Entwicklung und Validierung Diagnostischer Assays : Experimentelle Untersuchungen eines Nachweisverfahrens für die Bestimmung von Asymmetrischem Dimethylarginin und L-Arginin in Trockenblut

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit ist die Validierung eines Trockenbluttests für ADMA (asymmetrisches Dimethylarginin) und L-Arginin (eine semiessentielle Aminosäure). ADMA ist ein im Proteinstoffwechsel anfallendes Molekül, das seit einiger Zeit mit kardiovaskulären Krankheiten in Verbindung gebracht wird. L-Arginin konkurriert mit ADMA um ein Stickstoffmonoxid (NO) produzierendes Enzym, welches wiederum für die Regulierung der Gefäßweite wichtig ist. Der Test misst mittels ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) die Konzentration von ADMA und L-Arginin in Vollblut. Das zu untersuchende Blut wird auf Filterpapier getropft und trocknet auf dem Papier ein. Das so präparierte Papier kann für längere Zeit gelagert werden (2-4 Wochen), um dann im ELISA untersucht zu werden. Hierfür werden Stanzlinge aus dem Papier vorbereitet, die daraufhin in eine Elutionslösung eingebracht werden. Nach der Elution folgt eine Acylierung. Die entsprechend vorbereiteten Proben werden dann über Nacht mit Antiserum inkubiert, um schließlich das Reaktionsgemisch hinzuzugeben. Für die Validierung dieses Messverfahrens gilt es, bestimmte Standard-Parameter zu überprüfen, wie z.B. die Intra-Assay-Varianz und die Inter-Assay-Varianz. Außerdem sollen potenzielle Einflussfaktoren der Präanalytik erfasst und untersucht werden. Um diese Einflussfaktoren beurteilen zu können, werden zunächst mehrere Proben analysiert und nachfolgend unterschiedlichen Umweltbedingungen ausgesetzt. Daraufhin wird erneut die Konzentration der Probe bestimmt. Es wird also die relative Konzentrationsänderung des Analyten unter dem Einfluss verschiedener Umweltbedingungen untersucht. Um ADMA und L-Arginin im Blut zu messen, gibt es noch eine weitere Methode, die „Liquid Chromatography“, gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC-MS/MS). Dieses Verfahren misst die zwei Analyten im Plasma. Im Rahmen dieser Arbeit wird desweiteren untersucht, inwieweit die Plasmakonzentration von L-Arginin und ADMA (gemessen mit LC-MS/MS) mit den aus Vollblut (ELISA) errechneten Konzentrationen korreliert.