Bedeutung von Rad51 für Reparatur Replikationsassoziierter DNA-Schäden in humanen Tumorzellen

Abstract

Die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist das fundamentale Ziel der Zelle. Dabei ist eine fehlerfreie DNA-Replikation in jedem Zellzyklus von größter Bedeutung. Trifft ein Replikationsapparat auf einen DNA-Doppelstrangbruch, bewirkt dies, dass die Homologe Rekombination mit seinem zentralen Protein Rad51 als der Hauptreparaturmechansimus aktiv wird. Der DNA-Schaden wird dabei von sogenannten Sensorproteinen erkannt, die wiederum Zellzykluskontrollproteine aktivieren und zu einem Anhalten der S-Phase führen. Weitere Initiationsereignisse der Replikation werden unterdrückt, Reparaturprozesse in Gang gesetzt und der Schaden behoben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, wie sich ionisierende Strahlen und die durch Bestrahlung erzeugten DNA-Schäden auf den Replikationsapparat, die Aktivierung des Intra-S-Phase-Kontrollproteins Chk1 und ihren Folgen für die genomische Instabilität auswirken. Es sollte der spezifische Effekt von Basenschäden, Einzelstrangbrüchen, DNA-DNA-Quervernetzungen, sowie zweiseitigen und einseitigen Doppelstrangbrüchen untersucht werden, um dies dann mit dem Schadensspektrum der ionisierenden Strahlen zu vergleichen. Von besonderem Interesse war es zu überprüfen, ob eine Hochregulation von Rad51, zu einer veränderten Antwort der Replikationsprozesse und der genomischen Stabilität nach DNA-Schädigung führt. Die Experimente wurden mit U2OS-Zellen durchgeführt, in denen durch Transfektion des Rad51-Gens eine transiente Überexpression von Rad51 durch einen hormoninduzierbaren Promoter erzielt werden konnte (Maacke et al., 2000). Als Kontrolle dienten U2OS-Zellen, bei denen keine Hormoninduktion durchgeführt wurde. Die Auswirkungen der verschiedenen DNA-Schäden wurden im DNA Fibre Assay, im Western-Blot, an γH2AX-FOCI und Chromosomaberrationen sowie im Koloniebildungsassay untersucht. Für Zellen mit normaler Rad51 Expression zeigte es sich, dass DNA-Doppelstrangbrüche die toxischsten Schäden während der Replikation waren. Sowohl zweiseitige, als auch einseitige DSB führten zur starken Inhibition der Elongation, zum Anhalten von Replikationsgabeln und zu einer schnellen und langen Aktivierung des Intra-S-Phase Kontrollproteins Chk1. Dies ging einher mit der Inhibition weiterer Initiationsereignisse. Eine ionisierende Bestrahlung wirkte sich nur auf den Elongationsprozess, nicht aber auf das Anhalten von Replikationsgabeln aus. Sie bewirkte außerdem nur eine schwache und späte Aktivierung von Chk1, sowie eine geringere Inhibition von Initiationsereignissen. Zellen mit einer Überexpression von Rad51 zeigten ein völlig anderes Bild. Schon im unbehandelten Zustand wiesen diese Zellen spontane DNA-Doppelstrangbrüche, radiale Chromosomen sowie eine deutlich langsamere Replikation auf. Des Weiteren zeigten sich diese Zellen gegenüber Einzelstrangbrüchen sowie einseitige DSB weitaus empfindlicher als die Kontrollzellen mit niedriger Rad51 Expression. Dies äußerte sich durch eine stärkere Inhibition der Elongation und durch ein deutlich stärkeres Anhalten von Replikationsgabeln. Interessanterweise führte diese massive Inhibition der Replikation nicht zur Aktivierung von Chk1. Im Gegensatz zu den Kontrollzellen wurden vermehrt Initiationsereignisse aktiviert und nicht inhibiert. Die erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Einzelstrangbrüchen und replikationsassoziierten DSB zeigte sich ebenfalls im Koloniebildungsassay. Des Weiteren führten Einzelstrangbrüche in Rad51-über-expremierenden Zellen zu einer signifikant erhöhten Anzahl von Doppelstrangbrüchen und zu einem Anstieg radialer Chromosomen. Nach Bestrahlung verhielten sich die Zellen mit einem Überangebot von Rad51 allerdings wie Zellen mit geringer endogener Rad51 Expression. Diese Daten lassen insgesamt die Schlussfolgerung zu, dass Zellen mit einer Überexpression an Rad51 nicht nur eine erhöhte genomische Instabilität aufweisen, sondern auch besonders empfindlich auf replikationsassoziierte DNA-Schäden reagieren. Diese Beobachtung wird erklärt durch die unterschiedliche Detektion der Schadenstypen über die Sensorproteine ATR und ATM. Replikationsassoziierte Schäden wie Einzelstrangbrüche oder einseitige DSB führen vor allem zur Bildung von expandierter einzelsträngiger DNA, die durch die Bindung des Einzelstrangbindungsproteins RPA den ATR-ATRIP rekrutiert und dies zu einer Aktivierung von Chk1 führt. Die Affinität von Rad51 gegenüber einzelsträngiger DNA könnte die Bindung von RPA kompetitiv hemmen und die Schadensantwort über ATR behindern. Nach Bestrahlung oder zweiseitigen Doppelstrangbrüchen erfolgt die Detektion des Schadens hauptsächlich über das Sensorprotein ATM. In diesem Fall kommt es erst nach Prozessierung des DSB zur Bildung von einzelsträngiger DNA. Für die Tumortherapie könnten diese Ergebnisse von entscheidender Bedeutung sein, da Rad51 in einigen Tumorentitäten dysreguliert ist. Dabei sollten Tumoren mit einer Überexpression von Rad51 besser auf eine Behandlung mit Agenzien ansprechen, durch die replikationsassoziierte Schäden induziert werden.