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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-87273
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2017/8727/


Die Blockierung der Immuncheckpoint-Achse TIGIT-PVR/PVRL2 als neuer therapeutischer Ansatz zur Behandlung der akuten myeloischen Leukämie

Immune Checkpoint Blockade of the TIGIT-PVR/PVRL2 Axis as Novel Therapeutic Strategy for the Treatment of Acute Myeloid Leukemia

Stamm, Hauke Heyo

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Basisklassifikation: 44.81
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Fiedler, Walter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.07.2017
Erstellungsjahr: 2017
Publikationsdatum: 12.09.2017
Kurzfassung auf Deutsch: Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne Erkrankung des blutbildenden Systems, bei der frühe hämatopoetische Vorläuferzellen durch die Akkumulation von Mutationen zum einen proliferative Vorteile erlangen und zum anderen in ihrer hämatopoetischen Differenzierung gestört sind. Neue Technologien erlauben immer tiefere Einblicke in die Heterogenität und Komplexität der AML. Nichtsdestoweniger hat sich die generelle Therapiestrategie für die Patienten in den letzten 30 Jahren nicht maßgeblich verändert.
In vielen Krebsentitäten liegt eine immunsupprimierende Mikroumgebung vor, und die endogene Immunabwehr ist durch dysfunktionale immunologische Effektorzellen reduziert oder außer Kraft gesetzt. Eine neue Hoffnung in der Behandlung von Krebserkrankungen ist die Immuntherapie, die in verschiedenen Verfahren durch Manipulation des Immunsystems versucht, eine effektive Antwort gegen den Tumor wiederherzustellen. Immuncheckpoint Moleküle regulieren das sensible Gleichgewicht der Immunantwort und schützen den Körper vor überschüssigen inflammatorischen Prozessen. Tumorzellen haben sich diesen Mechanismus zu Eigen gemacht. Als Teil der Immunevasion kommt es auf Krebszellen häufig zu einer Heraufregulation von Immuncheckpoint Liganden, die an die korrespondierenden Rezeptoren auf dysfunktionalen Effektorzellen binden und eine Immunantwort gegen den Tumor unterdrücken. Die Blockierung der Immuncheckpoint Moleküle cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4 (CTLA4) oder programmed cell death 1 (PD-1) durch monoklonale Antikörper konnte in vielen Krebsentitäten bereits klinische Erfolge liefern, was unter anderem zur Zulassung der beiden Medikamente zur Therapie des Melanoms führte. Kürzlich konnte der auf Immunzellen exprimierte Rezeptor T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains (TIGIT) als ein wichtiger Regulator der antitumoralen Immunantwort identifiziert werden. Die Liganden poliovirus receptor (PVR) wie auch polivirus receptor-related 2 (PVRL2) werden einerseits physiologisch von einer Reihe von Geweben exprimiert, andererseits konnte eine Überexpression auf einer Vielzahl an Tumorentitäten gezeigt werden. Die Bindung der Liganden PVR und PVRL2 an den Rezeptor TIGIT auf Immunzellen führt neben der direkten Inhibierung zytotoxischer T- und NK-Zellen auf vielen Ebenen zu einer negativen Regulation der Immunantwort.
In dieser Arbeit wurden die Genexpressionsdaten von 290 Patienten mit neu diagnostizierter AML, zu denen klinische Daten zur Verfügung standen, auf die prädiktive Bedeutung der Expression der Immuncheckpoint Moleküle PVR, PVRL2, CTLA4, CD80, CD86 sowie der PD-1 Liganden PD-L1 und PD L2 untersucht. Während eine hohe PVR- wie auch PVRL2-Expression in Log Rank-Analysen mit einem signifikant verkürzten Gesamtüberleben der Patienten unter konventioneller Chemotherapie assoziiert war, zeigte die Expression der anderen Moleküle keinen Einfluss auf das Gesamtüberleben der Patienten. Das Überleben der Patienten nach Chemotherapie wurde zudem in einem multivariaten Cox Regressionsmodell für die oben genannten Immuncheckpoint Moleküle sowie die Parameter Alter, Karyotyp und FLT3-Mutationsstatus untersucht. Eine hohe PVR-Expression sowie die FLT3-Mutation resultierten dabei als unabhängige prognostische Marker für das Überleben. In der vorliegenden Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass AML-Zelllinien und Blasten von AML-Patienten eine hohe Expression von PVR und PVRL2 aufweisen. Durch die Verwendung blockierender Antikörper gegen PVR und PVRL2 oder gegen den Rezeptor TIGIT konnte die zytotoxische Wirkung von mononukleären Zellen gesunder Spender (engl. healthy donor peripheral blood mononuclear cells (HD-PBMCs)) in einer Vielzahl von AML-Zelllinien im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen signifikant erhöht werden. Der bispezifische Antikörper (Bispecific T cell Engager (BiTE®)) AMG 330 verbindet CD33+ AML-Blasten mit CD3+ T-Zellen und führt zu einer effizienten Lyse der Zielzellen. Dennoch konnte gezeigt werden, dass diese Interaktion von Immuncheckpoint Molekülen beeinflusst wird. Die Kombination von PVR- und PVRL2-blockierenden Antikörpern oder eines TIGIT-blockierenden Antikörpers mit dem BiTE® Antikörperkonstrukt AMG 330 konnte die durch HD-PBMCs ausgelöste Lyse der untersuchten Zelllinien signifikant verstärken. Die Steigerung der Zytotoxizität von Immunzellen gegenüber AML Zellen war zudem von einer verstärkten Ausschüttung des Effektormoleküls Granzym B gekennzeichnet. Die durch die Verwendung von Zelllinien erhaltenen Ergebnisse konnten in Zytotoxizitätsassays mit Blasten von unbehandelten AML-Patienten bestätigt werden. Die beobachteten Effekte waren spezifisch für eine Blockierung der TIGIT PVR/PVRL2 Achse, T Zell mediiert und unabhängig von Antikörper abhängiger zellulärer Zytotoxizität. Die erhaltenen Ergebnisse konnten in vitro durch die Verwendung eines durch die CRISPR/Cas9-Technik hergestellten genetischen Doppelknockouts für die Gene PVR und PVRL2 in der AML-Zelllinie MV4-11 im Vergleich zu den parentalen Wildtyp-Zellen bestätigt werden. In einem Mausmodell wurde in immundefizienten Mäusen das Immunsystem durch humane T-Zellen rekonstituiert und den Tieren MV4-11 Wildtyp- oder PVR- und PVRL2-Doppelknockoutzellen transplantiert. Die Mäuse wurden darauffolgend entweder mit einem Placebo oder 10 µg/kg, 15 µg/kg bzw. 50 µg/kg AMG 330 behandelt. Es zeigte sich, dass die Mäuse, die mit den Doppelknockoutzellen transplantiert wurden, in allen Gruppen einen deutlichen Überlebensvorteil gegenüber den mit Wildtyp-Zellen transplantierten Tieren hatten.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Relevanz der TIGIT-PVR/PVRL2-Achse zur Regulation der Immunantwort im Patienten als auch in präklinischen Modellen auf. Der Einsatz blockierender Antikörper gegen TIGIT oder PVR und PVRL2 in Monotherapie oder die Kombination mit bereits etablierten Chemotherapeutika wie auch neueren immuntherapeutischen Ansätzen, beispielsweise dem BiTE® Antikörperkonstrukt AMG 330, stellt deshalb eine aussichtsreiche Therapieoption zur Behandlung der AML dar.
Kurzfassung auf Englisch: Acute myeloid leukemia (AML) is a malign disease of the hematopoietic system. Here, an accumulation of early mutations in hematopoietic precursor cells on the one hand leads to a proliferative advantage of these cells and on the other hand hematopoietic cell differentiation is disturbed. Although new technologies have meanwhile enabled deeper insights into the heterogeneity and complexity of AML, therapeutical regimes for AML patients have not been improved decisively over the last 30 years.
For various cancer entities, an immune suppressive microenvironment has been described and the endogenous immune defense is diminished or even abrogated due to dysfunctional immunologic effector cells. Hence, immune therapy is a new therapeutic approach against cancer, which orchestrates the immune system to restore an effective immune response against the tumor. Immune checkpoint molecules basically regulate the immune response, thereby protecting the body from uncontrolled and exceeding inflammatory processes. To overcome and escape the immune equilibrium, tumor cells upregulate immune checkpoint molecules. In this context immune checkpoint ligands on tumor cells bind to their corresponding receptors on dysfunctional effector cells to suppress the antitumor immune response. Monoclonal antibodies targeting the immune checkpoint molecules cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4 (CTLA4) or programmed cell death 1 (PD-1) have been successfully used in the treatment of many tumor entities, which has led to the approval of those drugs for the therapy of melanoma. Recently, the receptor T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains (TIGIT) expressed on immune cells has been identified as an important regulator of the antitumor immune response. Its ligands poliovirus receptor (PVR) and polivirus receptor-related 2 (PVRL2) are expressed physiologically by some tissues, contrariwise, an overexpression of those ligands could be shown for various tumor entities. Binding of PVR and PVRL2 to the immune cell-receptor TIGIT does not only lead to a direct inhibition of cytotoxic T- and NK-cells, but on many levels regulates the immune response negatively.
In this thesis, the gene expression data of 290 patients with newly diagnosed AML was analyzed in the context of the clinical course for the predictive significance of the expression of the immune checkpoint molecules PVR, PVRL2, CTLA4, CD80, CD86 and the PD-1 ligands PD-L1 and PD L2. Log-rank tests have shown that high PVR- as well as PVRL2 expression is associated with a significantly decreased overall survival of patients under conventional chemotherapy. The expression of the other molecules did not affect the overall survival of the patients. The survival of patients after chemotherapy was also investigated in a multivariate Cox regression model for the above mentioned immune checkpoint molecules as well as the parameters age, karyotype and FLT3 mutation status. A high PVR expression as well as the FLT3 mutation resulted as independent prognostic markers for survival. The presented work also shows a high expression of PVR and PVRL2 on AML cell lines and blasts of AML patients. The application of blocking antibodies targeting PVR and PVRL2 or the receptor TIGIT significantly increased the cytotoxic effect of healthy donor peripheral blood mononuclear cells (HD-PBMCs) in a variety of AML cell lines compared to untreated controls. The Bispecific T cell Engager (BiTE®) antibody construct AMG 330 links CD33+ AML blasts with CD3+ T cells leading to an efficient lysis of target cells. Nevertheless, it has also been shown that this interaction is influenced by immune checkpoint molecules. The combination of PVR and PVRL2 blocking antibodies or a TIGIT blocking antibody with the BiTE® antibody construct AMG 330 significantly increased the lysis of investigated cell lines induced by HD-PBMCs. Moreover, the enhanced cytotoxicity of immune cells against AML cells was accompanied by an increased secretion of the effector molecule granzyme B. The results obtained from cell line experiments were confirmed in cytotoxicity assays with blasts from untreated AML patients. The observed effects were specific to the blockade of the TIGIT-PVR/PVRL2 axis, T cell mediated and independent of antibody-dependent cellular cytotoxicity. The obtained results were confirmed in vitro by the comparison of a CRISPR/Cas9 mediated genetic double knockout of PVR and PVRL2 in the AML cell line MV4-11 with the parental wildtype counterpart. In immunodeficient NSG mice reconstituted with human T cells and transplanted with either MV4-11 PVR and PVRL2 double knockout or wildtype cells, prolonged survival was observed for mice transplanted with the knockout cells. Mice were treated with 10 µg/kg, 15 µg/kg or 50 µg/kg of the BiTE® antibody construct AMG 330 further extending the survival benefit of mice transplanted with double knockout cells in all groups.

The work presented here shows a clear relevance for the TIGIT-PVR/PVRL2 axis in regulating the immune response both in preclinical models and patients diagnosed with AML. The use of blocking agents against the TIGIT-PVR/PVRL2 axis in monotherapy or the combination with established chemotherapeutics as well as novel immunotherapeutic approaches, e.g. the BiTE® antibody construct AMG 330, represents a promising therapeutic option for the treatment of AML.

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