Die Vitamin B6-Biosynthese von Plasmodium falciparum-Interaktion von PfPdx1 und PfPdx2

Abstract

Vitamin B6 in seiner aktiven Form, Pyridoxalphosphat (PLP), stellt einen essentiellen Cofaktor für viele Enzyme dar. Der Mensch ist auf die Aufnahme des Vitamins aus der Nahrung angewiesen, wohingegen Pilze, Pflanzen und Bakterien sowie der Malariaparasit Plasmodium falciparum über eine Vitamin B6 de novo-Synthese verfügen. Diese erfolgt bei P. falciparum über den DOXP (1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat) -unabhängigen Biosyntheseweg, bei dem die beiden Enzyme PfPdx1 und PfPdx2 einen Enzymkomplex bilden und den aktiven Cofaktor PLP herstellen. Dieser Komplex besteht aus zwölf Pdx1-Molekülen, die zwei hexamere Ringe formen, welche zu einer „Doppelkrone“ zusammengefügt sind. An diese binden zwölf Pdx2-Moleküle. Zur Analyse der Bildung des PfPdx1-PfPdx2-Komplexes wurden durch Site-directed-mutagenesis-PCR verschiedene Aminosäuren im PfPdx1-Enzym gegen Alanin ausgetauscht und die Mutanten bezüglich ihrer Aktivität und der Bindungsfähigkeit von PfPdx2 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren R85, H88 und E91 bei der Bindung verschiedener PfPdx1-Moleküle untereinander von Bedeutung sind, da die Mutanten als Monomere vorlagen und kein PfPdx2 mehr binden konnten. Für die Aminosäuren D26, K83 und K151 konnte eine Beteiligung am aktiven Zentrum gezeigt werden. Ihr Austausch führte zur Inaktivität von Pf Pdx1, die Bindung von PfPdx2 wurde jedoch nicht beeinflusst. Der Aminosäure K151 kommt neben der Beteiligung am aktiven Zentrum eine Schlüsselrolle bei der Formation des PfPdx1-Komplexes zu, da ihr Austausch gegen Alanin zur Destabilisierung des Dodecamers in zwei hexamere Ringe führt. Derselbe Effekt konnte durch Austausch der Aminosäure G155 gegen Alanin erzielt werden. Dies zeigt, dass die Flexibilität dieser Region für die Bildung des PfPdx1-Dodecamers von entscheidender Bedeutung ist. Durch diese Mutationsanalysen konnte die Reihenfolge der Zusammenlagerung des Vitamin B6-Biosynthesekomplexes bestimmt werden, bei dem das PfPdx1-Enzym zunächst hexamere Ringe bildet, an die dann die PfPdx2-Enzyme binden. Anschließend lagern sich zwei der PfPdx2-dekorierten hexameren PfPdx1-Ringe zum endgültigen und aktiven PLP-Synthase-Komplex zusammen. Zur Untersuchung der Überexpression von PfPdx1 oder PfPdx2, bzw. PfPdx1 und PfPdx2 in vivo wurden Plasmodien mit Überexpressionskonstrukten für beide Proteine transfiziert. Western-Blot-Analysen zeigten im Plasmodienextrakt der transgenen Zelllinien tag-tragende Proteine, die von den Parasiten episomal überexprimiert wurden. Die Überexpression hatte keinen Einfluss auf das Wachstum der Parasiten. Bei Pilzen und Pflanzen wurde gezeigt, dass die Vitamin B6-Biosynthese mit oxidativem Stress in Form von Singulettsauerstoff (1O2) korreliert. Die Transkriptmenge von PfPdx1 wurde nach Behandlung der Zellen mit verschiedenen Singulettsauerstoff-produzierenden Molekülen mittels Northern-Blot und Microarray-Analyse untersucht. Es zeigte sich eine Hochregulation der Vitamin B6-Biosynthese unter erhöhtem Singulettsauerstoff-Stress, was eine duale Rolle der Vitamin B6-Biosynthese als Lieferant eines für viele Enzyme essentiellen Cofaktors sowie als Reaktionsmechanismus auf erhöhten oxidativen Stress zeigt. Um das Gleichgewicht zwischen dem aktiven Cofaktor PLP und inaktiven Vorläufer-Molekülen zu regulieren, benötigt der Parasit ein Enzym, das in der Lage ist, PLP zu dephosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte bei P. falciparum eine Paranitrophenylphosphat-Phosphatase (PfPNPase) identifiziert und mittels GFP-Fusionsproteinen im Cytosol lokalisiert werden. Die PfPNPase besitzt ein breites Substratspektrum, das neben diversen anderen phosphorylierten Molekülen auch PLP einschließt. Dem Enzym könnte somit eine wichtige Funktion bei der Regulation des „Pools“ von aktivem und inaktivem Vitamin B6 und anderen Metaboliten des Zellstoffwechsels zukommen.

The active form of vitamin B6 is pyridoxal 5-phosphate (PLP), which is an essential cofactor of a variety of different enzymes. Humans depend on the uptake of B6 vitamers from their diet, whereas fungi, plants and bacteria, as well as the malaria parasite Plasmodium falciparum possess a vitamin B6 biosynthesis. In the DOXP (1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate) -independent pathway, PLP is de novo synthesised by a complex consisting of two enzymes, Pdx1 and Pdx2. In the PLP synthase complex twelve Pdx1-proteins form two hexameric rings and assemble into a “double crown”, which is decorated by twelve Pdx2-enzymes. The mode of assembly of the plasmodial PLP synthase complex was investigated by site directed mutagenesis. Various amino acid residues were exchanged to alanine and the resulting mutant proteins were analysed for their activity and ability to bind the Pdx2-protein. Thereby the amino acid residues R85, H88 and E91 were found to be essential for Pdx1 binding. The respective Pdx1-mutants form monomers which were unable to bind Pdx2-proteins. Substitution of the amino acid residues D26, K83 and K151 resulted in loss of enzyme activity, emphasising their participation in active site formation. However, binding of the Pdx2-protein was not affected. Further verification of the individual mutants clearly demonstrated a crucial role of K151 in the assembly of the Pdx1 “double crown”. Mutation of K151 destabilised the dodecameric formation of the enzyme complex, which dissociated into two hexameric rings. The same result was obtained with the G155A mutant, indicating the importance of this region for the formation of the Pdx1 dodecamer. Taken together, the mutagenic analyses of the Pdx1 enzyme suggest a possible order of assembly of the PLP synthase complex. Hexameric rings of Pdx1 are probably formed first, which are subsequently decorated by the Pdx2-proteins. Finally, two of these rings assemble into the active PLP synthase complex. To investigate the role of Pdx1 and/or Pdx2 in vivo, P. falciparum was transfected with constructs leading to an overexpression of both proteins. Western blot analyses of derived cell-lines clearly showed the presence of the respective recombinant proteins. However, overexpression of Pdx1 and/or Pdx2 did not influence growth of the transgenic parasites. In plants and fungi, vitamin B6 biosynthesis is regulated by oxidative stress caused by singlet oxygen (1O2). Therefore, malaria parasites were treated with different singlet oxygen producing molecules and the quantity of the pdx1 mRNA was subsequently examined by northern blot and microarray analyses. Indeed, the transcription of pdx1 was found to be up-regulated under elevated singlet oxygen levels. These results emphasise a dual role of the vitamin B6 biosynthesis in P. falciparum: i) provision of the cofactor and ii) detoxification of singlet oxygen. To regulate the intracellular vitamin B6 level, an interconversion of de novo synthesised PLP and salvaged pyridoxal is required. In P. falciparum a protein with homology to paranitrophenylphosphate phosphatases was identified. This PfPNPase was localized in the parasites cytosol by fluorescence microscopy using GFP fusion proteins. Analysis of the biochemical properties of the PfPNPase revealed a broad substrate profile, which includes PLP. Therefore, the enzyme is proposed to regulate the crucial vitamin B6 homeostasis in the human malaria parasite P. falciparum.