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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-95455
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9545/


Evaluation and Detection of Exosomes and Exosomal microRNAs in Breast Cancer

Evaluierung und Detektion von Exosomen und exosomalen mikroRNAs im Mammakarzinom

Stevic, Ines

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SWD-Schlagwörter: Brustkrebs , miRNS
Freie Schlagwörter (Englisch): Exosomes , extracellular vesicles , exosomal miRNA , TNBC , HER2+
Basisklassifikation: 44.81
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schwarzenbach, Heidi (PD Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.01.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 06.02.2019
Kurzfassung auf Englisch: Exosomes, small membrane vesicles, mediate cell-to-cell communication. Released by a donor cell, they transfer proteins, lipids and nucleic acids to another cell, resulting in modulation of the recipient cell. Tumor-derived exosomes may transform normal, wild type cells into malignant cells. MiRNAs that inhibit post-transcriptionally protein expression of their target mRNAs are assumed to be selectively packaged into exosomes and may be functionally active in the recipient cell.
In this study, the first aim was to identify particular miRNA signatures in exosomes derived from plasma of 435 HER2-positive and triple negative BC patients. First, the miRNA expression profiles were determined in exosomes derived from plasma of 15 triple-negative patients before neoadjuvant therapy using quantitative TaqMan real-time PCR-based microRNAs array cards containing 384 different miRNAs. Derived from these results, 45 miRNAs associated with different clinical parameters were then selected and mounted on miRNAs array cards that served for the quantification of exosomal miRNAs in 435 BC patients before therapy and 20 healthy women. A network of deregulated exosomal miRNAs with specific expression patterns that were also associated with clinicopathological parameters was identified in exosomes from HER2-positive and triple-negative patients. In uni- and multivariate models, miR-155 and miR-301 best predicted pathological complete response (pCR). The levels of 4 exosomal miRNAs (miR-27a, miR-155, miR-376a and miR-376c) upregulated before neoadjuvant therapy decreased to normal healthy levels after therapy. These findings may improve the stratification of patients into different risk groups and future targeted therapies. One of these most deregulated miRNAs was miR-376c detected in exosomes from BC patients. Its targets mRNAs were determined by the MirTrap system which locks the miRNA/mRNA pair into the RISC complex which can be pulled down using an antibody against this complex. Using an mRNA array, it was found that 31 mRNAs could be bound by miR-376c. The mRNAs mostly enriched in the RISC complex were the apoptosis inhibitor BCL2, the DNA repair and cell cycle gene BRCA1, the adhesion molecule Cadherin 1 and the cyclin-dependent kinase inhibitor 1A. Functional analyses showed that miR-376c had no impact on cell proliferation and apoptosis.
Western blot and ELISA showed significantly higher levels of exosomes in plasma of BC
patients than in healthy women. These findings point to an excessive secretion of exosomes in cancer patients. In addition, the size and concentration of the EVs were measured using the Nanoparticle tracking analysis. The measurements revealed that the majority of particles had a size of 120 nm. Finally, EVs were stained by a red fluorescence dye and visualized by confocal microscopy. The videos showed that EVs were released by cells, localized in the cell membrane and uptake by cells.
In conclusion, these findings suggest a selective packaging of miRNAs in exosomes from HER2-positive and triple-negative breast cancer patients which is also associated with the different clinical parameters. It is hypothesized that these different miRNA profiles forming the cargo of exosomes may be shuttled from cell to cell.
Kurzfassung auf Deutsch: Exosomen, kleine Membranvesikel, vermitteln die Kommunikation von Zelle zu Zelle. Sie
werden von einer Donorzelle freigesetzt und transportieren Proteine, Lipide und Nukleinsäuren in eine andere Zelle, was zu einer Modulation der Empfängerzelle führt. Vom Tumor befreite Exosomen können normale Wildtypzellen in bösartige Zellen umwandeln. Es wird angenommen, dass miRNAs, die die post-transkriptionelle Proteinexpression ihrer ZielmRNAs hemmen, selektiv in Exosomen verpackt werden und in der Empfängerzelle funktionell aktiv sein können.
In dieser Studie war das erste Ziel, bestimmte miRNA-Signaturen in Exosomen aus dem Plasma von 435 HER2-positiven und triple-negativen Brustkrebspatientinnen zu identifizieren. Zuerst wurden die miRNA-Expressionsprofile in Exosomen aus dem Plasma von 15 triple-negativen Patienten vor einer neoadjuvanten Therapie unter Verwendung quantitativer TaqMan real-time PCR-basierter mikroRNA-Array-Karten mit 384 verschiedenen miRNAs bestimmt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden dann 45 miRNAs, die mit den verschiedenen klinischen Parametern assoziiert waren, ausgewählt und auf miRNA-Array-Karten angebracht, die zur Quantifizierung exosomaler miRNAs bei 435 Brustkrebspatientinnen vor Therapie und 20 gesunden Frauen dienten. Ein Netzwerk von deregulierten exosomalen miRNAs mit spezifischen Expressionsmustern, die auch mit den klinisch-pathologischen Parametern assoziiert waren, wurde in Exosomen von HER2-positiven und triple-negativen Patientinnen identifiziert. In uni- und multivariaten Modellen prognostizierten miR-155 und miR-301 am besten die pathologische Response (pCR). Die Konzentrationen von 4 exosomalen miRNAs (miR-27a, miR-155, miR-376a und miR-376c), die vor der neoadjuvanten Therapie hochreguliert waren, verkleinerten sich auf normale gesunde Werte nach der Therapie. Diese Ergebnisse könnten die Stratifizierung von Patienten in verschiedene Risikogruppen und zukünftige zielgerichtete Therapien verbessern. Eine dieser am häufigsten deregulierten miRNAs war miR-376c, die in Exosomen von Brustkrebspatientinnen nachgewiesen wurde.
Seine Ziel-mRNAs wurden durch das MirTrap-System bestimmt, dass das miRNA/mRNAPaar in den RISC-Komplex aufnimmt, und der dann mithilfe eines Antikörpers gegen diesen Komplex isoliert werden kann. Unter Verwendung eines mRNA-Arrays wurden 31 mRNAs, die durch miR-376c gebunden werden konnten, gefunden. Die im RISC-Komplex meist angereicherten mRNAs waren der Apoptose-Inhibitor BCL2, das DNA-Reparatur- und Zellzyklus-Gen BRCA1, das Adhäsionsmolekül Cadherin 1 und der Cyclin-abhängige Kinase- Inhibitor 1A. Funktionelle Analysen zeigten, dass miR-376c keinen Einfluss auf Zellproliferation und Apoptose hatte.
Western Blot und ELISA präsentierten signifikant höhere Exosomen-Niveaus im Plasma von Brustkrebspatientinnen als bei gesunden Frauen. Diese Befunde weisen auf eine exzessive Sekretion von Exosomen bei Krebspatienten hin. Zusätzlich wurden die Größe und Konzentration der Exosomen unter Verwendung der Nanopartikel-Tracking-Analyse
gemessen. Die Messungen zeigten, dass die Mehrzahl der Partikel eine Größe von 120 nm aufwies. Schließlich wurden die Exosomen durch einen roten Fluoreszenzfarbstoff gefärbt und durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. Die Videos zeigten, dass EVs von Zellen freigesetzt wurden, in der Zellmembran lokalisiert waren und von Zellen aufgenommen wurden.
Zusammenfassend schlagen diese Ergebnisse eine selektive Verpackung von miRNAs in Exosomen von HER2-positiven und triple-negativen Brustkrebspatientinnen vor, die ebenfalls mit den unterschiedlichen klinischen Parametern assoziiert ist. Es wird vermutet, dass diese verschiedenen miRNA-Profile, die die Fracht von Exosomen bilden, von Zelle zu Zelle transportiert werden können.

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