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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-78145
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/7814/


Vorkommen, Verbreitung und biochemische Charakterisierung bakterieller Arylmalonat-Decarboxylasen

Occurrence, distribution and biochemical characterization of bacterial arylmalonate decarboxylases

Maimanakos, Janine

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SWD-Schlagwörter: Decarboxylasen , Charakterisierung , Enzym
Freie Schlagwörter (Deutsch): Arylmalonat-Decarboxylasen , Arylessigsäure-Derivate , Enantiomer , AMDase
Freie Schlagwörter (Englisch): arylmalonate-decarboxylase , arylacetic acid , profen , enantiomer , AMDase
Basisklassifikation: 42.30
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Streit, Wolfgang R. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2015
Erstellungsjahr: 2015
Publikationsdatum: 10.11.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Arylmalonat-Decarboxylasen (AMDasen) sind sehr seltene und bisher wenig erforschte Enzyme. Zurzeit gibt es nur vier bekannte und biochemisch charakterisierte Vertreter. Ihre Fähigkeit zur Kofaktor-unabhängigen Decarboxylierung α-disubstituierter Malonsäure-Derivate zu homochiralen Produkten macht sie jedoch als Biokatalysatoren für industrielle Prozesse äußerst attraktiv. Ziel dieser Arbeit war es daher, weitere, bisher unbekannte Vertreter dieser Enzymklasse aufzufinden, biochemisch zu charakterisieren und so zu einem besseren Verständnis hinsichtlich des Vorkommens, der Verbreitung und der Funktionsweise der AMDasen beizutragen. Neben funktionellen und sequenzbasierten Screeningmethoden wurde eine Datenbankrecherche durchgeführt. Basierend auf publizierten Daten wurde ein Suchalgorithmus erarbeitet, um eine sichere Vorhersage über die AMDase-Aktivität potentieller Kandidaten zu treffen. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden zwei Enzyme biochemisch charakterisiert. Dabei handelte es sich um das aus dem Bodenisolat Variovorax sp. HH02 stammenden AmdV und das per Datenbanksuche ermittelte AmdP aus Polymorphum gilvum.Die höchste Enzymaktivität zeigten die Enzyme bei 30°C (AmdV) bzw. 37°C (AmdP) und einem pH von 7. Die Enzymaktivität der AMDasen konnte durch keinen der getesteten Effektoren gesteigert werden, was eine Kofaktor-unabhängige Katalyse vermuten lässt. Beide Enyzme zeigten ihre größte Lösungsmitteltoleranz in Ansätzen mit 10% DMSO. Die AMDasen erreichten noch 50±4% (AmdV) bzw. 82±7% (AmdP) der ursprünglichen Enzymaktivität.
Basierend auf spezifischen Sequenzmotiven und Screeningverfahren konnten in dieser Arbeit 20 zusätzliche AMDasen identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass Arylmalonat-Decarboxylasen mit konservierten Sequenzmustern des Prototyps aus Bordetella bronchiseptica extrem seltene Enzyme sind, begrenzt auf die Klassen der α-, β- und γ- Proteobacteria mit möglichem Ursprung im Boden. Homologien der Aminosäuresequenzen und Vergleiche der Sequenzumgebung ermöglichten die erstmalige Einteilung in sieben Enzymcluster. Auffällig ist die Häufung von Genen, kodierend für verschiedene Transporter der TTT-Familie, TRAP-Transporter und ABC-Transporter, sowie Genen für Mandelat-Racemasen/Muconat-laktonisierende Enzyme, die in einem funktionellen Zusammenhang mit der Substrataufnahme bzw. dem Abbau von AMDase-Produkten stehen könnten.
Kurzfassung auf Englisch: Arylmalonate-Decarboxylases (AMDases) are very rare and hitherto underexplored enzymes. Currently only four known and biochemically characterized representatives exist. However, their capability of cofactorless decarboxylation of α-disubstituted malonic acid derivates to homochiral products make them attractive and promising candidates for the use as biocatalysts in industrial processes. The intention of this work was to discover further yet unknown representatives of this enzyme class and to biochemically characterize them, resulting in a better understanding regarding to occurrence and distribution of AMDases. Besides functional and sequence-based screening methods a data base search was performed. Based on published data a search algorithm was developed for a reliable prediction of AMDase activity of potential candidates. In the further course of this work two enzymes were biochemically characterized. These are AmdV from Variovorax sp. HH02, originated from soil and AmdP from Polymorphum gilvum found by data base search. The enzymes displayed their highest enzyme activity at 30°C (AmdV) respectively 37°C (AmdP) and pH 7. The enzyme activity could not be increased by any tested effector, which leads to the assumption of a cofactor-independent catalysis. Both enzymes showed their highest tolerance to organic solvents with 10% DMSO. The AMDases still reached 50±4% (AmdV) and 82±7% (AmdP) of their unaffected enzyme activity, respectively.
Based on specific sequence patterns and screening methods 20 additional AMDases could be identified in this work. It became apparent that arylmalonate decarboxylases with the conserved sequence pattern of Bordetella bronchiseptica’s prototype are extremely rare enzymes, limited to the classes of α-, β- and γ-Proteobacteria, possibly arisen from soil. Amino acid homologies and comparison of gene surrounding sequences enabled the classification of seven enzyme clusters for the very first time. Particularly striking is the accumulation of genes coding for different transporters of the TTT family, TRAP transporters and ABC transporters as well as genes coding for mandelat racemases/muconate lactonizing enzymes, which might be involved in substrate uptake or degradation of AMDases’ products.

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