Molekulare Mechanismen und Funktion der durch die ADP-Ribosyltransferase ART2 vermittelten Apoptose muriner T-Zellen

Abstract

Die NAD-abhängige ADP-Ribosylierung ist - ähnlich der Phosphorylierung - eine posttranslationale Protein-Modifikation. Über diesen Mechanismus entfalten Cholera-, Pertussis- und andere bakterielle Toxine ihre pathogene Wirkung. Unsere Arbeitsgruppe hat toxinverwandte Mono-ADP-Ribosyltransferasen (ART1-ART5) bei Säugetieren kloniert, die als sezernierte oder GPI-verankerte Ektoenzyme exprimiert werden. Diese Arbeit konzentriert sich auf die murine ADP-Ribosyltransferase ART2, die von ruhenden T-Zellen auf der Zelloberfläche exprimiert wird und nach T-Zell Aktivierung von der Zelloberfläche abgestoßen werden kann. Die Inkubation von ART2-exprimierenden T-Zellen mit NAD, dem ART-Substrat, führt zur ADP-Ribosylierung wichtiger Membranproteine und kann die Apoptose der Zelle auslösen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die molekularen Mechanismen des NAD induzierten Zelltodes (NICD) untersucht. Durch vergleichende Untersuchungen von Wildtyp- und ART2 defizienten Mäusen und mit Hilfe von Blockade-Experimenten mittels monoklonaler Antikörper oder spezifischer Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass ART2 und der Purinozeptor P2X7 essentiell für die NAD-vermittelte Signaltransduktion sind. P2X7 ist ein ATP-gesteuerter nicht-selektiver Kationen-Kanal, der als Membranprotein die Cytoplasmamembran zweimal durchspannt. Es konnte gezeigt werden, dass durch ART2 katalysierte ADP-ribosylierung von P2X7 ein kovalent gebundener Ligand präpariert, und P2X7 hierdurch dauerhaft aktiviert wird. Mit Dosis-Wirkungs-Analysen konnte gezeigt werden, dass NAD (über die ART2-katalyiserte ADP-Ribosylierung) P2X7 bereits in 10-fach geringerer Konzentration aktivieren kann als der lösliche Ligand ATP. Pulse-Chase-Experimente zeigten, dass das Entfernen von ATP nach kurzen Inkubationen zur Deaktivierung von P2X7 führt. Kurze Inkubationen mit NAD hingegen führen durch ADP-Ribosylierung zur Bildung eines kovalent gebundenen Liganden, der auch nach Entfernen des NAD P2X7 dauerhaft aktiviert. ATP- und NAD-vermittelte Aktivierung von P2X7 führen zu klassischen Zeichen der T-Zell Apoptose: das nach außen Kehren des Membranlipids Phosphatidylserin von der Innenseite der Zytoplasmamembran auf die Außenseite, Schrumpfen der Zellen, Caspaseaktivierung, Zusammenbruch der mitochondrialen Membranintegrität und Fragmentierung der DNA. Mit Hilfe von Durchfluss-zytometrischen Echt-Zeit-Untersuchungen konnte aber gezeigt werden, dass anders als bei klassischen Apoptosewegen das nach außen Kehren des Phosphatidylserins bereits nach wenigen Sekunden induziert wird. Darüber hinaus wurden zwei Lymphomzelllinien identifiziert, die sich als Zellkulturmodelle für den NAD induzierten Zelltod eignen und nützliche Werkzeuge für weiterführende Untersuchungen darstellen. Es ist denkbar dass NAD und ATP aus lysierten oder beschädigten Zellen freigesetzt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Erythrozytenlysate ausreichende Mengen an NAD und auch ATP enthalten um P2X7 zu aktivierten. Durch vergleichende Untersuchungen von Wildtyp und ART2-defizienten T-Zellen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass NAD auch in höheren Verdünnungen der Lysate wirksam war, während nur stark konzentrierte Lysate ausreichende ATP Konzentrationen enthielten. Beide Nukleotide unterlagen in den Lysaten einer raschen Degradation. Es konnte ferner gezeigt werden, dass bereits bei der Präparation von T-Zellen aus Lymphknoten NAD, nicht aber ATP, in ausreichenden Mengen zur Aktivierung von P2X7 freigesetzt werden. Vergleichende Untersuchungen eingezüchteter Mausstämme zeigten, dass der Anteil „spontan“ apoptotischer Zellen in frischen T-Zell-Präparationen mit dem Expressionsniveau bzw. Genotyp von ART2 und P2X7 eng korreliert. Das übliche Schicksal apoptotischer Zellen in vivo ist die Entfernung durch Phagozyten – noch bevor das Todesprogramm vollständig abgelaufen ist. Dabei wird das nach außen Kehren von Phosphatidylserin als ein „friß mich“-Signal für Makrophagen gewertet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass T-Zellen nach Aktivierung von P2X7 durch NAD oder ATP durch Peritonealmakrophagen tatsächlich innerhalb von einer Stunde phagozytiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Vorstellung, dass der NAD induzierte Zelltod ein Mechanismus für die Eliminierung von naiven T-Zellen in Situationen von Gewebeverletzungen oder in Entzündungsherden sein könnte. Bereits aktivierte T-Zellen, die ART2 von der Oberfläche abgestoßen haben, sind resistent gegenüber extrazellulärem NAD, während potentiell autoreaktive Bystanderzellen ART2 auf der Zelloberfläche tragen und somit eliminiert werden können.