt wie der Mechanismus der Loslösung der hnRNP C Proteine von der mRNA vor deren Export in das Cytoplasma (Nakielny und Dreyfuss, 1996). Für APOBEC-1, das ganz überwiegen im Zellkern lokalisiert ist wurde kürzlich gezeigt, daß es ein Kernexportsignal trägt (Yang et al., 1997b). Lau et al. konnten zeigen, daß Apo B mRNA Editing im wesentlichen im Zellkern stattfindet (Lau et al., 1991). Es zeigte sich, daß hoch aufgereinigte polyadenylierte und gespleißte Apo B mRNA in dem gleichen Ausmaß (53 %) ediert ist wie die gesamte Apo B RNA (56 %) und die polysomale Apo B RNA (62 %) (Lau et al., 1991). Im Einklang mit der "Population Gating Hypothese von Sowden et al. (1996a) nehmen wir an, daß Apo B RNA Editing erst stattfinden kann, nachdem die sich die hnRNP C Proteine innerhalb der RNA Prozessierung von der RNA gelöst haben und bevor die Apo B mRNA in das Cytoplasma exportiert wird. Nur eine künstliche Überexpression von APOBEC-1 überwindet diese starke negative Regulierung des Apo B mRNA Editing und führt zu Hyperediting von Apo B RNA und anderen RNAs und damit schließlich zur Tumorentwicklung bei den transgenen Tieren (Yamanaka et al., 1995, 1996, 1997 ; Sowdwn et al., 1996b). Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Interaktion von APOBEC-1 mit hnRNP C₁ Protein eine Verbindung zwischen der Regulation des Apo B mRNA Editings und RNA Prozessierung schafft. Apo B mRNA Editing steht unter starker restriktiver Kontrolle um eine größtmögliche Spezifität der zu edierenden RNA-Base zu ermöglichen. Mit hnRNP C₁ Protein ist ein guter Kandidat identifiziert, der möglicherweise zur Vermittlung dieser Spezifität beiträgt. Eine weitere Charakterisierung des Apo B mRNA Editing Enzymkomplexes wird vielleicht weitere Proteine identifizieren, die nicht nur eine Funktion für das Editing erfüllen, sondern auch noch eine Rolle in der RNA Prozessierung spielen.

Apolipoprotein (Apo) B kann in zwei verschiedenen Formen exprimiert werden: Apo B-100, das Hauptstrukturmolekül der LDL und das die aminoterminalen 48 % umfassende Apo B-48, ein wichtiger Bestandteil der Chylomikronen. Im menschlichen Dünndarm sowie in der Leber der Ratte und anderer Säuger kann in der Apo B mRNA an Nukleotidposition 6666 Cytidin durch Deaminierung in Uridin umgewandelt werden, wodurch aus dem für die Aminosäure Glutamin kodierenden Triplet ein translationales Stop-Codon entsteht. Diese Form der posttranskriptionellen Modifikation der Apo B mRNA – genannt Apo B mRNA Editing - wird durch einen Enzymkomplex katalysiert. Bisher konnte nur dessen katalytische Untereinheit APOBEC-1 ( Apo B mRNA editing enzyme component 1) kloniert und ausführlich charakterisiert werden. In der vorliegenden Untersuchung wurde mittels Two-Hybrid-Selektion in Hefen eine Rattenleber cDNA-Genbank nach weiteren Komponenten des Apo B mRNA Editing Enzymkomplexes durchsucht. Wir konnten so eine Interaktion von APOBEC-1 mit dem hnRNP C₁ Protein nachweisen. Eine Mutagenese-Untersuchung, in der verschiedene Trunkierungen von APOBEC-1 und von hnRNP C₁ in dem Hefesystem nicht miteinander interagierten, zeigte das hohe Maß an Spezifität der identifizierten Interaktion. Wir konnten zeigen, daß rekombinantes hnRNP C₁ Protein die enzymatische Aktivität des partiell aus Rattendünndarm aufgereinigtem Apo B mRNA Editing Enzymkomplex inhibiert. Die hnRNP C₁ Deletionsmutante M104, welche die RNA-Bindungsdomäne des Proteins umfaßt, bewirkte in gleichartigen Experimenten keine Inhibition der Editingreaktion. So konnte ausgeschlossen werden, daß der inhibierende Effekt auf die Editingreaktion auf einer unspezifischen Substratbindung durch hnRNP C₁ Protein beruht. hnRNP C₁ Protein ist ein hochexprimiertes Kernprotein, das naszierende RNA während der Transkription bindet und eine wichtige Rolle bei der Formierung von Spleißosomen spielt. hnRNP C₁ scheint zudem eine regulative, möglicherweise Spezifität vermittelnde Funktion für das Apo B mRNA Editing zu haben.

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Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Jobst Greeve für die wissenschaftliche Betreuung während meiner Doktorarbeit. Meinem Freund Heinrich Lellek danke ich für die gute und fruchtbare Zusammenarbeit. Zudem möchte ich meiner Mutter und Herrn Günter Filter für die großzügige Unterstützung danken.

Tangstedter Str. 51

25462 Rellingen

Geburtsdatum: 11.02.1968

Geburtsort: Hamburg

Grundschule Vizelinstraße, Hamburg 1974 – 1978

Carl-von-Ossietzky Gymnasium, Hamburg 1978 – 1987

Ein Semester Studium der Anglistik, Universität Hamburg 1987 – 1988

Studium der Medizin, Universität Hamburg 1990 – 1997

Experimenteller Teil: Identifikation und Charakterisierung des

hnRNP C₁ Proteins als Inhibitor des Apo B mRNA Editings im

Labor von Herrn Dr. J. Greeve, Medizinische Kernklinik und

Poliklinik, Universitäts-Krankenhaus Eppendorf 1995 – 1997

Arzt im Praktikum in der Medizinischen Kernklinik und

Poliklinik des Universitäts-Krankenhauses Eppendorf 1997 – 1999

Zivildienst im Pflegeheim Westerrönfeld, Kreis Rendsburg 1988 – 1990

Ich versichere ausdrücklich, daß ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfaßt, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich gemacht habe, und daß ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung zur Promotion beworben habe.