Kultur und Transplantation von Rattenhepatozyten unter Verwendung eines Fibringel als Matrix

Abstract

Einleitung: Zelltransplantation und Tissue Engineering der Leberzelle werden in aktuellen Studien und Experimenten zur Therapie für bestimmte Lebererkrankungen erforscht. In dieser Arbeit haben wir zwei Versuche durchgeführt. Zum einen haben wir untersucht, in wieweit eine Fibringel Matrix zur Hepatozytentransplantation verwendet werden kann. Zum anderen haben wir im Rattenmodell eine Methode zur Hepatozytentransplantation durch eine Fibrinmatrix evaluiert. Material und Methoden: Es wurden Hepatozyten mittels einer Kollagenase Verdauungstechnik aus männlichen Lewis-Ratten isoliert. Die Fibringel Matrix wurde mit Hilfe der Komponenten Fibrinogen und Thrombin hergestellt. Die isolierten Hepatozyten wurden in einem Tropfen der Matrix auf Plastikkulturplatten in einem Medium mit EGF und Insulin gehalten. Die Zellzahlen wurden mit Hilfe einer DNA Verdünnungsreihe berechnet. Die Hepatozytendifferenzierung ist unter Anwendung der RT-PCR und der Immunhistologie von CK-18 und Albumin kontrolliert worden. Im Transplantationsmodell sind die Hepatozyten zur Detektion mit dem Marker PKH26 inkubiert und unter die Leberkapsel und in das Parenchym der Empfängerlebern injiiziert worden. Die Auswertung des Neogewebes erfolgte mikroskopisch durch ein Fluoreszenzfiltersystem und in der Histologie mit den Marken CK-18, ED-1 und Desmin. Ergebnisse: Die Hepatozytenkultur in der Fibrinmatrix ermöglichte eine stabile Zellzahl und eine dreidimensionale Neogewebeformation. Mit der RT-PCR und der Immunhistologie liessen sich die Vitalitätsmarker wie CK-18 und Albumin nachweisen. Die transplantierten Zellen konnten eindeutig nach 2 und 7 Tagen in der Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden. CK-18 und Desmin liessen auf eine Integration von Hepatozyten und Sternzellen in die Empfängerleber schliessen. Diskussion: Die Fibringel Matrix stellt eine geeignete Umgebung für die Hepatozytenkultur dar. Die direkte intrahepatische Injektion von Hepatozyten in eine Matrix aus Fibringel ist technisch durchführbar. Wir schlussfolgern, dass Fibringel eine entwicklungsfähige Matrix für das Tissue Engineering der Leber darstellt.

Cell transplantation and tissue engineering with liver cells are currently under investigation as experimental therapies for certain liver diseases. In this study we evaluated a fibrin-based gel matrix as carrier for hepatocytes in culture. Furthermore, a novel technique for direct intrahepatic injection of fibrin gel-immobilized hepatocytes was developed and evaluated in a rat model. Hepatocytes were harvested from rats. Fibrin matrix was generated with modified fibrin sealant. Cells, in medium containing epidermal growth factor and insulin, were seeded in a drop of fibrin matrix onto plastic culture dishes. Cell numbers were assessed by DNA content. Hepatocyte differentiation was evaluated by reverse transcription-polymerase chain reation (RT-PCR) and immunhistology (IH) for cytokeratin (CK-18) and albumin. PKH26-labeled fibrin gel-immobilized hepatocytes were transplanted into liver by direct injection underneath the capsule. Fluorescence microscopy of explanted liver was performed to identify PKH26+ donor cells. Neotissue was characterized by IH for the markers CK-18 and albumin in vitro. Transplanted cells were identified by fluorescense microscopy after 2 and 7 days. CK-18 and desmin staining showed integration of hepatocytes in culture. Direct intrahepatic injection of fibrin gel-immobilized hepatocytes is technically feasible. We conclude that fibrin gel immobilization is an attractive tool for the development of tissue engineering-based liver support systems.