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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-95480
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2019/9548/


Untersuchungen zur Expression des immunmodulatorischen Proteins PD-L1 im Urothelkarzinom der Harnblase

Expression analysis of the immunomodulatory protein PD-L1 in urothelial carcinoma of the bladder

Bergmann, Sonja

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SWD-Schlagwörter: Urothelkrebs , Blasenkrebs , Immuntherapie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Immun-Checkpoint-Inhibitor , Epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) , PD-L1 , Zirkulierende Tumorzellen (CTCs)
Freie Schlagwörter (Englisch): immune checkpoint inhibitor , epithelial-mesenchymal transition (EMT) , PD-L1 , circulating tumor cells (CTCs)
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Ganzhorn, Jörg (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.01.2019
Erstellungsjahr: 2019
Publikationsdatum: 06.02.2019
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel von Therapien mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren ist es, die negative Regulation der T-Zell-Aktivierung zu blockieren und dadurch die Suppression der gegen den Tumor gerichteten Immunantwort wieder aufzuheben. So werden beispielsweise anti-PD-1/PD-L1-Antikörper eingesetzt, um zu erreichen, dass Tumorzellen vom Immunsystem erkannt und zerstört werden.

Die wichtigsten Ergebnisse des Promotionsprojekts lassen sich wie folgt zusammenfassen:
- Western-Blot- und qRT-PCR-Analysen von 13 UCB-Zelllinien zeigten, dass die PD-L1-Expression mit dem molekularen Subtyp assoziiert ist. Während alle EL (epithelial-like)-Zelllinien, die dem basalen Subtyp zugeordnet werden können, PD-L1-Expression aufwiesen, konnte PD-L1 in den EL-Zelllinien mit luminalem Subtyp nicht detektiert werden. Sowohl PD-L1-positive als auch PD-L1-negative Zelllinien konnten innerhalb des ML (mesenchymal-like)-Phänotyps („kein Subtyp“) identifiziert werden.
- In fast allen Zelllinien konnte durch Stimulation mit dem immunaktivierenden Zytokin IFNγ ein deutlicher Anstieg sowohl der PD-L1-spezifischen Transkriptmenge als auch der Proteinexpression beobachtet werden. Die hier erzielte Erhöhung der PD-L1-Expression wurde u.a. durch die Transkriptionsfaktoren STAT1 und IRF1 vermittelt.
- Zur Untersuchung Tumorzell-intrinsischer Funktionen von PD-L1 wurden anhand verschiedener UCB-Zelllinien Modellsysteme mit knockdown oder Überexpression von PD-L1 generiert. Die Transkriptomanalyse von zwei PD-L1-überexprimierenden Zelllinien ergab jedoch nur wenige PD-L1-vermittelte differenziell exprimierte Gene. Ein in Folgeprojekten zu untersuchendes Kandidatengen kodiert für das Peptidhormon Neurotensin.
- PD-L1-Expression wurde sowohl in den EL- als auch in den ML-Zelllinien detektiert. Weder Zellen mit PD-L1-knockdown noch mit PD-L1-Überexpression zeigten Hinweise auf Veränderungen der Expression von EMT-indizierenden Proteinen.
- Ob Faktoren, die EMT auslösen können, die PD-L1-Expression beeinflussen, sollte a) durch Behandlung der Zellen mit dem EMT-induzierenden Zytokin TGFβ, b) durch knockdown des als EMT-Suppressor bekannten Transkriptionsfaktors GRHL2 und c) durch Überexpression der EMT-Transkriptionsfaktoren ZEB1 und Slug untersucht werden. Hierzu wurden zwei Zelllinien (5637, BFTC-905) ausgewählt, die sowohl EL- als auch ML-Eigenschaften aufweisen. Nur in diesen beiden Zelllinien ließ sich die PD-L1-Transkription durch TGFβ-Behandlung erhöhen. Die Herauf- bzw. Herabregulation einzelner die EMT beeinflussender Transkriptionsfaktoren führte zwar zu Veränderungen der Expression EMT-anzeigender Transkripte und/oder Proteine, aber nicht zu einer entscheidenden Änderung der PD-L1-Expression. Durch die TGFβ-Behandlung der manipulierten Zelllinien jedoch konnte ein deutlicher Anstieg der PD-L1-Expression erzielt werden.
- In 5637-Zellen scheint die Aktivität der Kinase GSK-3β eine entscheidende Rolle in der Regulation der PD-L1-Expression zu spielen. So war die Erhöhung der PD-L1-Proteinexpression mit der Inaktivierung von GSK-3β durch Phosphorylierung der Aminosäure Serin 9 assoziiert. Der Einsatz eines spezifischen GSK-3-Inhibitors führte zu einem deutlichen Anstieg der PD-L1-Expression. Die bisherigen Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass weder der AKT- noch der mTOR-Signalweg für die beobachtete GSK-3β-Phosphorylierung verantwortlich ist. In folgenden Experimenten soll untersucht werden, ob die Kinasen PKA, PKC oder ERK an diesem Prozess beteiligt sind.
- Zum Nachweis der PD-L1-Expression auf CTCs von UCB-Patienten wurde mit Hilfe von PD-L1-positiven und -negativen UCB-Zelllinien ein Assay für das CellSearch®-System etabliert. Die Analyse von Patientenproben ergab einerseits Heterogenität der PD-L1-Expression zwischen unterschiedlichen UCB-Patienten und andererseits CTC-Subpopulationen mit unterschiedlicher Intensität der PD-L1-spezifischen Immunfluoreszenz innerhalb individueller Patienten.

Abschließend lässt sich schlussfolgern, dass die PD-L1-Expression im UCB in Abhängigkeit vom Zelltyp verschiedenen Regulationsmechanismen unterliegt und durch exogene Faktoren beeinflusst werden kann. Die Inaktivierung der Kinase GSK-3β scheint dabei eine entscheidende Bedeutung für die Modulation der PD-L1-Expression zu besitzen.
Der in der vorliegenden Arbeit etablierte Nachweis der PD-L1-Expression auf CTCs in Blutproben von UCB-Patienten steht für die klinische Anwendung zur Verfügung und sollte in zukünftige klinische Studien einbezogen werden. Hierbei sollte die CTC-PD-L1-Expression mit dem Ansprechen der Patienten auf Immun-Checkpoint-Therapien verglichen werden.
Zusammenfassend wurde in diesem Projekt mit einer Vielzahl von experimentellen in vitro-Modellsystemen die PD-L1-Expression im UCB untersucht, um zu einem besseren Verständnis sowohl ihrer Regulation und Funktion als auch der klinischen Bedeutung der CTC-PD-L1-Expression beizutragen.
Kurzfassung auf Englisch: Therapies with immune checkpoint inhibitors aim at blocking the negative regulation of T cell activation, thereby relieving the suppression of anti-tumor immunity. For urothelial carcinoma of the bladder (UCB), good clinical responses have been observed with anti-PD-1/PD-L1 antibodies, which are used to achieve recognition and elimination of tumor cells by the immune system.

The main results of the project can be summarized as follows:
- Western blot and qRT-PCR analyses of 13 UCB cell lines found PD-L1 expression to be associated with the molecular subtype of the cells. While all epithelial-like (EL) cell lines, which could be attributed to a basal subtype, showed PD-L1 expression, PD-L1 was not detectable in EL cell lines of a luminal subtype. Within the mesenchymal-like (ML) phenotype (“no subtype”), PD-L1-positive as well as PD-L1-negative cell lines could be identified.
- By stimulation with the immune-activating cytokine IFNγ, a substantial increase of PD-L1 transcript, as well as protein expression, could be observed in almost all cell lines. This was mediated mainly by the transcription factors STAT1 and IRF1.
- For the investigation of tumor cell-intrinsic functions of PD-L1, model systems based on different UCB cell lines, with either knockdown or overexpression of PD-L1, were generated. Cells with reduced PD-L1 expression showed attenuated proliferation rates, whereas cells with increased PD-L1 expression presented with enhanced proliferation rates. Transcriptome analysis of two PD-L1-overexpressing cell lines revealed only a few differentially expressed genes. One candidate gene that can be analyzed in following projects codes for the peptide hormone neurotensin.
- PD-L1 expression was detected in EL cell lines as well as in ML cell lines. Both PD-L1 knockdown and overexpression did not result in changes in the expression levels of EMT-indicating proteins.
- It was also investigated if factors that mediate EMT can influence the expression of PD-L1 a) by treatment of the cells with the EMT-inducing cytokine TGFβ, b) by knockdown of the transcription factor GRHL2, which is known as an EMT suppressor, and c) by overexpression of the EMT transcription factors ZEB1 and Slug. Therefore, two cell lines (5637, BFTC-905) which exhibit both epithelial and mesenchymal traits were chosen. Only in these two cell lines was PD-L1 transcription increased by TGFβ treatment. Up- or downregulation of individual EMT-influencing transcription factors caused changes in the expression levels of EMT-indicating proteins and/or transcripts, but not a substantial change in PD-L1 expression. TGFβ treatment of the 5637 and BFTC-905 cells that had undergone knockdown or overexpression led to a distinct upregulation of PD-L1 expression.
- In 5637 cells, the activity of the kinase GSK-3β seems to play a crucial role in regulation of PD-L1 expression. Thus, an increase in PD-L1 protein expression was associated with inactivation of GSK-3β by phosphorylation of amino acid serine 9. Application of a specific GSK-3 inhibitor generated a considerable PD-L1 upregulation. From preliminary results it can be deduced that neither the AKT nor the mTOR pathway are causative for GSK-3β phosphorylation in this instance. In following experiments it should be analyzed whether the kinases PKA, PKC or ERK are involved in this process.
- For detection of PD-L1 expression on CTCs of UCB patients, an assay for the CellSearch®-system was established using PD-L1-positive and -negative UCB cell lines. Analysis of patient samples revealed inter- and intra-patient heterogeneity of PD-L1-specific immunofluorescence.

It can be concluded that PD-L1 expression in UCB follows different cell type-dependent regulatory mechanisms and can furthermore be influenced by extrinsic factors. Moreover, the findings of this project indicate that inactivation of the kinase GSK-3β seems to play a crucial role for modulation of PD-L1 expression.
The robust assay for detection of PD-L1 expression on CTCs of UCB patients, which could be established in the current project, is readily available for clinical application and should be considered for implementation in future clinical trials. Here, CTC-PD-L1 expression should be related to response to therapy with immune checkpoint inhibitors.
In summary, this project addressed PD-L1 expression in UCB by implementing a number of in vitro approaches and experimental models with the aim of better elucidating its regulation and function as well as the clinical relevance of CTC-PD-L1 expression.

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