Software Development for High-throughput Biological Small Angle X-ray Scattering

Abstract

Small angle X-ray scattering (SAXS) is a fundamental tool in the study of biological macromolecules providing low resolution information on the shape, conformation, assembly state and folding/unfolding of macromolecules in solution. The possibility to rapidly study the structure of proteins, nucleic acids and their complexes in near physiological environments makes SAXS very important for structural biology, despite the limited resolution range. Recent advances in robotic microliter fluid handling make it possible to perform automated high throughput experiments including fast screening of solution conditions, structural responses to ligand binding, changes in temperature and chemical modifications. However, in order to make automated experiments a routine tool suitable for large scale structural studies, several significant bottlenecks must be overcome. Among the most critical ones are the issues of reliability of the experiment, automation of data analysis, control of the data quality and convenient storage of the obtained results. The present study addresses acute problems in the automation of modern SAXS experiments and in the methods for rapid data processing, analysis and storage. A new visualization hardware setup was designed for the automated control of the sample cell filling, coupled with an image recognition program to detect and correct for improper filling. Software was developed and implemented to assess the quality of the scattering data and automatically compute a classical SAXS parameter, the radius of gyration. A pipeline that integrates multiple software modules, both existing and newly developed, was implemented to make data processing possible without user intervention. The pipeline includes: intelligent background subtraction, analysis of concentration effects, calculation of overall parameters and characteristic functions, low resolution ab initio shape reconstruction and the use of a SAXS patterns database. A cross-validation of the intermediate results ensures a robust reproducible outcome which is stored in a user-friendly web-compatible XML format. The data analysis pipeline allows introduction of further decision making blocks and extensive use of a priori information, paving the way for development of an intelligent expert system for SAXS-based model building. The developed hardware and software was implemented at the beamline X33 of EMBL Hamburg and, in combination with the two robotic sample changers, improved dramatically the reliability, throughput and user friendliness of the beamline, ensuring its fully automated operation. The automated setup was successfully utilized by over 200 user groups in 2008-2009. The applications of these methods are illustrated in this work in several collaborative user projects on different macromolecular systems.

Röntgenkleinwinkelstreuung (small angle X-ray scattering, SAXS) ist ein fundamentelles Werkzeug zur Untersuchung biologischer Makromoleküle in Lösung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Form, Konformation, des Aufbaus und der Faltung/Entfaltung von Makromolekülen bei niedriger Auflösung. Trotz der begrenzten Auflösung sind SAXS Studien im Bereich der Strukturbiologie essentiell, da sie strukturelle Informationen über Proteine, Nukleinsäuren und deren Komplexe unter annähernd physiologischen Bedingungen liefern. Neueste Fortschritte im Gebiet der automatisierten Handhabung von Flüssigkeiten im Milliliter Bereich ermöglichen heute die Durchführung von Hochdurchsatzexperimenten wie die schnelle Untersuchung von Lösungmittelsbedingungen, die strukturellen Auswirkungen der Bindung von Liganden, Temperaturveränderungen, chemische Modifikationen, etc.. Allerdings ist die routinemäßige Anwendung automatisierter Experimente im großen Maßstab in der Strukturbiologie bis heute nur eingeschränkt möglich. Am kritischsten in diesem Zusammenhang sind Grenzen in der experimentellen Verlässlichkeit, bei der automatischen Datenanalyse sowie der kontrollierten Datenqualität und bei der Datenspeicherung. In der hier vorgelegten Arbeit werden Lösungen für diese Schwierigkeiten bei der Automatisierung moderner SAXS Experimente erarbeitet und Methoden für eine schnelle Datenverarbeitung, -analyse und -speicherung entwickelt. Für die automatische Kontrolle der Probenkammerbefüllung wurde ein neues Visualisierungssystem entworfen, das mit einem Bilderkennungsprogramm zur Erkennung und Korrektur fehlerhafter Kammerbefüllung gekoppelt ist. Zudem wurde ein Computerprogramm zur automatischen Berechnung klassischer SAXS Parameter wie z.B. des Trägheitsradius (radius of gyration, Rg) entwickelt und etabliert. Dieses Programm wurde so gestaltet, dass zusätzlich automatisch eine Einschätzung der Datenqualität erfolgt. Um eine Datenverarbeitung ohne manuelle Eingriffe der Anwender zu ermöglichen wurde eine Programm-Pipeline eingeführt, die mehrere neu entwickelte und bereits bestehende Programmmodule in sich vereinigt. Diese Pipeline beinhaltet eine kontrollierte Subtraktion von Hintergrundstreuung, eine Analyse von Konzentrationseffekten sowie die Berechnung von allgemeinen Parametern und charakteristischen Funktionen. Zudem ermöglicht diese Pipeline die Rekonstruktion der ab initio Form des zu untersuchenden Moleküls bei niedriger Auflösung und den Gebrauch einer SAXS Musterdatenbank. Eine Vergleichsprüfung der Zwischenergebnisse stellt robuste, reproduzierbare Resultate sicher, die in einem anwenderfreundlichen webkompatiblen XML Format gestaltet sind. Der Abschnitt der Pipeline, der für die Datenanalyse zuständig ist, erlaubt die Einführung weiterer Entscheidungsblöcke und die intensive Nutzung von a priori Informationen. Diese Ergebnisse schaffen die Grundlage für die weitere Entwicklung eines intelligenten Expertensystems für das SAXS-basierte Modellieren von Strukturen. Die entwickelten Systeme und Programme wurden in die Beamline X33 des EMBL Hamburg integriert. Dies erhöhte in Kombination mit zwei automatischen Probenaustauschsystemen drastisch die Zuverlässigkeit, den Probenumsatz und die Anwenderfreundlichkeit der Beamline und ermöglichte erstmals eine vollautomatische Bedienung. Das automatisierte System wurde bereits von über 200 Nutzergruppen in einem Zeitraum von 2008-2009 erfolgreich genutzt. In dieser Arbeit wird die Anwendung der automatisierten Methoden beispielhaft an verschiedenen Makromolekülsystemen aus mehreren Kooperationen mit Nutzerprojekten illustriert.