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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-92909
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2018/9290/


The 60 kDa Heat Shock Proteins of Leishmania donovani and their role on viability, stress tolerance and virulence

Die 60 kDa Hitzeschockproteine von Leishmania donovani und ihre Rolle für die Lebensfähigkeit, Stresstoleranz und Virulenz

Zirpel, Henner

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Basisklassifikation: 42.32
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Clos, Joachim (PD Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.08.2018
Erstellungsjahr: 2018
Publikationsdatum: 11.10.2018
Kurzfassung auf Englisch: Leishmaniasis is a disease caused by the protozoan parasite Leishmania spp. and is a major neglected tropical disease. Individuals infected with Leishmania parasites suffer from ulcerating, mostly self healing skin lesion, infections of the mucous membranes, and systemic, visceral infections. The latter are fatal if left untreated. The parasite faces challenges with various stressors during its parasitic life, cycling between sand flies and vertebrate hosts. During these life stages the parasite expresses various Heat Shock Proteins. The Heat Shock Protein 60 kDa (chaperonin 60, CPN60) is present in four different isoforms and at least one is expressed throughout the parasitic life cycle. The major function of chaperones is to assist proper folding of newly synthesised, denatured, miss-folded or un-folded proteins into their correct tertiary structures. However, why the parasite maintains four different CPN60 isoforms, named CPN60.1, CPN60.2, CPN60.3 and CPN60.4, is not known.
Therefore, the aim of this thesis was to analyse the role of the 4 different CPN60s in Leishmania donovani, the main causative agent of visceral leishmaniasis. Firstly, double allele gene replacement of the four different CPN60s was performed by homologous recombination and/or by CRISPR/Cas gene editing. For CPN60.1, CPN60.2 and CPN60.4 viable double allele replacement mutants were obtained while CPN60.3 is an essential gene in L. donovani of which only single allele replacement mutants could be generated. To verify any phenotypes, ectopic copies of the genes of interest (GOI) were introduced into the mutants and the wild type via episomal plasmids, to generate GOI over-expressing mutants. All mutants were analysed for phenotypic changes, such as growth under different conditions, morphology, infectivity and virulence.
It was found that CPN60.1 plays a role in the virulence of the parasite, as a lack of CPN60.1 leads to a 50% reduction of the relative parasite load in murine macrophages. For CPN60.2 a slightly reduced cell body length and a 60% growth reduction was observed in mildly acidic medium (pH = 5.5). No phenotypic changes were observed under the tested conditions for the CPN60.3 single allele replacement mutants and for CPN60.4 double allele replacement mutants.
Specific antibodies for the four different CPN60s were generated by immunising laying hens with the respective recombinant protein. It was shown that CPN60.1 is not expressed to detectable levels, in agreement with previous findings. Furthermore, it was not possible to distinguish between the closely related CPN60.2 and CPN60.3. Nevertheless, the combined CPN60.2/CPN60.3 abundance increase ~2.5-fold during in vitro axenic amastigote development, also in agreement with previous findings. The abundance of CPN60.4 remained stable throughout an in vitro life cycle of the parasite.
Co-immune precipitation experiments and luciferase refolding assays were preformed to analyse the interaction with the CPN10 co-chaperonin and the chaperone activity of each of the four CPN60s, using recombinantly expressed and affinity purified proteins. Preliminary data suggest chaperone functionality for CPN60.2, CPN60.3 and CPN60.4. The role of the co-chaperone CPN10 during the folding process remains unclear and needs to be further investigated. The co-immune precipitation experiments showed an interaction of CPN60.2 and CPN60.4 with the co-chaperonin CPN10 while no stable interaction between CPN60.3 and CPN10 could be detected.
The results obtained in this study broaden the understanding of the different CPN60s in and show that CPN60.3 is the major chaperone of L. donovani.
Kurzfassung auf Deutsch: Die Leishmaniose ist eine durch den protozoischen Parasiten der Gattung Leishmania verursachte Krankheit und gehört zu den wichtigsten und am häufigsten vernachlässigten tropischen Krankheiten. Patienten die mit dem Parasiten Leishmania infiziert sind, leiden unter ulzerierenden, meist selbst heilenden Hautläsionen, unter Infektionen der Schleimhäute und unter systemischen, viszeralen Infektionen. Letztere sind tödlich wenn sie nicht behandelt werden. Der Parasit ist während seines parasitischen Lebenszyklus, welcher zwischen der Sandmücke und dem Vertebraten statt findet, verschiedenen Stressoren ausgesetzt. Während dieses Lebenszykluses expremiert der Parasit verschiedene Hitze Schock Proteine. Die Hitze Schock Proteine der Größe 60 kDa (Chaperone 60, CPN60) sind in vier verschiedenen Isoformen vorhanden und mindestens eines wird während des Lebenszyklus durchgängig expremiert. Die Hauptfunktion der Chaperone ist die passende Faltung von neu synthetisierten, denaturierten, fehl gefalteten oder nicht gefalteten Proteinen in deren korrekte tertiäre Struktur zu unterstützen. Es ist jedoch nicht bekannt warum der Parasit Leishmania vier verschiedene CPN60 Isoformen, CPN60.1, CPN60.2, CPN60.3 und CPN60.4, besitzt.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Rolle der vier verschiedenen CPN60 Proteine in Leishmania donovani, dem Hauptverursacher der viszeralen Leishmaniose, zu untersuchen. Zuerst wurden Doppel Allele Austausch Mutanten der vier CPN60 Proteine mittels homologer Rekombination und CRISPR/Cas Genom Engineering hergestellt. Für CPN60.1, CPN60.2 und CPN60.4 wurden lebende Null Mutanten erhalten, während CPN60.3 ein essentielles Gen in L. donovani ist und ausschließlich Einzel Allele Austausch Mutanten hergestellt werden konnten. Um beobachtete Phänotyp Analysen zu verifizieren wurden ektopische Kopien des Zielgens (engl. gene of interest, GOI) in die Mutanten transfiziert. Weiterhin wurden, um das GOI über exprimierende Mutanten zu erhalten, episomale Kopien der Gene in den Wild Typ (WT) eingefügt. Alle Mutanten wurden auf phänotypische Änderungen, wie verändertes Wachstum unter verschiedenen Bedingungen, Morphologie, Infektivität oder Virulenz untersucht.
Es wurde beobachtet, dass CPN60.1 eine Rolle in der Virulenz des Parasiten spielt, da das Fehlen von CPN60.1 zu einer Verringerung der relativen Parasitenlast um 50% in murinen Makorphagen führt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Fehlen von CPN60.2 zu einem etwas kleineren Zellkörper führt, sowie das Wachstum in mildem sauren Milieu (pH = 5,5) auf 60% gehemmt ist. Es konnten keine phänotypischen Änderungen für die Einzel Allele Austausch Mutanten von CPN60.3 und für die Null Mutanten von CPN60.4 beobachtet werden.
Für die vier verschiedenen CPN60 wurden spezifische Antikörper hergestellt. Dazu wurden Legehennen mit dem entsprechenden Antigen immunisiert und die Antikörper aus den Eiern gewonnen. Es wurde gezeigt, dass CPN60.1 nicht in nachweisbaren Mengen expremiert wird, was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt. Weiterhin wurde gezeigt, dass es nicht möglich ist, zwischen den nah verwandten Proteinen CPN60.2 und CPN60.3 zu unterscheiden. Dennoch war die kombinierte, erhöhte Expression um das 2,5 fache von CPN60.2 und CPN60.3 während der in vitro Entwicklung zu axenischen Amastigote zu beobachten, was ebenfalls mit früheren Beobachtungen übereinstimmt. Die Proteinmenge von CPN60.4 blieb in allen in vitro Lebensstadien des Parasiten gleich.
Ko-Präzipitations Experimente und Luziferase Rückfaltungs Assays wurden durchgeführt, um die Interaktion mit dem Co-Chaperon CPN10 und um die Chaperon Aktivität der vier CPN60 nachzuweisen. Hierfür wurden rekombinant exprimierte und Affinitäts aufgereinigte Proteine verwendet. Vorläufige Daten zeigen eine Chaperone Aktivität von CPN60.2, CPN60.3 und CPN60.4 Die Rolle des Co-Chaperone CPN10 während des Faltungsprozesses bleibt weiterhin unklar und bedarf weiterer Untersuchungen. Die Ko-Präzipitation zeigte, dass CPN60.2 und CPN60.4 mit CPN10 interagieren, während keine stabile Interaktion zwischen CPN60.3 und CPN10 nachgewiesen werden konnte.
Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse erweitern das Verständnis über die vier verschiedenen CPN60s von L. donovani und zeigen, dass CPN60.3 das Hauptchaperone dieses Parasiten ist.

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