Etablierung eines experimentellen Modells zur funktionellen Charakterisierung von genetischen Varianten des Progesteronrezeptors

Abstract

Kodierende Einzelnukleotidpolymorphismen können die Funktion eines Proteins beeinflussen und stellen dann oft vererbbare Risikofaktoren für die verschiedensten Erkrankungen dar. Insbesondere in Genen, deren Produkte an zellzyklusregulierenden Prozessen beteiligt sind, können sie auch zu proliferativen Erkrankungen prädisponieren. Der Progesteronrezeptor ist ein Beispiel eines zellzyklusregulierenden Proteins, in dessen Gen seit längerem Einzelnukleotidpolymorphismen bekannt sind, die mit einer intronischen Alu-Insertion gekoppelt sind. Bis heute ist unklar, ob diese zwei Varianten zu Funktionsunterschieden des Proteins führen und wenn ja, in welchem Ausmaß. Die Funktion des Rezeptors und die Tatsache, dass zwei von drei zum Haplotyp gehörigen Einzelnukleotidpolymorphismen die Aminosäuresequenz ändern, legt die Vermutung nahe, dass dieser Haplotyp zu Erkrankungen der weiblichen Reproduktionsorgane prädisponieren könnte. Klinische Studien konnten bisher keine eindeutige Antwort auf diese Frage liefern, auch wenn ein Einfluss auf Inzidenz und Schwere des Ovarialkarzinoms und insbesondere der Endometriose und habituellen Aborten wahrscheinlich ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, ein experimentelles System zu etablieren, mit dem die durch die kodierenden Einzelnukleotidpolymorphismen entstehenden unterschiedlichen Varianten des Progesteronrezeptors funktionell charakterisiert werden können. Im Vordergrund steht die Beantwortung der Frage, ob die verschiedenen Varianten des Progesteronrezeptors die Genexpression von Zielgenen in quantitativ oder qualitativ unterschiedlicher Weise beeinflussen. Darüber hinaus sollte das etablierte System zugleich zur Klärung von mechanistischen Detailfragen dienen können. Zu diesem Zweck wurde für die zelluläre Überexpression beider bekannten Isoformen des Progesteronrezeptors A und B mit jeweils einem von beiden Einzelnukleotidpolymorphismen oder der Kombination beider Varianten jeweils ein Adenovirus generiert. Diese insgesamt acht Adenoviren enthalten die verschiedenen cDNA-Varianten hinter einem ubiquitär aktiven CMV-Promotor, der die Überexpression der Rezeptoren in einer Vielzahl von Geweben ermöglicht. Zusätzlich wird bicistronisch ein grün fluoreszierenden Protein exprimiert, was die erfolgreiche Transduktion von Zellen fluoreszenzmikroskopisch sichtbar macht.

Da die Überexpressionsexperimente mit den Varianten des Rezeptors ohne Interferenz mit endogen vorhandenen Progesteronrezeptoren durchgeführt werden sollten, waren Zellen vonnöten, die diesen endogen nicht exprimieren. Daher wurde für die adenovirale Überexpression der Rezeptorvarianten die Mammakarzinom-Zelllinie T47D-Y gewählt. Als kritisch stellte sich heraus, das Expressionsniveau der acht Varianten exakt anzugleichen, da zu erwarten ist, dass mögliche Unterschiede in der Funktion der Varianten sich als quantitativ gering erweisen. Dadurch könnten bereits leichte Abweichungen des Rezeptor-Expressionsniveaus zu falsch positiven Ergebnissen bei der mRNA-Quantifikation PGR-regulierter Gene führen. Daher wurden die Viren in ihrer Konzentration gründlich titriert, Zielparameter war dabei zunächst die im Western-Blot gemessene Konzentration der Progesteronrezeptoren, die später per EIA erneut überprüft und angeglichen wurde. Zusätzlich wurden die Hormonbindungseigenschaften der Varianten durch Radioligandenbindungsexperimente untereinander verglichen. Für die eigentlich Kernfrage nach dem Effekt auf die Genexpression wurden quantitative rt-PCR-Reaktionen für die Messung der mRNA-Konzentration von 10 Genen optimiert, die bekanntermaßen unter besonders starker Transaktivierungs-, beziehungsweise -repressionsaktivität des Rezeptors stehen. Der systematische Vergleich von mRNA-Konzentration, regulatorischer Aktivität, Protein-Konzentration und Hormonbindung lässt in Zukunft Aussagen über die mRNA-Stabilität und die Affinität und Bindungskapazität der Varianten zu. Das nun etablierte System zur funktionellen Charakterisierung von genetischen Varianten des Progesteronrezeptors wird in Zukunft hoffentlich dazu beitragen können, die Frage zu klären, ob tatsächlich funktionelle Unterschiede bestehen, welcher Mechanismus diesen Funktionsunterschieden der Varianten zugrunde liegt und ob mit einer klinischen Relevanz dieser Variabilität zu rechnen ist.