Charakterisierung der Ubiquitinligase RNF6 als lokalen Regulator in der Mitose proliferierender Zellen des Menschen (Homo sapiens Linnaeus, 1758) und der Maus (Mus musculus Linnaeus, 1758)

Abstract

Die Vertebraten spezifische Familie der RLIM ähnlichen Ubiquitinligasen umfasst die beiden paralogen RING-Finger Proteine RLIM (RING-finger LIM-domain binding protein) und RNF6. Beide Proteine sind während der Embryogenese im Nervengewebe hochexprimiert, wo sie eine wichtige Rolle bei der Neurogenese spielen. Im Zellkern ist RLIM an der Transkriptionsregulation beteiligt. Hier vermittelt RLIM den proteasomalen Abbau verschiedener Proteine, die am Aufbau LIM-Domänen assoziierter Proteinkomplexe beteiligt sind, wie den nukleären LIM-only Proteinen (LMO) und den Kofaktoren der LIM-Proteine (CLIM/Ldb). Im Gegensatz dazu stabilisiert RNF6 Aktinfilamente im Cytoplasma. Hierbei verhindert RNF6 die Inaktivierung der Aktinfilamentdepolymerase Cofilin durch die Polyubiquitinierung der LIM-Kinasen (LIMK), die die Cofilinaktivtät über Phosphorylierung hemmen. In dieser Arbeit konnte RNF6 als mitotische Ubiquitinligase in proliferierenden Säugetierzelllinien identifiziert werden. Innerhalb der Mitose zeigt RNF6 eine dynamische Lokalisation an distinkten mitotischen Strukturen. In der frühen Mitose lokalisiert RNF6 an den Centrosomen, den Spindelpolen und den Spindelfasern, während RNF6 in der späten Mitose an der Mittelzone und dem Mittelkörper lokalisiert. Die Überexpression von RNF6 induziert die Aggresomenbildung, stört die Morphologie des Zellkerns und führt zur Ausbildung binukleärer Zellen. In mitotischen Zellen führt die ektopische Expression von RNF6 und RNF6-Deletionsmutanten zu einer Chromosomenfehlverteilung und zu einer Störung der Morphologie des Spindelapparats. Die mitotische Lokalisation und die Überexpressionsphänotypen von RNF6 weisen auf eine Funktion von RNF6 bei der Spindelassemblierung, der Chromosomensegregation und der Cytokinese hin. Einen ersten Einblick in die mitotische RNF6-Funktion lieferte die Identifikation der Kinesin-13 Familie der MCAK/KIF2 Proteine (mitotic centromere associated kinesin/kinesin family member 2) als RNF6-Interaktoren. Bei diesen Kinesinen handelt es sich um eine Familie von Mikrotubulidepolymerasen, die die Mikrotubulidynamik in mitotischen Zellen regulieren. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Spindelassemblierung und der Chromosomensegregation. Es konnte gezeigt werden, dass RNF6 an die MCAK/KIF2-Proteine bindet. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass das MCAK/KIF2-Protein KIF2a über das Ubiquitin-Proteasom- System reguliert und durch RNF6 polyubiquitiniert wird. Die mitotische Lokalisation, die Effekte der ektopischen RNF6-Expression sowie die Identifikation der MCAK/KIF2-Proteine als potentielle RNF6-Substrate weisen daraufhin, dass RNF6 nicht nur an der Regulation der Aktindynamik, sondern auch an der Regulation der Mikrotubulidynamik beteiligt ist. Darüber hinaus deutet die Charakterisierung von RNF6 als mitotisches Protein zusammen mit den beobachteten mitotischen Defekten auf eine mögliche Funktion als Onkogen in Folge einer Fehlregulation hin. Zusätzlich weist die neuronale Funktion und die Neigung zur Aggresomenbildung auf eine mögliche Beteiligung von RNF6 an der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen hin.

The vertebrate-specific family of RLIM-like ubiquitin ligases comprises two paralogous RING-finger proteins, namely RLIM (RING-finger LIM domain binding protein) and RNF6. Both proteins are highly expressed in neuronal tissues during embryogenesis where they play important roles during neurogenesis. In the nucleus, RLIM is involved in the regulation of transcription by targeting various proteins that participate in LIM domain-associated protein complexes for proteasomal degradation including nuclear LIM-only proteins (LMO) and cofactors of LIM-Proteins (CLIM/Ldb). In contrast, RNF6 stabilizes actin filaments in the cytoplasma by preventing the inactivation of the actin filament depolymerase cofilin through the poly-ubiquitination of LIM-kinases (LIMK) which inhibits cofilin activity by phosphorylation. In this study, RNF6 was identified as a mitotic ubiquitin ligase in proliferating mammalian cell lines. During mitosis RNF6 shows a dynamic localization at distinct mitotic structures. In early mitosis RNF6 localizes at centrosomes, spindle poles, and spindle fibers, whereas in late mitosis RNF6 localizes at the midzone and the midbody. The overexpression of RNF6 induces aggresome formation, perturbs the morphology of the nucleus, and leads to formation of binucleated cells. In mitotic cells the ectopic expression of RNF6 and deletion mutants of RNF6 induces chromosome missegregation and distort the morphology of the spindle apparatus. The mitotic localization and the overexpression phenotypes of RNF6 point at a function of RNF6 in spindle assembly, chromosome segregation, and cytokinesis. A first insight into the mitotic function of RNF6 was obtained by the identification of the kinesin-13 family of MCAK/KIF2 proteins (mitotic centromere associated kinesin/kinesin family member 2) as interactors of RNF6. These kinesins represent a family of microtubule depolymerases, which regulate microtubule dynamics in mitotic cells. They play a role in spindle assembly and chromosome segregation. It could be shown that RNF6 binds to MCAK/KIF2 proteins. Furthermore, it could be demonstrated that the MCAK/KIF2 protein KIF2a is regulated by the ubiquitin-proteasome system and that RNF6 poly-ubiquitinates KIF2a. The mitotic localization, the effects of the ectopic expression of RNF6 as well as the identification of the MCAK/KIF2 proteins as potential RNF6 substrates indicate that RNF6 not only regulates the actin dynamics, but is also involved in the regulation of the microtubule dynamics. In addition, the characterization of RNF6 as mitotic protein in combination with the observed mitotic defects suggests an oncogenic role of RNF6 in case of misregulation. Moreover, the neuronal function of RNF6 and the capacity to induce aggresomes when overexpressed hints at a potential role of RNF6 in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.