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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-75773
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/7577/


Identifizierung und Charakterisierung viraler und zellulärer Faktoren, die die Replikation des humanen Tumorvirus, das Merkelzell Polyomavirus, beeinflussen

Identification and characterisation of viral and cellular factors which influence the replication of the human tumor virus, the Merkel Cell Polyomavirus

Neumann, Friederike

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SWD-Schlagwörter: Polyoma-Virus
Freie Schlagwörter (Deutsch): Merkelzell Polyomavirus , humanes Tumorvirus , PML-NB , in vitro Replikationssystem
Basisklassifikation: 42.32
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Fischer, Nicole (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.08.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 06.12.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Das Merkel-Zell Polyomavirus (MCPyV) ist das fünfte von bisher 13 bekannten humanen Polyomaviren. Interessanterweise ist es das erste Virus dieser Familie, das mit der Tumorgenese im eigenen Wirt assoziiert ist. Dabei kann es bei immunsupprimierten und älteren Menschen zur Entstehung des Merkelzellkarzinoms (MCC), einem seltenen aber sehr aggressiven Hauttumor, entscheidend beitragen. MCPyV zählt zu den humanen Tumorviren aufgrund der folgenden Charakteristika: Das Virusgenom ist monoklonal in das Genom der Tumorzellen des MCC integriert. Primärtumor wie auch die Metastasen eines Patienten weisen identische Integrationsstellen auf. In den Tumorzellen des MCC werden die viralen Onkoproteine, sT- und LT-Antigen, exprimiert, wobei die Proliferation der Tumorzellen von der Expression dieser viralen Proteine abhängig ist. Interessanterweise zeigen alle MCPyV Sequenzen, welche aus MCC isoliert wurden, Mutationen auf, die zu einem verkürzten LT-Antigen führen. Dabeibleibt die Bindestelle für das Retinoblastomprotein (pRb) immer erhalten und die ATPase/Helikase-Domäne des Proteins, welche für die Replikation essentiell ist, wird nicht mehr exprimiert. Bisher hat sich die Mehrzahl der Publikationen auf die Epidemiologie und die Mechanismen der durch MCPyV induzierten Transformation fokussiert. Information über den Zelltyp, in denen MCPyV persistiert oder permissiv repliziert, sind nicht bekannt, daher gibt es bislang nur unzureichende Informationen zum Lebenszyklus des MCPyV. Bislang wurden von drei Arbeitsgruppen in vitro Replikationssysteme etabliert. Alle Systeme zeigen die gleiche Einschränkung: Zwar können Replikation sowie die Expression der frühen und späten Gene untersucht werden, auch die Bildung weniger viraler Partikel ist detektierbar, jedoch ist keine serielle Transmission möglich.
In dieser Arbeit wurden zusätzlich zu den bereits in vorangegangenen Arbeiten 25 analysierten Zelllinien weitere Zelllinien mit Hilfe des in vitro Replikationssystems untersucht. Insbesondere wurden weitere Hautzelllinen (HFF und UISO) wie auch B-Zelllinien (BJAB und RAJI) in diese Analysen eingeschlossen. Neuere Studien legen nahe, dass möglicherweise Hautzellen das Reservoir des Virus darstellen könnten, da MCPyV DNA in Hautabstrichen nachgewiesen werden konnte bzw. auch MCPyV DNA in B-Lymphozyten detektiert werden konnte. Desweiteren werden Stammzellen der Haut wie auch prä-B-Zellen als Vorläuferzellen des Merkelzellkarzinoms diskutiert. Während die B-Zelllinien weder DNA Replikation noch frühe virale Transkription aufzeigten, konnte in den Hautzelllinien eine schwache virale DNA Replikation des MCPyV detektiert werden. Dabei ist es möglich, dass die untersuchten B-Zelllinien bereits zu differenziert waren um die MCPyV Replikation zu ermöglichen. Das hier angewendete MCPyV in vitro Replikationssystem wurde weiterhin genutzt um in zuvor identifizierten semi-permissiven Zelllinien (PFSK-1, H1299 und 293) zelluläre wie auch virale Faktoren auf ihren Einfluss auf die virale DNA Replikation zu untersuchen. Zuvor durchgeführte Arbeiten zeigten, dass die zusätzliche Expression der frühen Gene des MCPyV die Replikation deutlich verbessert, wobei auch hier kein permissives System etabliert werden konnte. Dies lässt eventuell eine limitierte Expression oder einen Defekt in den späten Genen des MCPyV vermuten. Innerhalb dieser Arbeiten wurde insbesondere der Einfluss der Kapsidproteine auf das MCPyV Replikationssystem untersucht. Auch die Ko-Expression der Kapsidproteine VP1 des MCPyV sowie VP1 und VP2 des Mauspolyomavirus (MPyV) zeigten keine Verbesserung der viralen DNA Replikation, wie auch keine serielle Transmission. Hinsichtlich zellulärer Faktoren, die den Lebenszyklus des MCPyV negativ beeinflussen könnten, wurde innerhalb dieser Arbeit ein Schwerpunkt auf PML-Strukturen, sogenannte PML-nuclear bodies (PML-NB) gelegt. Für viele RNA- und DNA-Viren ist bekannt, dass sie mit PML-NB interagieren, wobei sowohl positive wie auch negative Effekte dieser Strukturen auf den Lebenszyklus von dieser Viren beschrieben sind. So konnte gezeigt werden, dass die Funktion von PML-NB inhibiert wird, indem die Viren eine Umstrukturierung der PML-NB induzieren oder auch den proteasomalen Abbaus wichtiger Bestandteile der PML-NB initiieren. Innerhalb dieser Arbeit wurde sowohl die Veränderung der Struktur der PML-NB mittels konfokaler Mikroskopie während der MCPyV Replikation wie auch der Einfluss der drei Hauptkomponenten PML, Sp100 und Daxx auf die MCPyV Replikation untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass abhängig von der Replikation des MCPyV PML-NB stark vergrössert werden, die Zahl dieser Strukturen signifikant ansteigt und insbesondere das Sp100 Protein von diesen Strukturen dissoziiert. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die virale DNA Replikation in Zellen ansteigt, die kein Sp100 exprimieren. Diese Arbeiten zeigen, das Sp100 ein negativer Faktor der MCPyV Replikation ist.
Kurzfassung auf Englisch: The Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) is one out of 13 known human Polyomaviruses (PyV) known to date and the only PyV associated with tumorigenesis in its own host. MCPyV is highly associated with MCC, a rare and highly aggressive skin tumor which mostly afflicts elderly and immunosuppressed patients. Because of the high association of the virus with MCC and the following characteristics MCPyV is considered to be a human tumor virus: (1) The MCPyV-Genome is monoclonally integrated into the genome of the tumor cells. (2) Within one patient viral integration sites of the primary tumor and subsequent metastases are identical. (3) The viral oncoproteins sT- and LT-Antigen are expressed in the tumor cells and the expression of these T-Antigens is essential for the proliferation of these cells. Interestingly, all MCPyV sequences isolated from MCC revealed truncating mutations within the coding region of the LT-Antigen resulting in a shortened LT-Antigen which still harbored the Retinoblastomaprotein (pRb) binding site but lacked the ATPase/Helicase domain, which is essential for viral replication. As a consequence shortened LT proteins are defective in inducing viral replication but still bind to the pRb protein and thereby induce cell proliferation. Most studies focused on the epidemiology and on transforming strategies of the virus. Information on where the virus persists in its host and which cell type is permissive for viral replication are still unknown. Subsequently only limited information on the viral life cycle are available. We and others have established a semi-permissive replication system which allows the study of parts of the viral life cycle. Using this system viral DNA replication as well as early and late gene expression can be efficiently studied. Furthermore, viral particle formation has been detected however no serial transmission could be achieved.
In the first part of this study further cell lines were analyzed to find a permissive cell line. In particular, two skin cell lines (UISO and HFF) and two B-lymphocyte cell lines (BJAB and RAJI) were included. Recent studies suggest skin cells to be the reservoir of this virus because MCPyV DNA could be isolated out of skin swabs but also in B-lymphocytes MCPyV DNA could be detected. Additionally stem cells of the skin as well as pre B-cells are discussed as progenitor cells for the MCC. While the B-cell lines did not show viral DNA replication or early gene expression of the MCPyV, marginal viral DNA replication could be detected in the two skin cell lines. It is possible that the analyzed B-cell lines are too far differentiated to support viral DNA replication. The applied semi permissive replication system for the MCPyV was further used in prior identified semi permissive cell lines (293, H1299 and PFSK-1) to analyze the influence of viral as well as cellular factors on the replication of the MCPyV. Previous studies already showed that the viral DNA replication can be increased by exogenous expression of the early genes. But this did not improve the system to be permissive which suggests a limited expression or a defect of the late genes of the MCPyV. In this work also the influence of the capsid proteins on MCPyV replication was investigated. The analyzed capsid proteins VP1 of the MCPyV and VP2 and VP3 of the Murine Polyomavirus (MPyV) showed no influence on the viral DNA replication. Also a serial transmission could not be detected in cell culture. With regard on cellular factors which could negatively influence the viral lifecycle this study focused on PML structures named PML-Nuclear Bodies (PML-NB). For many RNA and DNA Viruses is shown that they interact with PML-NB. PML-NB are known to be positive as well as negative for the viral infection depending on the particular analyzed virus. To circumvent negative effects of PML-NB some viruses inhibit their function by inducing reorganization of the structure of PML-NB or proteasomal degradation of components of PML-NB which are important for these structures In this study morphologic changes of the structure of PML-NB during viral DNA replication were investigated by confocal microscopy. Also the influence of the three components of PML-NB, PML, Daxx and Sp100 on the MCPyV replication was analyzed. During MCPyV replication PML-NB showed an increase in size, a significant increase in number and in particular the dissociation of Sp100 from PML-NB. Additionally knock down of Sp100 lead to increased viral DNA replication. These experiments argue for Sp100 as negative factor for MCPyV replication.

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