Aufbau und Untersuchung modifizierter Neuraminsäuredonoren zur regio- und stereoselektiven Sialylierung durch Trans-Sialidase (Trypanosoma cruzi)

Abstract

Trans-Sialidase ist ein membrangebundenes Enzym, das zur Superfamilie der Sialidasen gehört und in vivo für die Übertragung von Neu5Ac verantwortlich ist. Auf Grund ihrer Regio- und Stereospezifität stellt sie eine interessante Alternative zur chemischen Synthese sialylierter Oligosaccharide dar. Diese Eigenschaft wurde im Rahmen dieser Arbeit als Teil einer Kooperation mit dem Massachusetts Institute of Technology (Department of Brain & Cognitive Sciences) zur chemoenzymatischen Synthese von Sialylallolactose genutzt. Die enzymatische Übertragung von Neu5Ac gelang in einer Ausbeute von 87 %. Des Weiteren gelang es, verschiedene Neuraminsäurederivate darzustellen und als pNP-Glycoside für die enzymatische Umsetzung mit Trans-Sialidase aus T.c. zu aktivieren. Unter anderem gelang es, die biologisch sehr relevante Glycolylneuraminsäure auf diese Weise in einer Ausbeute von 60 % auf Allolactose als Akzeptor zu übertragen. Neu5Prop wurde in einer Ausbeute von 32 % transglycosyliert. Im Vergleich mit Neu5Gc stellt dieser Befund ein interessantes Ergebnis dar. Der vergleichbare Raumanspruch der Acylkomponenten der Neuraminsäure würde einen solchen Unterschied nicht rechtfertigen. Hier spielt die zusätzliche OH-Gruppe eine wesentliche Rolle. Anzunehmen ist eine höhere Affinität durch Stabilisierung über Wasserstoffbrücken durch Asp96, das bei Neu5Ac für die Fixierung des amidischen Stickstoffes in der Bindungstasche der Trans-Sialidase verantwortlich ist. Derivatisierungen durch 9-O-Acylierung zeigten kaum Auswirkungen auf die erhaltenen Ausbeuten. So konnte Neu5Ac9But in einer Ausbeute von 78 % auf Allolactose übertragen werden. Die Ausbeuten spiegeln damit die Erwartungen wieder, die sich aus der Betrachtung der Kristallstrukturen von Trans-Sialidase aus T.c. ergeben. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen somit die Nützlichkeit der Trans-Sialidase in der Darstellung sialylierter Oligosaccharide, insbesondere einiger nichtnatürlicher Derivate der Neuraminsäure. Zusätzlich können Rückschlüsse gezogen werden, die weitere Ansätze für das Design von Inhibitoren der Trans-Sialidase bieten. Zu nennen ist hier vor allem der Befund der besseren Übertragbarkeit von Neu5Gc gegenüber Neu5Prop, der Hinweis auf einen nicht unerheblichen Einfluss von Asp96 ist.

Die Modifizierung der NMR-Verfolgung der enzymatischen Übertragung von Neu5Ac ermöglicht es Messpunkte in sehr kurzen zeitlichen Abständen zu nehmen, die sich dann in ihrer Zusammensetzung nicht mehr verändern. Dies ermöglicht weitere Untersuchungen, zum Beispiel die Bestimmung von Regioisomeren mit Hilfe von 2D-Experimenten. Zusätzlich ist die Zahl der „Scans“ nicht beschränkt und es können daher sehr viel geringere Konzentrationen mit einem geringeren Fehler in den Integralen detektiert werden. Der geringere Fehler wird vor allem im Vergleich mit bei Reaktionsverfolgungen ebenfalls eingesetzten HPLC-Untersuchungen deutlich. Diese weisen einen sehr viel größeren Fehler auf und sind mit einem deutlich höheren Zeitaufwand verbunden.

Trans sialidase is a membrane-bound enzyme which belongs to the super family of sialidases and is, in vivo, responsible for the transfer of Neu5Ac. Because of its regio- and stereospecificity it presents an interesting alternative to the chemical synthesis of sialylated oligosaccharides. This characteristic was used here, in cooperation with the Massachusetts Institute of Technology (Department of Brain & Cognitive Sciences), in order to chemo-enzymatically synthesise sialylallolactose. In this case, the enzymatic transfer of Neu5Ac succeeded with a 87 % yield. Additionally, various neuraminic acid derivates were synthesised and activated as pNP-glycosides for the enzymatic transformation with trans sialidase of T.c. Furthermore, the biologically highly relevant glycolyl neuraminic acid was successfully transferred with a 60 % yield onto the acceptor allolactose. Neu5Prop was transglycosylated with a yield of 32 %. The difference to the respective results of Neu5Gc is significant. The respective steric demand of the acyl components of the neuraminic acid does not explain this difference. Apparently, the additional OH group is of importance. A higher affinity due to the stabilisation by hydrogen bounds via Asp96 is likely, which is responsible for the fixation of amidic nitrogen in the binding pocket of the trans sialidase. The resulting yields hardly differed when derivates of 9-O-acylation were tested. This way, Neu5Ac9But could be transferred onto allolactose in 78 % yield. The expectations of yield raised by the observation of crystalline trans sialidase of T.c. could be satisfied. Therefore, the conclusion of this study confirm the importance of trans sialidase in the synthesis of sialylated oligosaccharides, especially of certain unnatural derivates. Moreover, inferences about the further design of inhibitors of trans sialidase can be made. Especially the higher transfer of Neu5Gc in comparison to Neu5Prop is significant, as it indicates the relevance of Asp96. The modification of kinetic NMR studies of the enzymatic transfer of Neu5Gc enables measurements within short intervals and constant sample composition. This enables further investigations, e.g. determination of regioisomers with the use of 2D experiments. Additionally, the number of scans is not limited and therefore much smaller concentrations can be detected with reduced errors for integration.