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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-81003
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2016/8100/


Selektion und Charakterisierung von P2X4-spezifischen monoklonalen Antikörpern und Nanobodies

Selection and characterisation of P2X4-specific monoclonal antibodies and nanobodies

Bergmann, Philine

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Basisklassifikation: 44.45
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Koch-Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.07.2016
Erstellungsjahr: 2016
Publikationsdatum: 11.10.2016
Kurzfassung auf Deutsch: P2X4 ist ein ATP-gesteuerter Ionenkanal, der u.a. von Zellen des Immunsystems, Gefäßendothel- und Lungenepithelzellen in Lysosomen und anderen intrazellulären Vesikeln exprimiert wird. Nach Fusion dieser Vesikel mit der Zellmembran kann P2X4 auch an die Zelloberfläche gelangen. Die Aktivierung von P2X4 führt zu einem Einstrom von Ca2+-Ionen und einem Ausstrom von K+-Ionen in das bzw. aus dem Cytosol. Der Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert unterschiedliche nachgeschaltete Prozesse. Ziel dieser Arbeit war es, P2X4-spezifische Antikörper und Nanobodies als experimentelle Werkzeuge für die Untersuchung von P2X4 in humanen und murinen Zellen zu entwickeln und zu charakterisieren. Nanobodies (Nbs oder VHHs) sind Einzeldomänen-Antikörper, die sich von Schwereketten-Antikörpern der Lamas ableiten. Ihre hohe Stabilität, Löslichkeit und leichte Reformatierbarkeit ermöglichen vielfältige Anwendungen. In dieser Arbeit wurden Nanobodies und monoklonale Antikörper (mAk) aus P2X4-immunisierten Lamas (Nbs) oder Ratten (mAk) gewonnen und bezüglich ihrer Fähigkeit P2X4 spezifisch zu binden oder funktionell zu regulieren untersucht. Dabei konnten vier Antikörper und vier Nanobodies identifiziert werden, die humanes P2X4 spezifisch erkennen sowie drei Antikörper und drei Nanobodies, die Maus-P2X4 spezifisch erkennen. Drei Nanobodies zeigten schwache oder mäßige Kreuzreaktivitäten mit P2X4-Orthologen aus der Ratte. Lediglich ein Nanobody zeigte eine schwache Reaktion mit dem zu P2X4 paralogen Purinrezeptor P2X7. Analysen der relativen Dissoziations-geschwindigkeit deuten auf höhere Bindungsaffinitäten der monoklonalen Antikörper als der bivalenten Nb-Fc-Fusionsproteine, deren Affinitäten wiederum höher erscheinen als die der monovalenten Nbs. Kreuzblockade-Analysen zeigten, dass die meisten Antikörper und Nanobodies an überlappende Epitope binden. Patch-Clamp-Analysen der ATP-induzierten Spannungsänderungen in P2X4-transfizierten Xenopus-Oozyten zeigten keinen signifikanten Einfluss der Nanobodies auf die Ionenkanalaktivität von P2X4. Zwei Nanobodies und ein monoklonaler Antikörper konnten erfolgreich zur Detektion und zur Translokation von endogenem P2X4 auf die Zelloberfläche von aktivierten, primären murinen Peritoneal-Mastzellen eingesetzt werden. Die in dieser Arbeit generierten Nanobodies und monoklonalen Antikörper sind hilfreiche Werkzeuge, um die Rolle von P2X4 in Gesundheit und Krankheit zukünftig genauer zu studieren.
Kurzfassung auf Englisch: P2X4 is an ATP-gated ion channel which cells of the immune system, vascular endothelial- and pulmonary epithelial cells, among others, express in their lysosomes and other intracellular vesicles. After fusion of these vesicles with the cell membrane, P2X4 can also be situated on the cell surface. Activation of P2X4 leads to influx of Ca2+-ions into the cytosol and efflux of K+-ions. The increase in intracellular Ca2+ concentration activates different downstream processes. The aim of this thesis was to generate and characterize P2X4-specific antibodies and nanobodies as experimental tools for the investigation of P2X4 in human and murine cells. Nanobodies (Nbs or VHHs) are single-domain-antibodies, which are derived from llama heavy chain only antibodies. Their high stability, solubility and ease of reformatting render them suitable for various applications.
In the present work, nanobodies and monoclonal antibodies (mAk) from P2X4 immunized llamas (Nbs) or rats (mAk) were obtained and analyzed with regard to their ability to specifically bind or functionally regulate P2X4. Thereby four antibodies and four nanobodies were identified that specifically recognize human P2X4. Also, three antibodies and three nanobodies with specificity for mouse P2X4 were found. Three nanobodies showed low or moderate cross-reactivities with rat orthologs of P2X4. Only one nanobody showed slight reaction with the paralogous purine receptor P2X7. Analyses of the relative dissociation rates indicated higher binding affinities of the monoclonal antibodies compared to the bivalent Nb Fc fusion proteins which in turn appear to be higher than affinities of the monovalent Nbs. Cross-blockade analyses showed that most of the antibodies and nanobodies bind to overlapping epitopes. No significant influence of the nanobodies on P2X4 ion channel activity was observed by Patch-Clamp analyses of the ATP induced voltage changes in P2X4 transfected Xenopus oocytes. Two nanobodies and one monoclonal antibody were successfully applied for detection and for translocation of endogenous P2X4 to the cell surface of activated, primary murine peritoneal mast cells.
The nanobodies and monoclonal antibodies generated in the course of this work represent useful tools for future investigations of the role P2X4 plays in health and disease.

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