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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-87265
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8726/


Die Rolle des Spine-Apparats bei der Ausprägung funktioneller Plastizitätsmechanismen an der hippocampalen Moosfasersynapse

The role of the spine apparatus in the expression of functional plasticity at the hippocampal mossy fiber synapse

Maier, Urban

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SWD-Schlagwörter: Hippocampus , Moosfasersynapse , Spine-Apparat , Zwei-Photonen-Mikroskopie , Patch-Clamp-Technik , Calciumsignale , Plastizität , Einzelsynapse
Freie Schlagwörter (Deutsch): Ryanodin-Rezeptoren , Calcium-induzierte Calciumfreisetung , Endoplasmatisches Retikulum , gepaarte Ableitung
Freie Schlagwörter (Englisch): hippocampus , mossy fiber synapse , spine apparatus , two-photon microscopy , patch clamp technique , calcium imaging , synaptic plasticity
Basisklassifikation: 42.03 , 42.17 , 42.63 , 42.12 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Oertner, Thomas G. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.08.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 15.09.2017
Kurzfassung auf Deutsch: In der Neurobiologie ist es allgemeiner Konsens, dass der Hippocampus funktionell in die Lern und Gedächtnisprozesse des Gehirns involviert ist. Innerhalb des hippocampalen Netzwerks spielt die Moosfasersynapse (MF Synapse) eine wichtige Rolle in der Verarbeitung, Speicherung und dem Abrufen von Informationen (Lisman, 1999). Sie weist im Vergleich zu anderen Synapsen des zentralen Nervensystems einige Besonderheiten bei der Ausprägung von Kurz und Langzeitplastizitätsmechanismen (STP, LTP) auf. Eine zentrale Rolle für die LTP Induktion an der hippocampalen MF Synapse spielt der vorübergehende Anstieg der postsynaptischen Ca2+ Konzentration (Williams und Johnston, 1989; Zalutsky und Nicoll, 1990; Kapur et al., 1998; Yeckel et al., 1999). Bis heute konnte jedoch nicht zweifelsfrei geklärt werden, in welchem Maße der Mechanismus der Ca2+ induzierten Ca2+ Freisetzung (CiCR) aus den internen Speichern des endoplasmatischen Retikulums (ER) zur Ca2+ Kinetik in den dendritischen Spines der MF Synapse beiträgt.
Die stapelförmige Anordnung der ER Zisternen in Spines telencephalischer Neurone stellt eine besondere Struktur des ERs dar, den sogenannten Spine Apparat. Diese Organelle ist ein regelmäßiger Bestandteil der komplexen MF Spines (Excrescenzen). Der Verlust des Synaptopodin Gens hat zur Folge, dass hippocampale Neurone keine Spine Apparate mehr ausbilden. Synaptopodin defiziente Mäuse (Knock-out, KO) weisen in Folge dessen eine Reihe von Defiziten bei Lern und Gedächtnisaufgaben auf. Dabei wurde bereits auf eine funktionelle Verbindung des Spine Apparats als intrazellulärer Ca2+ Speicher und dessen Einfluss auf die Ausprägung von LTP verwiesen (Deller et al., 2003). Die genaue Funktion der Spine Apparat Organelle ist jedoch bis heute enigmatisch. Aus diesem Grund lag der Fokus dieser Arbeit auf der Untersuchung intrazellulärer Ca2+ Signale an hippocampalen MF Synapsen von Wildtyp (WT) und KO Mäusen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden mit Hilfe von Zwei Photonen Ca2+ Messungen die
Ca2+ Antworten in Spines und Dendriten gepatchter Mooszellen (MCs) in organotypischen entorhino hippocampalen Schnittkulturen untersucht. Der postsynaptische Ca2+ Influx wurde in dieser Experimentreihe durch Serien zurückpropagierender Aktionspotentiale (bAPs) und der damit einhergehenden Aktivierung der spannungsgesteuerter Ca2+ Kanäle (VGCCs) evoziert. Dabei zeigte sich einerseits eine signifikant gesteigerte Kinetik der
Ca2+ Antworten in WT Spines im Vergleich zu KO Spines, wogegen die Ca2+ Antworten in den Dendriten beider Genotypen identisch ausfielen. Zudem konnten wir durch die Ryanodin vermittelte Blockade des CiCR erstmals die mechanistische Verbindung zwischen dem Spine Apparat und einer gesteigerten Funktion des CiCR nachweisen.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Präsenz eines Spine Apparats und die damit einhergehende dynamische Steigerung der postsynaptischen Ca2+ Antworten, möglicherweise Einfluss auf die LTP Mechanismen an der individuellen MF Synapse hat. Dazu musste ein neuer methodischer Ansatz zur gepaarten Ableitung individueller MF Synapsen entwickelt werden (Geiger und Jonas, 2000), der es zusätzlich erlaubte, die evozierten Ca2+ Antworten im postsynaptischen Spine zu erfassen. Mit Hilfe der “Shadowpatching” Methode (Kitamura et al., 2008) gelang es, die MF Boutons an fluoreszenz markierten Excrescenzen von MCs optisch zu identifizieren und erfolgreich zu patchen. Die Identifizierung sowie die anschließende gezielte Stimulation des präsynaptischen MF Boutons, in Kombination mit der Zwei Photonen Ca2+ Messung im postsynaptischen Spine und der somatischen Whole Cell Patch Clamp Ableitung der postsynaptischen MC, eröffnete uns die Möglichkeit, die Eigenschaften einzelner identifizierter MF Synapsen zu studieren. Durch die kombinierte prä und postsynaptische Stimulation war es uns möglich, LTP an diesen Synapsen zu induzieren. Wir gaben dem neuen Ansatz deshalb den Namen iPot (individuelle Potenzierung).
Unsere Ergebnisse konnten zeigen, dass MF Synapsen in Abhängigkeit ihrer Aktivitätsgeschichte in heterogenen Zuständen anzutreffen sind und dementsprechend unterschiedlich auf die Induktion von LTP reagieren. Anhand des präliminären Datensatzes der Synaptopodin defizienten MF Synapsen ergaben sich zudem weiterführende Hinweise auf eine mögliche Beeinträchtigung der retrograden Signalwege an der MF Synapse, die bei repetitiver MF Stimulation für die Induktion präsynaptischer LTP Mechanismen relevant sein könnten (Yeckel et al., 1999; Maruo et al., 2016).

Kurzfassung auf Englisch:
The general consensus among neuroscientists is that the hippocampus is functionally involved in the cognitive processes of learning and memory. Within the hippocampal network, the mossy fiber synapse (MF synapse) plays an important role in the processing, storage and retrieval of the information flow (Lisman, 1999). Compared to other central synapses, the MF synapse shows a number of unique characteristics in the expression of short term and long term plasticity mechanisms (STP, LTP). One central aspect in the postsynaptic induction of LTP at MF synapses is the transient increase of the postsynaptic Ca2+ concentration (Williams und Johnston, 1989; Zalutsky und Nicoll, 1990; Kapur et al., 1998; Yeckel et al., 1999). Until now, however, it could not be conclusively clarified to what extent the mechanism of Ca2+ induced Ca2+ release (CiCR) from the internal stores of the endoplasmic reticulum (ER) contributes to Ca2+ kinetics in dendritic spines of the MF synapse.
The so called spine apparatus, a form of stacked ER, can be found in spines of telencephalic neurons. It represents a regular component in complex MF spines (excrescences). Hippocampal neurons lacking the gene for synaptopodin do not longer form spine apparatuses. As a result, synaptopodin deficient mice show a number deficits in learning and memory tasks compared to wild type mice. In addition, a functional link between the Spine apparatus as intracellular Ca2+ store and the expression of LTP was already proposed (Deller et al., 2003). However, the exact function of the spine apparatus organelle is yet to be fully unraveled. Therefore, this work focuses on the investigation of intracellular Ca2+ signals on hippocampal MF synapses of wild type and mutant mice.
The first part of this thesis discusses Ca2+ kinetics in MF spines and adjacent dendrites of patch clamped mossy cells in organotypic entorhino hippocampal slice cultures using two photon Ca2+ imaging. In these experiments, the postsynaptic Ca2+ influx was evoked by a series of backpropagating action potentials (bAPs) and the associated activation of voltage gated Ca2+ channels (VGCCs). We observed a significant difference in the kinetics of the Ca2+ responses in spines of wild type compared to spines of synaptopodin deficient mossy cells, while dendritic Ca2+ responses did not differ between genotypes. Thus, by blocking the CiCR with ryanodine we revealed a mechanistic link between the spine apparatus and the enhanced function of the CiCR.
Based on these results, the second part of this work focuses on whether the presence of a spine apparatus and the accompanying dynamic increase in postsynaptic Ca2+ is potentially linked to LTP at individual MF synapses. Therefore, we developed a novel approach in order to perform paired recordings of individual MF synapses (Geiger und Jonas, 2000) whilst detecting Ca2+ responses in the postsynaptic spine. Further, the so called shadowpatching technique (Kitamura et al., 2008) enabled us to identify and patch individual MF boutons presynaptic to the fluorescence labelled excrescences of mossy cells.
The combination of fluorescence based identification and direct patch clamp stimulation of the presynaptic MF bouton in combination with the two photon Ca2+ imaging in the postsynaptic spine and whole cell patch clamp recordings of the postsynaptic mossy cell, allowed us to interrogate individual identified MF synapses. We named this novel approach to study LTP induction at individual MF synapses by combined pre and postsynaptic stimulation: iPot (individual potentiation).
Our results indicated that MF synapses are found in heterogeneous synaptic states depending on previous activity. Therefore, the induction of LTP was differentially expressed within these synapses. Preliminary data from synaptopodin deficient MFs suggest an impairment of the retrograde signalling pathways at the MF synapse, which may be relevant for the induction of presynaptic LTP mechanisms in response to repetitive MF stimulation (Yeckel et al., 1999; Maruo et al., 2016).

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