Die Rolle der Tight-Junction-Proteine Claudin-1, Occludin und ZO-1 in nativer und gestörter epidermaler Wundheilung

Abstract

Tight Junction (TJ)-Proteine sind bekannt für ihre Beteiligung an der Proliferation und Differenzierung. Da diese Vorgänge essenziell für die normale Wundheilung der Haut sind, wurden in der vorliegenden Arbeit die TJ-Proteine Claudin-1, Occludin und ZO-1 in ex vivo Wundheilungsmodellen und Gewebeproben von akuten und chronischen humanen Wunden untersucht, um ihre Rolle in der gestörten Wundheilung zu ermitteln. Besonders für Claudin-1 und Occludin wurden bedeutende Unterschiede in der Lokalisation/Expression gefunden, wobei chronische Wunden oftmals einen Verlust der Proteine am Wundrand und/oder der regenerierenden Epidermis zeigten. Knockdown-Experimente mit primären humanen Keratinozyten, die entweder mit geringen oder hohen Calcium-Konzentrationen kultiviert wurden, um die Ausbildung funktioneller TJs zu verhindern bzw. zu induzieren, zeigten unter beiden Kultivierungsbedingungen, dass eine reduzierte Claudin-1-Expression zu einer signifikant beeinträchtigten Scratch-Wundheilung führte, verursacht durch verzögerte Migration und verminderte Proliferation. Die Aktivierung des AKT-Kinase-Signalweges war nach dem Claudin-1-Knockdown ebenfalls signifikant abgeschwächt und der Proteinlevel der ERK 1/2-Kinase reduziert. Die selektive Inhibition der AKT-Kinase-Aktivität mittels MK-2206 verzögerte ebenso die Scratch-Wundheilung und bestätigte damit die Rolle des veränderten AKT-Kinase-Signalings in der Vermittlung des Effekts des Claudin-1-Knockdowns. Darüber hinaus konnte auch ein Einfluss des Claudin-1-Knockdowns auf die Expression verschiedener Proteine gezeigt werden, die in die Differenzierung von Keratinozyten involviert sind. Der Knockdown von Occludin zeigte erst dann einen Einfluss auf die Scratch-Wundheilung, wenn die Zellen zusätzlich mechanischem Stress – der regulär in in vivo Wunden auftritt – ausgesetzt waren, wobei die Wundheilung nur in Niedrig-Calcium-Bedingungen beeinträchtigt wurde. Für den Knockdown von ZO-1 konnte kein Einfluss auf die Scratch-Wundheilung nachgewiesen werden. Da die meisten der beobachteten Effekte des Knockdowns von Claudin-1 und Occludin unabhängig von der Ausbildung barrierebildender TJs waren, konnten somit Funktionen der TJ-Proteine in der Haut ohne Bezug zur Barrierebildung demonstriert werden. Für Claudin-1 waren die Effekte auf die Scratch-Wundheilung allerdings stärker, wenn TJs ausgebildet werden konnten. Insgesamt betrachtet liefern die Ergebnisse dieser Arbeit Beweise für eine direkte Rolle von Claudin-1 und Occludin in der epidermalen Wundheilung mit potentieller klinischer Bedeutung.

Tight junction proteins are known to be involved in proliferation and differentiation. Since these processes are essential for normal skin wound healing, the tight junction proteins claudin-1, occludin and ZO-1 were investigated in ex-vivo skin wound healing models and in tissue samples of acute and chronic human wounds in this study to determine their role in impaired wound healing. Major differences in localization/expression of these proteins, especially for claudin-1 and occludin, were observed, with chronic wounds often showing a loss of the proteins at the wound margins and/or in the regenerating epidermis. Knock-down experiments in primary human keratinocytes, cultured either under low or high calcium conditions to inhibit or induce the assembly of functional tight junctions, showed that decreased claudin-1 expression resulted in significantly impaired scratch wound healing in both conditions, with delayed migration and reduced proliferation. Activation of AKT pathway was significantly attenuated after claudin-1 knock-down, and protein levels of ERK 1/2 kinase were reduced. Selective inhibition of AKT kinase activity using MK-2206 also impaired scratch wound healing, confirming the role of altered AKT signaling in mediating the effect of a claudin-1 knock-down. Furthermore, an impact of claudin-1 knock-down on the expression of several proteins involved in keratinocyte differentiation was shown. For occludin, downregulation had no impact on wound healing in normal scratch assays but after subjecting the cells to mechanical stress – which is normally present in wounds – wound healing was impaired in low, but not in high calcium conditions. Regarding the ZO-1 knock-down, no significant impact on scratch wound healing was found. For claudin-1 and occludin we show that most of these actions are independent from the formation of barrier-forming TJ structures thus demonstrating non-barrier related functions of TJ proteins in the skin. However, for claudin-1 effects on scratch wound healing were more pronounced when TJs could form. Together, our findings provide evidence for a direct role of claudin-1 and occludin in epidermal regeneration with potential clinical importance.