I. Einleitung


I. Einleitung

In allen Organismen sind zahlreiche Merkmale, die im Verlauf der Entwicklung herausgebildet wurden, genetisch determiniert. Die hierfür verantwortlichen Gene werden in bestimmten Entwicklungsphasen, äußeren sowie inneren, reguliert, um ihre spezifische Funktion zeitgerecht zu erfüllen. Die differentielle Genaktivierung wird als wesentliches Element jeder Entwicklung oder jedes zellulären Einflusses betrachtet. Die genetische Information wird von der DNA durch Transkription auf die RNA überschrieben. Durch die sich anschließende Translation wird das spezifische Protein synthetisiert. Die neusynthetisierten Proteine enthalten häufig Signale, die ihren endgültigen Bestimmungsort determinieren (targeting). Durch entsprechende post-translationelle Modifikationen (z.B. Glukosylierung) werden aktive Proteine sezerniert, die wiederum regulierend auf die Transkription und Translation wirken können.
Durch die Aktivierung oder Inhibierung einer Vielzahl transkriptioneller Faktoren ist demnach ein möglicher intrazellulärer Kontrollmechanismus für die Expression eines Gens gegeben. Dieser Prozeß, der in transkriptioneller oder struktureller Aktivierung der Faktoren involviert ist, erlaubt die Anwesenheit in oder den Transfer zum Zellkern. Diese Prozesse können ein Teil des Mechanismus sein, bei welchem verschiedene Agentien die Aktivierung und Expression eines Proteins ansteigen lassen.
Ein weiterer Aktivierungsmechanismus eines Gens kann durch Hormone und andere extrazelluläre Signalmoleküle erfolgen, die bei einer Vielzahl von biologischen Prozessen regulierend wirken. Die gewebespezifische Wirkung der Hormone wird durch entsprechende Expression spezieller Hormonrezeptoren determiniert, die je nach Struktur und Mechanismus der Übertragung des hormonellen Signals in den Zellen in verschiedene Typen eingeteilt werden können:
 
1. in Transmembran-Rezeptoren mit einer Tyrosin-Proteinkinase-Domäne auf ihrem zytoplasmatischen Abschnitt (z.B. Insulin-Rezeptor)
2. in Membran-Rezeptoren ohne Kinase-Domäne, die an der zytoplasmatischen Seite mit sogenannten G-Proteinen gekoppelt sind (z.B. Glukagon-Rezeptor) und
3. intrazelluläre Rezeptoren, die zur Superfamilie ligandenabhängiger Transkriptionsfaktoren zusammengefaßt werden (z.B. Rezeptoren für Steroidhormone, Schilddrüsenhormone, Vitamin D3 und Retinsäure).
Die Antwort der Gewebezellen auf hormonelle Signale manifestiert sich auf unterschiedlichen molekularen Ebenen. Bei der Steuerung der Expression eines Proteins unter Hormoneinfluß können verschiedene molekulare Mechanismen zugrundeliegen.
 
 

1. Molekulare Prinzipien der Transkriptionsregulation

1.1 Promotor, Enhancer und Silencer

Die wesentlichen Unterschiede der prokaryontischen Genexpression zu der eukaryontischen, entsteht vor allen Dingen durch die komplexere Organisation eukaryontischer Zellen in verschiedene Kompartimente und ihre kompliziertere Bildung von mRNA. Das ist der Grund, weshalb bei Eukaryonten die Regulation der Genexpression auf mehreren Ebenen stattfindet. Über die transkriptionelle Kontrolle bei der Initiation und der Termination hinaus existiert eine Regulation beim Prozessieren der primären Transkripte, bei dem Transport der mRNA aus dem Zellkern, der Stabilität der zytoplasmatischen mRNA, sowie bei der Translation der mRNA (Darnell, 1985).
Den größten und umfangreichsten Anteil an der Kontrolle der Genexpression hat die transkriptionelle Initiation, wobei vielfältige DNA-Protein-Wechselwirkung eine zentrale Rolle spielen. Essentiell für die Transkription eines Gens sind regulatorische DNA-Elemente, die sich etwa 100 Basenpaare (bp) 5'-stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt befinden. Zu diesen Elementen gehören die TATA-Box, die GC-Box und die CAAT-Box, die gemeinsam den Promotor eines Gens bilden. Durch diese Promotor-Elemente wird eine korrekte Positionierung und Aktivierung des RNA-Polymerase II-Komplexes gewährleistet. Weiter stromaufwärts gelegene cis-aktive Sequenzen werden als Enhancer (Atchison, 1988) oder Silencer (Linzer, 1985) bezeichnet, je nachdem, ob die an sie bindenden Faktoren gewebe- und entwicklungsspezifisch, hormon- oder signalabhängig sein können oder die Transkriptionrate erhöhen oder erniedrigen. Diese cis-aktiven Elemente können sich, unabhängig von ihrer Orientierung, mehrere Kilobasen (kb) stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt entfernt befinden und die Transkription beeinflussen.
Mit verschiedenen Modellen kann die Wirkung weit entfernt liegender DNA-Protein-Komplexe auf dem proximalen Polymerase-Komplex erklärt werden. Das sogenannte "Looping" der DNA kann eine direkte Interaktion zwischen Polymerase-Komplex und weiter 5'-liegenden Sequenzen vermitteln. Diese Biegefähigkeit der DNA kann durch die Ausbildung von Nukleosomen erheblich gesteigert werden. Einige Transkriptionsfaktoren zwingen der DNA eine Biegung auf. Neben dieser direkten Wechselwirkung, die aktivierender oder reprimierender Natur sein kann, lassen sich indirekte Interaktionen über Hilfsproteine, sogenannte Aktivator-Proteine, beobachten. Dabei kann die Konformation eines solchen Aktivator-Proteins für die transkriptionelle Aktivität eines Gens von Bedeutung sein.
 
 

1.2 Transkriptionsfaktorklassen

Transkriptionsfaktoren und ihre sequenzspezifische Bindung an regulatorische Elemente der DNA steuern die Genexpression und regulieren darüber wichtige Ereignisse, wie Zellentwicklung, -differenzierung und -wachstum. Unterschieden werden die Transkriptionsvorgänge, die notwendige Strukturelemente der Zelle bilden die stets in ausreichender Menge vorhanden sein müssen (basale Transkription) und damit den Grundstock einer normalen Zelle darstellen. Gleichermaßen werden damit im Unterschied zu der basalen Transkription Vorgänge bezeichnet, die die Besonderheit einer differenzierten Zelle kennzeichnen (induzierbare Transkription). Im allgemeinen enthalten Transkriptionsfaktoren mindestens zwei funktionelle Domänen: eine, die die Bindung an die DNA vermittelt und eine, die die Transkriptionsaktivierung moduliert. Zusätzlich kann das Protein noch andere charakteristische Domänen aufweisen, die z.B. für die Bindung von Liganden verantwortlich sind. Die DNA-bindenden Regionen der Transkriptionsfaktoren lassen sich aufgrund ihrer Aminosäuresequenz in mehrere, in den folgenden Unterpunkten beschriebene, strukturelle Familien einteilen.
 
 

1.2.1 Helix-Turn-Helix (HTH) Motive

Dieses DNA-Bindungsmotiv wurde als erstes identifiziert und ist im Vergleich zu den anderen Motiven das meist untersuchte. Die Abbildung 1 zeigt die charakteristische Struktur des Motives, das aus zwei a-Helices besteht, die durch eine [beta]-Faltblatt-Struktur voneinander getrennt sind. Die eine helikale Domäne, die "Erkennungssequenz", tritt über elektrostatische Wechselwirkungen mit den Basen der großen Furche der Ziel-DNA in Kontakt. Die zweite helikale Domäne liegt der ersten senkrecht gegenüber und stellt den Kontakt zu der DNA über unspezifische Wechselwirkungen her (Pabo & Sauer, 1984). Das HTH-Motiv wurde in Eukaryonten anfangs in einer Gruppe von Genen der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) entdeckt (Ingham, 1985). Den Drosophila-Gengruppen ist eine hochkonservierte Region von etwa sechzig Aminosäuren (Homöo-Box) gemein. Diese Region kodiert für regulatorische Proteine, die durch sequenzspezifische Bindung die Transkription verschiedener für die Embryonalentwicklung essentieller Gene reguliert. In manchen Fällen können die Vertreter dieser Protein-Klasse (Kernrezeptoren) untereinander heterodimerisieren und somit das Spektrum der Regulationsmöglichkeiten erweitern.
 
 
 
 
Abb.1: Helix-Turn-Helix-Motiv 
Diese Motiv ist eine Anordnung von zwei a-Helices, von denen eine an die DNA bindet, während die andere Protein-Protein-Wechselwirkung eingeht.
 
 

1.2.2 Zink-Finger Motive

Der erste klonierte und charakterisierte Transkriptionsfaktor, dessen Bindung über eine Zink-Finger-Struktur vermittelt wurde, ist TF IIIA aus Xenopus (Evans & Hollenberg, 1988). Dieser Faktor spielt eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung der RNA-Polymerase III und der Transkription der 5S RNA. Entsprechend der Koordination des Zinkatomes können zwei Subtypen des Zink-Finger-Motives unterschieden werden. Der eukaryontische Transkriptionsfaktor SP 1, der an seinem C-Terminus drei Zink-Finger enthält, stimuliert die Transkription durch eine selektive Bindung an die GC-Box (Kadonga & Tijian, 1986). Die DNA-bindene Domäne besteht aus einer Tandem-Wiederholung von 30 Aminosäuren, deren Tertiärstruktur durch Interaktion eines Zinkatoms mit je einem Paar Cystein- und Histidin-Resten aufrechterhalten wird (siehe Abb.: 2B). Bei der Familie der Steroidhormonrezeptoren, auch bei den Schilddrüsenhormonrezeptoren, wurde ein vergleichbares Motiv identifiziert (Berg, 1989). Die C-terminale Bindungsdomäne dieses Motives besteht aus zwei Zink-Fingern, bei denen das Zinkatom über jeweils vier Cystein-Reste koordiniert ist (siehe Abb.: 2A).
 
 
 
 
Abb.2: Die verschiedenen Zink-Finger-Motive 
Ein Zink-Atom ist komplex gebunden zwischen zwei Cystein (C)- und zwei Histidin (H)- Resten so angeordnet (B), daß eine Schleife entsteht, die mit der DNA in Kontakt tritt. Proteine der Steroidhormon-Rezeptor-Familie enthalten ähnliche DNA-Bindungsmotive, hier sind allerdings vier Cysteine koordinativ mit dem Zink verknüpft (A).
 

1.2.3 Leucin-Zipper Motive (basische Bindungsdomänen, bZip)

Den bZip-Transkriptionsfaktoren ist eine basische Bindungsdomäne gemeinsam. Das Protein bzw. die basische Bindungsdomäne wurde erstmals 1988 in Eukaryonten charakterisiert (Landschutz). Die Bindungsdomäne enthält eine hochkonservierte Region von etwa dreißig Aminosäuren, die einen hohen Anteil an basischen Aminosäuren aufweist. Über die positiven, N-terminalen Ladungen findet der Kontakt zu den negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA statt. Eine zweite, konservierte Domäne befindet sich weiter C-Terminal gelegen, der "Leucin-Zipper" (Leucin-Reißverschluß). In diesem Aminosäureabschnitt befindet sich charakteristischerweise an jeder siebten Position die Aminosäure Leucin. Durch die a-helikale Struktur organisieren sich alle hydrophoben Leucin-Reste auf einer Seite an und können so mit den amphipatischen Helices anderer Protein-Moleküle dieser Familie in Wechselwirkung treten. Möglicherweise wird durch die reißverschlußartige Strukturanordnung die basische Domäne soweit positioniert, daß sie sich Y-förmig ausrichten kann und so den Kontakt zu den Basen herstellt (O'Neill et al., Vinson et al., 1989). Erfolgt zusätzlich noch eine Dimerisierung mit verschiedenen Proteinen, so läßt sich das Spektrum der möglichen transkriptionellen Kontrolle erweitern. Unter anderem ist eine Heterodimerisierung für eine Regulation der biologischen Aktivität der bZip-Proteine untereinander von Bedeutung. Beispielsweise wird der AP 1-Komplex, der aus den zwei bZip-Proteinen Jun und Fos besteht, durch die Bildung von Heterodimeren antagonisiert (Rauscher et al., 1988; Curran & Franza, 1988).
 
 
 
 
Abb.3: Leuzin-Zipper und basische Bindungsdomänen-Motive 
Der Leuzin-Reißverschluß (Zipper) bezeichnet einen Abschnitt in bestimmten dimeren Proteinen, die jeweils in einer a-Helix Leuzin so angeordnet enthalten, daß alle Leuzin-Reste auf einer Seite zu liegen kommen und dadurch hydrophobe Wechselwirkungen zum Partnermolekül möglich sind. In dem N-terminalen Bereich dieser Proteine sind vermehrt basische Aminosäuren vertreten, welche eine Bindung an die DNA ermöglichen. Proteine dieses Types finden sich z.B. in den Protoonkogenen-Produkten c-Fos und c-Jun. 
 
 

1.2.4 Weitere Bindungsprinzipien

Die bisher vorgestellten Faktor-Familien nehmen den Kontakt zur DNA entweder über eine a-Helix auf oder über eine antiparallele [beta]-Faltblattstruktur an die DNA. Im allgemeinen beschränken sich diese Bindungsmotive auf bakterielle Repressor-Proteine. Über einen prokaryontischen Repressor MetJ ist bekannt, daß er als ein Tetramer an seine Zielsequenz bindet. Dabei wird die große Furche der DNA-Kontaktstelle durch zwei dimerisierte [beta]-Faltblattdomänen in antiparalleler Orientierung ausgefüllt (Pabo & Sauer, 1986). Es existieren eine ganze Reihe von Trankriptionsfaktoren, die neben den als Zink-Finger bezeichneten Faktoren, noch andere Metallionen zur Stabilisierung ihrer Struktur benutzen. Ein Beispiel dafür ist der Hefe-Aktivator GAL4. In seiner cysteinreichen Region vermag er Zinkatome zu koordinieren, wobei diese Konformation von der klassischen Zink-Finger-Struktur abweicht. Ein anderer Hefe-Faktor -ACE1- bindet ebenfalls über seine cysteinreiche Region, wobei allerdings Kupferionen komplexiert werden (Dameron, 1991).
 
 

2. Molekulare Wirkungsweise von Schilddrüsenhormonen

2.1 Physiologische Aspekte der Schilddrüsenhormone

Einfluß auf den Grundumsatz und Stoffwechsel
Für das Wachstum und die Differenzierung von Zellen und Geweben sind Schilddrüsenhormone (der wichtigste Vertreter T3, 3,5,3'-Triiod-L-thyronin) unentbehrlich. Einen zentralen Einfluß haben diese Hormone auf die cerebrale Entwicklung. Unter anderem regulieren sie den Sauerstoffverbrauch und den Grundumsatz und werden deshalb für normale, physiologische Funktionen in fast allen Geweben benötigt.
Unter pathologischen Zuständen wird die komplexe Symptomatik der vielfältigen Wirkungsweise der Schilddrüsenhormone in verschiedenen Organen deutlich, wie z.B. der T3-Einfluß auf die Lipolyse im Fettgewebe oder Glykolyse und Glukoneogenese in der Leber (Müller & Seitz, 1984). Eine Hypothyreose führt im Kindesalter zum Stillstand der körperlichen und geistigen Entwicklung (Kretinismus). Bei Erwachsenen führt dies zu einer Herabsenkung des Grundumsatzes und damit zu einer Verlangsamung des Stoffwechsels, verminderter Körpertemperatur und einem Nachlassen der körperlichen und geistigen Fähigkeiten. Im Gegensatz dazu ist die Hyperthyreose durch einen erhöhten Grundumsatz, d.h. Stoffwechselsteigerung, Abnahme von Muskel- und Fettgewebe und physischer Unruhe gekennzeichnet.
In der Schilddrüse werden die beiden Schilddrüsenhormone T4 und T3 synthetisiert. Synthese und Ausschüttung unterliegen der Kontrolle des Hypophysenhormons Thyreotropin (TSH). Das Hauptsekretionsprodukt der Schilddrüse ist T4, das in peripheren Geweben (Niere und Leber) durch eine 5'Monodeiodierung in das biologisch etwa zehnfach aktivere T3 umgewandelt wird.

Einfluß auf den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch
Ein erhöhter Grundumsatz, verbunden mit einem erhöhten Sauerstoffverbrauch, gehört zu den klassischen Symptomen hyperthyreoter Krankheitsbilder. Als Ursache für dieses lange bekannte Phänomen wurden T3-vermittelte Ÿnderungen des mitochondrialen Metabolismus angenommen. So charakterisierte z.B. Hoch 1962 die Hyperthyreose "as a disease of mitochondria". In der Tat zeigen isolierte Mitochondrien, die aus hyperthyreoten Versuchstieren präpariert werden, einen zwei- bis dreimal höheren Sauerstoffverbrauch als euthyreote Kontrollen (Shears & Bronk, 1979 und Hoch, 1988). Der Anstieg des mitochondrialen Sauerstoffverbrauches nach T3-Gabe erfolgt mit einer Verzögerung von ca. zwölf Stunden, Maximalwerte werden nach 24-48 Stunden erreicht (Tata et al., 1963). Die parallel hierzu zu beobachtende Aktivierung einzelner Atmungskettenenzyme, mitochondrialer Dehydrogenasen und anderer Komponenten des mitochondrialen Metabolismus (Harper et al., 1993) macht deutlich, daß T3 offensichtlich gezielt auf bestimmte Komponenten des mitochondrialen Stoffwechsels wirkt und dadurch den O2-Verbrauch stimuliert. Die molekularen Ursachen dieser Aktivität sind jedoch bislang wenig geklärt. Verschiedene Arbeitsgruppen haben den Effekt von T3 auf Mitochondrien postuliert und versucht, mitochondriale T3-Rezeptoren zu identifizieren, die den T3-Effekt vermitteln. Doch obwohl in mehreren dieser Arbeiten (Sterling & Milch, 1979) die Existenz mitochondrialer Bindungsstellen für T3 postuliert wurde, gelang in keinem der Fälle bisher die Charakterisierung solcher Bindungsstellen als funktionelle Rezeptoren.
 
 

2.2 Molekularer Wirkungsmechanismus

Intranukleäre T3-Rezeptoren (thyroid receptors, TRs) vermitteln die Schilddrüsenhormon-abhängige Regulation der Genexpression durch Bindung von T3. Die TRs ihrerseits als Liganden-abhängige Transkriptionsfaktoren binden an T3-responsive Elemente (TREs) in der Promotorregion regulierter Gene. Durch Interaktion des Komplexes mit anderen Proteinen der basalen Transkriptionsmaschinerie erfolgt eine Aktivierung oder Repression der Transkription des entsprechenden Gens (Desvergne, 1994). Das DNA-Bindungsmotiv setzt sich aus zwei Komponenten zusammen, die in unterschiedlicher Orientierung zueinander angeordnet sein können. So kann die "halfsite" AGG TCA sowohl als Tandem-Wiederholung mit einem Abstand von vier beliebigen Nukleotiden (direct repeat, DR4), sowie als Palindrom ( thyroid responsive element palindrome,TREpal) oder als inverses Palindrom (TRElap) die T3-Wirkung vermitteln (Parker, 1993).
Die Charakterisierung der Aminosäurezusammensetzung der Schilddrüsenhormonrezeptoren führte zu ihrer Einordnung in die Steroid-Rezeptor-Superfamilie, zu der u.a. der Glukocorticoid-, der Estrogen-, der Progesteron- und der Vitamin D-Rezeptor gehören (Evans, 1988). Bei den Steroid-Rezeptoren handelt es sich um ligandenabhängige Transkriptionsfaktoren, die eine zentrale, hochkonservierte DNA-Bindungsdomäne mit zwei Zink-Fingern und eine C-terminale Ligandenbindungsdomäne als strukturelle Gemeinsamkeit aufweist. Bisher konnten zwei T3-Rezeptor-Gene, TRa und TR[beta], identifiziert werden, die eine ausgeprägte Homologie in ihren Translationsprodukten aufweisen (Lazar, 1993). Durch alternatives Spleißen können mehrere Isoformen von beiden Genen exprimiert werden, die in einem adultem Organismus eine z.T. gewebespezifische Verteilung aufweisen und deren Expression während der Entwicklung zeitlich und lokal reguliert ist. Die Isoformen TR[beta] und TR[beta]1 werden ubiquitär exprimiert, während die Isoform TR[beta]2 hauptsächlich in der Hypophyse lokalisiert ist. Bisher sind von dem TRa vier Isoformen beschrieben worden, von denen allerdings nur die Isoform TRa1 funktionell aktiv ist. An die DNA-Zielsequenzen können die T3-Rezeptoren als Monomere, Homodimere und Heterodimere binden. Als Heterodimerisierungspartner können nicht nur die verschiedenen TR-Isoformen dienen, sondern ebenfalls auch andere Mitglieder der Steroid-Superfamilie, die summiert als TRAPs (TR auxiliary protein) bezeichnet werden (siehe Abb.: 4). Zu den TRAPs zählen u.a. der Retinoid-X-Rezeptor (RXR), der Retinsäure-Rezeptor (RAR) sowie der Peroxisomen Proliferator aktivierte Rezeptor (PPAR).
 
 
 
 
Abb.4: Molekulare Mechanismen der T3-Wirkung 
T3 als die physiologisch aktive Form der Schilddrüsenhormone, tritt in die Zelle ein (vermutlich mittels eines Transporterproteins) in den Zellkern und bindet dort an den kernständigen T3-Rezeptor. Der Rezeptor-Hormon-Komplex erkennt bestimmte Nukleotidsequenzen, sogenannte TREs (Thyroid-Hormon Response Elements), die in den regulatorischen Breichen T3-responsiver Gene liegen.
 

3. Oxidativer Streß und zelluläre Antioxidanten

3.1. Hitzeschock-Proteine

Hitzeschock-Gene (heat-shock protein, HSP) ist die Bezeichnung für eine Klasse von Genen, die sowohl von eukaryontischen als auch von prokaryontischen Zellen vorübergehend als Reaktion auf verschiedene Umwelteinflüsse exprimiert werden. Hierzu gehören z.B. das Wachstum bei erhöhter Temperatur und die Behandlung mit verschiedenen Stoffwechselinhibitoren, Aminosäure-Analoga oder Übergangsmetalle. Bei Eukaryonten kann die Expression von Hitzeschock-Genen in fast allen Zelltypen ausgelöst werden. Ausnahme sind Spermatozyten und die ersten Zellteilungsstadien eines Embryos. Inzwischen sind auch HSP-homologe Proteine bekannt, die konstitutiv, also nicht erst bei einer Belastung synthetisiert werden (HSC). Die ausgeprägte Thermotoleranz der Zellen ist jedoch die wichtigste und bekannteste Auswirkung der Hitzeschock-Proteine. Diese Thermotoleranz sorgt dafür, daß zahlreiche zelluläre Prozesse auch bei "Streß" gewohnt ablaufen. Die entsprechenden Gene und ihre Proteine sind in allen bisher untersuchten Spezies sehr stark konserviert, sie kommen in Bakterien, Hefen, Insekten und Vertebraten vor. Die Klassifizierung dieser Proteine erfolgt derzeit nach ihrem Molekulargewicht Mr (z.B. HSP 70 ist ein 70 kDa Protein). Die Hitzeschock-Gene werden durch Bindung eines Hitzeschock-Transkriptionsfaktors (heat-shock transcription factor; HSTF) an eine HSRE (heat-shock response element) genannte DNA-Sequenz im Promotorbereich aktiviert. Eine häufig beobachtete Funktion von Hitzeschock-Proteinen ist ihre Wechselwirkung mit anderen Proteinen. Die HSP's können diese Proteine in eine korrekte Konformation überführen (Ordnung der Proteinfaltung), an einer Aggregation hindern, für eine andere Funktion bereithalten oder z.B. bei Hitzestreßsituationen die Proteine optimal, aber anders falten. Wegen dieser Begleitfunktion werden sie auch als Begleitproteine (chaperone proteins) oder "Chaperone" bezeichnet.
 
 

3.2 Oxidativer Streß

Eine Zelle und ihre Kompartimente stellt ein empfindliches System dar, das eine Vielzahl von Proteinen und Stoffen enthält, um das physiologische Gleichgewicht stabil zu erhalten. Um die Rolle der Hämoxygenase zu begründen, ist es essentiell, Prinzipien und Konsequenzen eines oxidativen Stresses zu verstehen. Wenn die Balance zwischen dem Gehalt an Pro-Oxidanten (z.B. reaktive Sauerstoffzwischenstufen, reactive oxygen intermediates, ROI) und der Gehalt an antioxidativen Schutzfaktoren (Proteinen) aus dem Gleichgewicht gebracht wurde, spricht man von oxidativem Streß. Durch ein Absinken des Gehaltes an Antioxidanten wie z.B. Glutathion, Ascorbat oder a-Tocopherol folgt eine vermehrte Bildung reaktiver Sauerstoffzwischenstufen (Halliwell & Gutteridge, 1990). In normalen biologischen Prozessen werden laufend freie Radikale gebildet. Unter oxidativem Streß jedoch wird ihre Formation enorm gesteigert. Unkontrollierter oxidativer Streß erzeugt zellschädigende Effekte wie z.B. Lipidperoxidation (Rice-Evans & Burdon, 1993) und dadurch Membranbeschädigungen (Ferrali et al., 1992), DNA-Strangbrüche (Ames, 1989) und dramatische Proteinveränderungen (Dean et al. und Neuzil et al., 1993). Beschädigungen des Gewebes durch freie Radikale werden mit der Pathophysiologie einiger Krankheiten in Verbindung gebracht. Beispiele sind unter anderem Atherosklerose (Halliwell, 1993), Krebs (Rice-Evans & Burdon, 1993), Alzheimer und altersbedingte Schädigungen der Sehkraft.
Eines der häufigsten freien Radikale ist das Superoxidanion [.O2-]. Eine Bildung dieses Radikals kann durch ein "Leck" in der Elektronen-Transport-Kette der Mitochondrien, Chloroplasten und des endoplasmatischen Retikulum (ER) erfolgen (Halliwell, 1993). Das Superoxidanion wird ebenfalls während eines respiratorischen "Aufplatzen" phagozytischer Zellen gebildet. Die Wasserstoffperoxidproduktion der Phagozyten spielt eine Schlüsselrolle bei der Vernichtung vieler zellschädigender Bakterienstämme. Durch das Vorhandensein von Sauerstoff in der Zelle und seine Reduktionsmöglichkeit zu radikalischen Spezies können toxische Stoffe wie das Superoxidanion, Wasserstoffperoxid [H2O2] und Hydroxylradikale [HO.] erst entstehen. Die Mehrzahl der Hydroxylradikale werden durch eine Metall-abhängige Aufspaltung des Wasserstoffperoxides erzeugt (Halliwell, 1993). Unter Normalbedingungen ist die Eisen (III)-abhängige Anreicherung der Hydroxylradikale die signifikanteste zelluläre Radikalquelle (Ryan & Aust, 1992). Allerdings sind auch andere Metalle ebenfalls in der Lage, anfangs gering reaktive Sauerstoffzwischenstufen zu vermehrt reaktiven Zwischenstufen zu konvertieren.
 
 

3.3 Zellulärer Schutz

Um den oxidativen Streß zu bekämpfen, haben Zellen und Gewebe eine Vielzahl von antioxidativ-wirkenden Mechanismen entwickelt, die bei eventueller Anreicherung von reaktiven Sauerstoffzwischenstufen (reactive oxygen intermediates, ROI), oder bei zellulären Reparaturvorgängen aktiviert werden. Einige intrazelluläre Antioxidanten sind Katalase -konvertiert Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff-, Superoxid Dismutase - konvertiert Superoxidanionen zu Wasserstoffperoxid-, a-Tocopherol, Ascorbat und Glutathion.
Glutathion (GSH) ist ein wichtiges antioxidatives Tripeptid ([gamma]-Glutamin-Cystein-Glycin), das in den meisten Zellen und Geweben vorkommt. Das GSH ist beteiligt an:
 
1. der Beseitigung von Peroxiden durch die Selen-abhängige Glutathion-Peroxidase (Reaktion 1) (Flohe, 1989)
2. der Reduktion von 5-Hydroperoxymethyluracil durch eine nicht Selen-haltige Peroxidase (Ketterer & Meyer, 1989) 
3. eine nicht-enzymatische Reduktion freier Radikale (Potter & Hinson, 1987) und
4. an der Konjugation von exogenen reaktiven Zwischenstufen durch entweder nicht- enzymatische oder Glutathion S-Transferasen.
 
 
 
 
Abb.5: Glutathion-Entgiftungsreaktionen (für Wasserstoffperoxid und Radikale)
 

Das oxidierte Glutathion (GSSG) wird schnell wieder zurück reduziert zu GSH durch die GSH-Reduktase (Reaktion 2). Der intrazelluläre Gehalt an GSH wird während einer starken, oxidativen Streß-Situation fast komplett erschöpft.
Die Natur macht zum Schutz ihrer Produkte von den präventiven (Glutathion-Peroxidase) als auch von den kettenabbrechenden Antioxidanten Gebrauch. Die biologischen kettenabbrechenden Antioxidanten können in zwei Gruppen eingeteilt werden, abhängig davon, ob sie in der wäßrigen Phase oder in der Lipidphase Radikale zersetzen:
 
1. primäre Antioxidanten: diese Antioxidanten reduzieren die Initiation der Autooxidation durch Umwandlung der Hydroperoxide zu den entsprechenden Alkoholen 
2. sekundäre Antioxidanten: die zum Kettenabbruch führenden Antioxidanten wirken schnell via Addition eines Wasserstoffatoms an das Peroxylradikal. Es sind vor allen Dingen phenolische Substanzen (ArOH), zu denen das Vitamin E zählt.
In der Lipidphase biologischer Systeme wirkt höchstwahrscheinlich ausschließlich a-Tocopherol (Vitamin E) als kettenabbrechender Antioxidant. Das a-Tocopherol ist in vitro effizienter als irgend ein anderer phenolischer Antioxidant (Friedrich, 1987).
 
 

 
 
Abb.6: Radikal-Abfangreaktion von phenolischen Substanzen (ArOH) 
 

Das resultierende Tocopheroxyl-Radikal (siehe Abbildung 6) ist normalerweise zu unreaktiv, um die Kettenabbruchreaktion fortzusetzen. Es kann allerdings rasch unter Bildung molekularer Produkte mit einem Peroxyl-Radikal reagieren.
 
 

4. Entdeckung und Charakterisierung der Hämoxygenase 1 (HO1)

4.1 Sauerstofftransportierende Proteine und ihre prosthetische Gruppe Häm

Der Übergang von der anaeroben zur aeroben Lebensweise war ein wichtiger Schritt der Evolution. Er brachte jedoch das Problem mit sich, die Zellen ausreichend mit Sauerstoff zu versorgen. Durch die Verwendung von sauerstofftransportierenden Molekülen konnte die schlechte Wasserlöslichkeit von Sauerstoff überwunden werden. Diese Sauerstoffüberträger in Wirbeltieren sind die Proteine Hämoglobin und Myoglobin. Die Fähigkeit von Myoglobin und Hämoglobin, Sauerstoff zu binden, beruht auf der Anwesenheit des Häms als prosthetische Gruppe. Dabei handelt es sich um eine spezifische nichtpeptidische Einheit, die in vielen biologischen Systemen eine ubiquitäre Schlüsselrolle spielt.
Die Hämgruppe bildet in verschiedenen Cytochromen, die in den Elektronentransport, die Energieerzeugung und die chemische Metabolisierung involviert sind, die nichtpeptidische, prosthetische Gruppe. Ebenfalls sind Peroxidasen und Katalasen, die für den Wasserstoffperoxidabbau verantwortlich sind, hämgruppen-tragende Enzymsysteme.
Neben den sauerstoffbindenen Eigenschaften des Häms und seiner ubiquitären Schlüsselrolle in verschiedenen Enzymsystemen ist es beteiligt an der Regulation zellulärer Peptidinitiationen und Proteinsynthesen über die eIF-2a Kinase und ist erforderlich für die hämatopoetische Zellentwicklung und Differenzierung (Abraham et al., 1988). Synthetisiert wird die Hämgruppe aus den Grundstoffen Succinyl-CoA (einem Zwischenprodukt des Citratzyklus) und Glycin. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieser Synthese (das "Schrittmacherenzym") bildet die d-Aminolävulinat-Synthetase (ALAS).
 
 

4.2 Hämoxygenase

Von großer Bedeutung in der Regulation biologischer Systeme ist die Degradation des Häms zu dem linearen Tetrapyrrol Biliverdin unter Freisetzung eines Eisens und der Bildung von Kohlenmonoxid. Diese Reaktion wird von dem hochkonservierten Enzym Hämoxygenase (HO; E.C. 1.14.99.3) katalysiert (siehe Abb.7), das in Algen und Pflanzen sowie in höheren Spezies identifiziert werden konnte (Abraham et al., 1988).
Ein interessanter Aspekt ist die Tatsache, daß die Hämoxygenase neben ihrer primären Aufgabe, das Eisen aus alternden roten Blutkörperchen zu rezyklieren, eine Beteiligung an vielen zellschädigenden Streßsituationen hat.
Das limitierende Enzym des Hämkatabolismus wurde erstmals 1968 von Tenhunen et al. beschrieben. In Säugern wird das Biliverdin anschließend durch ein zytosolisches Enzym, der Biliverdinreduktase, zu Bilirubin konvertiert. Das Bilirubin ist nur schwach wasserlöslich und wird aus diesem Grund für den Transport reversibel an Albumin gebunden. Das Enzym UDP-Glukuronyltransferase, ein integrales Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums, konjugiert das Bilirubin mit der Glukuronylsäure und bildet das Bilirubin-Monoglukuronid oder das Bilirubin-Diglukuronid. Beide Bilirubin-Glukuronid-Formen werden durch Albumin transportiert und über die Galle ausgeschieden.
 
 
 
 
Abb.7: Schematische Darstellung der Hämoxygenase (HO) in dem hepatischen Zellsystem. 
Die primäre Aufgabe der HO ist die Rezyklierung des Eisens aus alternden roten Blutkörperchen. 
 

80 bis 85 % des gebildeten Bilirubins stammt aus dem Hämoglobin alternder oder beschädigter Erythrozyten (Schacter, 1988). Daraus ergibt sich die hohe Grundaktivität der Hämoxygenase in jenen Geweben, welche reich an Retikuloendothel-Zellen sind, wie zum Beispiel Milz und Knochenmark.
 
 

4.3 Isoformen der Hämoxygenase

Die Hämoxygenase hat ein Molekulargewicht von 32 kDa (Maines et al., 1977 und Yoshinaga et al., 1982). Es existieren zwei Isoformen dieser Monooxygenase, wobei das 32 kDa Protein als Hämoxygenase Typ 1 (HO 1) und das neuentdeckte zweite Protein als Hämoxygenase Typ 2 (HO 2) bezeichnet wird. Die Hämoxygenase 2 weist ein Molekulargewicht von 34 kDa auf und konnte aus humanen und Rattengeweben isoliert werden (Cruse & Maines, 1988 und Trakshel & Maines, 1989).
Die Isoformen der Hämoxygenase sind Produkte zweier unterschiedlicher Gene, dennoch weisen sie eine Aminosäuren-Sequenzhomologie von 40 % auf (Müller et al., 1987; McCoubrey et al., 1992 und McCoubrey & Maines, 1994). McCoubrey und Maines konnten zeigen, daß die HO-1 das Produkt eines Transkriptes ist, während die HO 2 von zwei Transkripten eines Gens kodiert wird. Das Auftreten verschiedenartiger HO 2-Transkripte beruht auf der Anwesenheit mehrerer Polyadenylierungsstellen in dem HO 2-Gen, von dem unterschiedliche mRNAs synthetisiert werden können. Die HO 2 ist nicht induzierbar, während die HO-1 durch eine Vielzahl von strukturell nicht verwandten, pharmakologischen und chemischen Agentien, sowie durch Variation des Zellzustandes, wie z.B. Hitzeschock und anderen Formen von zellulärem Streß induzierbar ist.
In vielen tierischen Geweben und Zellkulturen steigt die HO 1 mRNA-Expression durch die Behandlung mit dem natürlichen Substrat Häm sowie mit verschiedenen Metallen und Xenobiotika (Fremdstoffe), endokrinen Faktoren und synthetischen Metallporphyrinen (Yoshida et al., 1991 und Alam & Zhining, 1992).
Umfangreiche Studien von Nath et al. (26) lieferten Hinweise, daß eine in vivo Induktion der HO-1 an die Ferritinsynthese gekoppelt ist als eine schnelle und schützende, antioxidative Folgereaktion. Ferritin bildet den Speicher des Eisens im Gewebe. Ein Ansteigen des Ferritins und die Assoziation zu der HO-1-Induktion wird begründet durch ein Absenken des intrazellulären Eisenspiegels, welcher z.B. bei einer eisenkatalysierten Radikalreaktion oder bei oxidativem Streß beobachtet werden kann.
Die Isoformen der HO unterscheiden sich nicht nur durch die HO-1-spezifische Induzierbarkeit des Enzymes, sondern gleichfalls durch ihre unterschiedliche Gewebeverteilung. Im Gehirn und den Reproduktionsorganen ist die nicht regulierbare Hämoxygenase 2 im Vergleich zu der regulierbaren Hämoxygenase 1 sehr hoch exprimiert. Die zelluläre Rolle der Hämoxygenase 2 ist noch nicht bekannt, dennoch liegt die Vermutung nahe, daß die HO 2 eine wichtige Aufgabe in der Keimzellentwicklung und Signaltransduktion neuraler Gewebe hat.
 
 

5. Substratspezifität, Struktur und aktive Form des Proteins

5.1 Substratspezifität

Die Hämgruppe bildet in einer Vielzahl von Proteinen die nicht peptidische, prosthetische Gruppe. Unter anderem kommen die Hämgruppen als Redox-Cofaktoren in der Atmungskette und in der Photosynthese vor. Das Vorhandensein eines zentralen Eisenatoms ist für eine molekulare Sauerstoffbindung einer Metallporphyringruppe erforderlich. Metallporphyrine, in welchen das zentrale Eisenatom ausgetauscht wurde gegen : Zinn2+-, Zink2+-, Chrom2+- oder Mangan2+-Ionen, wirken als potente kompetetive Inhibitoren der Hämoxygenase.
Dagegen sind Magnesium-, Nickel- und Kupfer-Protoporphyrine in der Lage, an das katalytische Zentrum der Hämoxygenase zu binden und haben nur einen leichten inhibitorischen Effekt auf die Hämgruppendegradierung (Kappas & Drummond, 1986).
Das Hämprotein, an welches die Hämgruppe bindet, ist relativ unspezifisch, da Met-Hämoglobin, Met-Albumin, die a- und [beta]-Kette des Hämoglobins, Häm-Hämopexin- und Hämoglobin-Haptoglobin-Komplexe ebenfalls Substrate der Hämoxygenase sind (Lutton et al., 1991).
Tomaro et al. (1984) untersuchte die strukturellen Anforderungen, die erfüllt werden müssen, um eine Substrat-Enzym-Verknüpfung zu bilden. Die Anwesenheit zweier benachbarter Propionsäure-Seitenketten in der Position 6 und 7 sind unabdingbar für die Substrataktivität des Enzyms. Werden diese Gruppen durch Butylsäurereste oder Essigsäurereste substituiert, resultiert daraus ein markanter Verlust der enzymatischen Aktivität.
 
 
 
 
Abb.8: Nomenklatur der Porphyrine 
Die vier Pyrrolringe werden mit A, B, C und D bezeichnet, die C- und N-Atome wie oben dargestellt durchnumeriert.
 

In den Positionen 2 und 4 besitzen die Porphyrine Vinylgruppen (Hämtyp b). Werden diese durch Methylgruppen ersetzt, wird die Substrataktivität nicht beeinträchtigt.
 
 

5.2 Struktur des Proteins und aktive Zentren

Das Carboxylende der Hämoxygenase hat eine hydrophobe Sequenz und gewährleistet die Anlagerung des Proteins an der mikrosomalen, inneren Membran. Ein Verdau dieser C-terminalen Sequenz resultiert in einem löslichen, aber katalytisch noch aktiven Enzym. Die Hämoxygenase bildet mit der Hämgruppe einen Komplex, in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1, das transiente Hämprotein. Die Positionierung der Hämgruppe im Inneren des Hämoxygenasemoleküls ist nur möglich, wenn der Tetrapyrrolring des Häms über die a-meso Position geöffnet ist (Yoshiga et al., 1978 und Yoshiga et al., 1991). Mit Hilfe spektroskopischer Techniken konnte festgestellt werden, daß die Hämbindungstasche der Hämoxygenase identisch mit der des Myoglobins ist. Hierbei wird die sechsfach-koordinierte Hämgruppe an einem essentiellen, neutralen Histidinliganden (His 151) und einem Wassermolekül verknüpft (Takahashi et al., 1994 und Sun et al., 1993). Das His 151 befindet sich in einem hochkonservierten Sequenzbereich hydrophobischer Aminosäuren.
Der Sauerstoffaktivierungsmechanismus der Hämoxygenase unterscheidet sich von dem anderer Enzyme, wie der des Cytochrom P450 und der der Peroxidasen.
In der Summe sind drei Sauerstoffmoleküle und sechs reduzierende Ÿquivalente für eine oxidative Degradierung eines Hämmoleküls zu Biliverdin, Eisen (Fe2+ ) und Kohlenmonoxid notwendig.
Abbildung 9 zeigt das aktuelle Modell der Hämoxygenase-katalysierten Umwandlung von Häm zu Biliverdin. Die Hämoxygenase ist essentiell für die NADPH-Cytochrom P450 Reduktase, die das reduzierte Ÿquivalent von der Oxidation von NADPH oder NADH zu NADP+ und NAD+ liefert. Das enzymgebundene Eisen der Hämgruppe wird durch die NADPH-Cytochrom C Reduktase in die Ferroform reduziert, die bevorzugt Sauerstoff und Kohlenmonoxid binden kann. Der Hämgruppen-Sauerstoff-Komplex wird im Inneren der Hämtasche der Hämoxygenase lokalisiert (Wilks & Ortiz de Montellano, 1993).
 
 
 
 
Abb.9: Modell der möglichen Umwandlung von Häm zu Biliverdin aufgrund von Elektronenverschiebungen
 

Der Ferro-Dioxygen-Komplex nimmt ein zweites Elektron der Cytochrom C Reduktase auf und transformiert den Komplex in eine aktivierte Oxidationsform um (Yoshiga et al., 1980). Zuzüglich der Hydroxylgruppe an der a-Methinbrücke ergibt sich das a-meso-Hydroxyhäm (Jackson et al., 1978).
Zwei Alternativmodelle wurden von Wilks und Ortiz de Montellano (1993) aufgestellt, die die Möglichkeit ausschließen, daß die hydroxylierte Hämspezies ein Ferryl-Komplex ist. Die Reaktion des Porphyrinringes mit dem Eisen-Dioxygen-Komplex führt zu einer Anreicherung des a-meso-Hydroxyhäms:
 
1) es folgt entweder eine nukleophile Addition des terminalen Sauerstoffs an den unprotonierten Fe-O-O- -Komplex und führt zu dem a-meso-Carbon. Das Ergebnis ist eine Peroxo-Brücke Fe-O-O-Cmeso als Zwischenstufe, oder
2) durch eine elektrophile Addition des terminalen Sauerstoffs des protonierten Fe-O-OH-Komplexes unter Auftrennung der Sauerstoffbindung des Komplexes. Das a-meso-Hydroxyhäm wird anschließend zu Kohlenmonoxid und einer enzymgebundenen Zwischenstufe reduziert, die als verdo-Häm bezeichnet wird (Yoshiga et al., 1984).
Als letzter Schritt wird aus dem verdo-Häm-Zwischenprodukt Biliverdin IXa gebildet, wobei molekularer Sauerstoff zuzüglich eines Elektrons des NADPHs benötigt wird (Sano et al., 1986).
 
 

5.3 Hämoxygenase und Hämpool

Das intrazelluläre Häm und der Eisengehalt spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation vieler Zellfunktionen. Durch Biosynthese (-Aminolävulinat-Synthase) und Degradation der Hämgruppe durch die Hämoxygenase wird der intrazelluläre Häm-Level aufrechterhalten und reguliert.
 
 
 
 
Abb.10: Intrazelluläre Lokalisation der Enzyme und Zwischenstoffe der Hämbiosynthese und Hämdegradation.
 

Abbildung 10 veranschaulicht den Hämbiosyntheseweg und die Regulation des Hämpools. Zu den limitierenden synthetischen Enzymen gehören die -Aminolävulinat-Synthase (ALAS) und die Porphobilinogen Desaminase. Beide Enzyme existieren in einer erythroiden und in einer nicht-erythroiden Form. In nicht-erythroiden Zellen wie zum Beispiel in der Leber, spielt die -Aminolävulinat-Synthase eine essentielle Rolle zur Aufrechterhaltung des intrazellulären Häm-Levels. Große Mengen an Häm seinerseits reprimieren die Synthese der nicht-erythroiden -Aminolävulinat-Synthase.
In erythroiden Zelltypen stimuliert ein Häm-Überschuß die zelluläre Proliferation und Differenzierung und führt zu einer Erhöhung des erythroiden ALAS mRNA Levels. Ebenfalls zeigt ein hoher Häm-Gehalt in erythroiden Zellen eine Stimulierung der Globin mRNA und folglich eine erhöhte Synthese von Hämoglobin. Neuere Studien belegten, daß ein Eisen-bindendes Element in der 5'-untranslatierten Region der erythroiden d-Aminolävulinat-Synthase lokalisiert ist. So ist es möglich, daß das Gen durch den intrazellulären Eisengehalt ebenfalls sinnvollerweise reguliert werden kann. Die regulatorische Rolle der Hämgruppe auf die erythroide ALAS wurde detailliert von Yamamoto et al. (Yamamoto et al., 1982) diskutiert.
 
 

6. Molekulare Charakterisierung der Hämoxygenase 1

Die Isoformen der Hämoxygenase (HO-1 und HO-2) sind zwar Produkte unterschiedlicher Gene, dennoch weisen sie eine Aminosäuren-Sequenzhomologie von 40 % auf. Gleichwohl unterscheiden sich die beiden Isoformen im wesentlichen durch die Induzierbarkeit der Isoform HO-1, die durch eine Vielzahl von strukturell nicht verwandten, pharmakologischen und chemischen Agentien sowie durch Hitzeschock und anderen Formen von zellulärem Streß induzierbar ist.
 
 

6.1 Hämoxygenase Genstruktur

Die Klonierung der HO-1-cDNA der Ratte durch zwei Arbeitsgruppen war der erste Schritt für die molekularbiologische Untersuchung der Hämoxygenase 1 (Müller et al., 1987 und Shibahara et al., 1989). Die klonierte cDNA kodiert für ein Protein von 32 kDa. Die Kenntnis der cDNA führte zur Isolation des Hämoxygenase-Gens. Das Gen organisiert sich in vier Intron- und fünf Exon-Regionen. Nachdem Sequenzabschnitte der Ratten Hämoxygenase bekannt waren, konnte auch die humane Hämoxygenase 1 kloniert werden. Der 5'-untranslatierte Bereich dieser Gene beinhaltet eine Anzahl regulatorischer Regionen.

Die komplette Nukleotidsequenz der Ratten Hämoxygenase Isoform 2 wurde 1994 von McCoubrey und Maines (1994) kloniert und beschrieben. Das Gen setzt sich aus 12.563 bp und ebenfalls aus fünf Exons und vier Introns zusammen. Die Hämoxygenase 2 kodiert für zwei Transkripte, einem 1.3 und einem 1.9 kb Fragment. Der Längenunterschied der beiden Transkripte ist die Folge differentiellen Spleißens und unterschiedlichen Promotorgebrauches. Die Transkripte weisen lediglich in zwei Exonregionen eine 50-70% Homologie mit der Hämoxygenase 1 auf. Die Häm-bindende Domäne der Hämoxygenase 2 befindet sich im Exon 4. Das HO 2-Gen ist nicht induzierbar, obwohl das Gen in den verschiedensten Geweben unterschiedlich exprimiert wird und regulatorische Elemente in der Promotor-Region aufweist.
 
 

6.2 Induzierbarkeit der Hämoxygenase 1

Die HO-1 ist durch eine Vielzahl von Agentien induzierbar. Die Induzierbarkeit des Gens dient höchstwahrscheinlich als Schutz gegen oxidativen Streß bei Vorgängen wie z.B. Hitzeschock, Entzündungen, UV-Licht und intensiver Bestrahlung des Retinalgewebes (Ewing & Maines, 1993 und Dwyer et al., 1995). Die Anwesenheit der HO-1 in dem Retinalgewebe ist sehr gut dokumentiert (Abraham et al., 1987 und Ferrari et el., 1991), allerdings ist eine physiologische Funktion des Enzyms in diesem Gewebe nahezu unbekannt. Eine Theorie ist aus diesem Grund die Aktivierung der HO-1 durch Licht-Exposition und freie Radikale des Retinalgewebes als Streß-induziertes Enzym. Weitere Stoffe, die eine Aktivierung des Gens verursachen, sind synthetische Metallporphyrine und Metallprotoporphyrine (z.B. Zinnporphyrine und Zinnprotoporphyrine), sowie das eigene Substrat der HO-1, das Häm. Nukleäre Run-Off Transkriptionsmessungen demonstrierten, daß ein Ansteigen der HO-1 mRNA durch Hämin ein sichtbares Resultat einer Aktivierung des HO-1-Gens ist (Lutton et al.,1993). Eine Aktivierung dieses Gens beruht auf dem Anstieg der RNA-Polymerase II Aktivität. Als Beweismittel diente die Inhibierbarkeit der DNA-abhängigen RNA-Polymerase II mit a-Amanitin, dem Giftstoff des Knollenblätterpilzes. Dieses zyklische Peptid aus sieben Aminosäuren wirkt inhibierend auf tierische RNA-Polymerasen und somit inhibierend auf die RNA-Synthese. Die rasche Erhöhung der HO-1-Aktivität konnte durch eine Inhibierung der Proteinbiosynthese nicht unterbunden werden und legt die wichtige Rolle der transkriptionellen Regulation der HO-1 Genexpression nahe.
Die Anschaltung der HO-1 ist ebenfalls beteiligt an einer Anzahl offenbar nicht in Beziehung stehender, nicht verwandter Umgebungs- und pharmakologischer Faktoren.
Einige dieser Agentien regulieren die HO-1 möglicherweise durch Manipulation des intrazellulären Häm-Gehaltes. Es ist anzunehmen, daß die Regulation der HO-1 durch die unterschiedlichsten Agentien von Gewebe zu Gewebe verschieden ist. In einigen Experimenten konnte die Anwesenheit von Transkriptionsfaktoren oder DNA-Bindungsstellen festgestellt werden, obwohl putative Faktoren bisher noch nicht isoliert und charakterisiert worden sind. Der aktuelle Stand der HO-1-Regulation ist in Tabelle 1 zusammengestellt.
 
 
Induktor putativer Mediator DNA-responsives Element
Hitzeschock HSE (heat shock element) ? Hitzeschock-responsives Element (HRE) 
Häm / Metallporphyrine Häm responsiv ? Häm-responsives Element ?
Metalle Metall-abhängiger Transkriptionsfaktor ?  Metall-responsives Element 
UV-Licht / Phorbolester (TPA) Sauerstoff-Radikale / Trans-aktive Faktoren ? regulatorisches Element / TPA-responsives Element (AP-1) ?
Liposaccharide (LPS) Interleukin-1 (IL-1) ?   
IL-1 Transkriptionsfaktor ? Responsives Element ? AP-1 ?
IL-6 nuklearer Faktor an IL-6 responsives Elemtent (human) IL-6 responsives Element (human)
T3 TRs und TRAPs TRE ?
TPA (mouse) AP-1 TPA-responsives Element
 
Tabelle 1: Induktoren und Modulatoren der Hämoxygenase 1 
Die Induktoren und Modulatoren der HO-1, mit den aktuellen putativen Transkriptionsfaktoren und ihren responsiven DNA-Elementen.
 

Die Entdeckung dieser DNA-Bindungsregionen und der Transkriptionsfaktoren in dem Hämoxygenase-Promotor ist für das Verständnis des Mechanismus der HO Induktion und als Erklärung, wie die Induktion als Antwort zum Stimulus erfolgt, von Bedeutung. Mit Hilfe dieser Ergebnisse könnten Aussagen darüber getroffen werden, ob es sich um direkte oder um sekundäre Effekte handelt, die eine Stimulierung der Hämoxygenase zur Folge haben.
 
 

6.3 Hormonelle Regulation

Die Induzierbarkeit der Hämoxygenase durch Hormone wurde eingehend von Bakken et al. bereits 1972 untersucht. Die Arbeitsgruppe postulierte den Effekt verschiedener Hormone, wie z.B. Epinephrin und Glucagon, auf die hepatische HO Aktivität. 3,5,3'-L-Triiodthyronin (T3) wirkt aktivierend auf die hepatische Hämoxygenase (Smith & Drummond, 1982) und ALA-Synthase (Smith & Drummond, 1988) in einem Dosis- und Zeit-abhängigen Verhältnis. In diesem Zusammenhang sind ebenfalls die P450 Cytochrome induziert. Diese Aktivierung scheint stereospezifisch zu sein, da die T3-Isoform 3,3',5'-Triiodthyronin nicht in der Lage ist, induzierend auf diese Enzyme zu wirken, während das Thyroxin ein potenter Induktor ist.
Die alleinige Darreichung von Retinsäure hat keinen Effekt auf die HO-1, wobei die Säure erniedrigend auf die Cytochrom P450-Enzyme wirkt und den zellulären Hämpool ausschöpft. Wird die Retinsäure zusammen mit T3 dargereicht, erfolgt eine Stimulierung der Hämoxygenase um mindestens 61 %, wobei der Hämgehalt unter diesen Bedingungen nicht reprimiert wird (Smith & Drummond, 1991).
Ein interessanter Aspekt ist die Wirkung von Prostaglandin (Deoxy-[Delta]9.12.-13,14-dihydroprostaglandin D2 ([Delta]12-PDJ2)), der ein potenter Induktor der zellulären Wachstumsinhibition (Ohno et al., 1986) und Zelldifferenzierung (Santoro et al., 1979) in den verschiedensten Zell-Linien ist. Der inhibitorische Effekt des [Delta]12-PDJ2 wird hervorgerufen durch die Induktion eines 68 kDa Proteins. Dieses Protein wurde als ein Hitzeschock-Protein (HSP 68) identifiziert (Ohno et al., 1988), das wahrscheinlich die Zelle auf die veränderten Bedingungen "vorbereitet" und schützt. Dieser Aspekt lieferte erstmals die Möglichkeit einer Zusammenarbeit von Hormonen und deren zelluläre Einwirkung und die Einschaltung eines Streß-Proteins ohne Beteiligung ihrer spezifischen Rezeptoren und DNA-Erkennungssequenzen. Weitere Untersuchungen dieses Phämonens verifizierten, daß das [Delta]12-PDJ2 induzierend auf ein niedermolekulares Protein wirkt, einem ca. 31 kDa Protein, das als das Hitzeschock-Protein Hämoxygenase identifiziert werden konnte (Koizumi et al., 1991 und Koizumi et al., 1992). Welche molekulare Funktion die Hämoxygenase unter diesen Bedingungen hat, ist noch ungeklärt. Möglicherweise ist die erhöhte Expression die Folge einer oxidativen Veränderung in der Zelle, da das [Delta]12-PDJ2 mit Glutathion konjugiert (Entgiftungsweg) und damit die zellulären Antioxidanten vermindert werden.
Metallporphyrine stellen in der Regel starke Induktoren der HO-1 dar. Um so bemerkenswerter ist die Tatsache, daß synthetische Glukocorticoide (z.B. Dexamethason) die einzigen bekannten nicht-Metallporphyrine sind, die in der Lage sind, eine HO-1-Induktion zu inhibieren (Lutton et al., 1992). Ein Kernbindungsprotein, daß bei der Darreichung von Dexamethason verstärkt synthetisiert wird, verhindert eine HO-1-Genaktivität. Dieses konnte durch DNAse Footprinting- und DNA-Protein-Wechselwirkungsversuchen (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) gezeigt werden.
 
 

7. Hämoxygenase als ein Streß-induziertes Protein

7.1 Akute-Phase-Proteine

Organismen, die Streß-Situationen ausgesetzt werden, "antworten" häufig mit der Syntheseregulierung verschiedener Proteinklassen, welche kollektiv die Streß-Situation verbessern sollen. In vielen Fällen ist der exakte Mechanismus dieses Vorganges noch nicht geklärt. Beispielsweise werden bei einer Entzündung während der Akute-Phase-Antwort eine ganze Reihe von Akute-Phase-Proteine primär in der Leber gebildet. Eine große Menge von Cytokinen werden bei Entzündungsvorgängen freigesetzt und lösen eine Hochregulierung via spezifischer Rezeptoren aus, die in der hepatischen Zellmembran lokalisiert sind (Baumann & Gauldie, 1994 und Cosman, 1993). C-reaktive Proteine und Serum Amyloid A, das häufigste humane Akute-Phase-Protein, ist unter Normalbedindungen in geringsten Mengen im Plasma exprimiert, wird aber bereits vier Stunden nach einem entzündlichen Stimulus induziert und erreicht sein Maximum nach 24 bis 48 Stunden (Mackiewicz et al., 1993). Andere Akute-Phase-Proteine wie z.B. a1-Glukoproteinsäure, a1-Protease, a1-Antichymotrypsin, Haptoglobin und Fibrinogen erreichen ihr Expressionsmaximum erst nach sieben bis zehn Tagen (Tsuchiya et al., 1987).
Die HO-1 wird als eine Art "Akute-Phase-Protein" betrachtet. Mitani et al. (1992) untersuchten den Effekt von Interleukin-6 (IL-6) auf die HO-1 in der humanen Hepatoma Zell-Linie Hep3B und beobachteten ein Zeit/Dosis-abhängiges Verhältnis der HO-1 mRNA Induktion. Die mRNA Induktion konnte durch die gleichzeitige Zugabe von Actinomycin D, einem Inhibitor der Transkription, inhibiert werden. Folgende Feststellungen vermittelten, daß die Induktion des HO-Gens über ein IL-6-responsives Element vermittelt wird:
 
1. das IL-6 ist ein Induktor des HO-1-Gens, wirkt aber wiederum nicht auf andere Hitzeschock-Proteine wie z.B. HSP 70. Daher wird die Induktion nicht über das Hitzeschock-responsive Element (HSE) vermittelt
2. zwei Sequenzen in der Promotor-Region des humanen HO-1-Gens zeigen eine signifikante Homologie mit dem IL-6-responsiven Element, das in anderen Akute- Phase-Proteinen existent ist (Kunz et al., 1989).
 
Die Arbeitsgruppe um Akira et al. (1990) stellte daraufhin die Hypothese auf, daß das IL-6 das humane HO-1-Gen in gleicher Weise wie der Nukleare Faktor NF-IL-6, der an dem IL-1-responsiven Element auf dem IL-6-Gen bindet, reguliert.
Cytokine und Lipopolysaccharide (LPS) sind in der Lage, induzierend auf die HO-1 zu wirken. Von den LPS ist bekannt, daß sie die Bildung mehrerer Cytokine induzieren (Martich et al., 1991). Dieses läßt vermuten, daß die LPS eine indirekte Induktion auf die HO-1 ausübten, nämlich über die Faktoren IL-1 und TNF (Tumor Necrosis Faktor). Durch Mutationsanalysen konnte in der humanen AP-1 HO-1-Bindungssequenz eine Aktivierung des HO-1-Gens und eine Akkumulation der HO-1 mRNA durch LPS festgestellt werden (Camhi et al., 1995). Die Forschergruppe um Cantoni et al. (1991) untersuchte ebenfalls den Effekt von Glukocorticoiden auf die HO-1 Induktion durch IL-1 und TNF. Das Ergebnis war, daß die Induktion der HO-1 durch IL-1 keine Anwesenheit von Glukocorticoiden erfordert. Durch die Anwesenheit von synthetischen Glukocorticoiden wurde der HO-1 mRNA Gehalt eher erniedrigt. Dieser Effekt wurde als ein "Feed-Back"-Mechanismus von Cytokinen auf ihre eigene Synthese (Butler et al., 1989) postuliert. Fukuda et al. (1993) zeigte in Leberzellen, daß das IL-1 wie das IL-6 in einem Zeit/Dosis-abhängigen Verhältnis in der Lage ist, die Hämoxygenase zu erhöhen. In der Leber agieren Cytokine gleichzeitig als Induktoren von Akute-Phase-Proteinen und wirken auf den Hypothalamus und erzeugen den Effekt einer febrilen "Antwort", die über die Induktion von Prostaglandin E2 (Dinarello et al., 1991) vermittelt wird. Der aus diesem Vorgang resultierende Anstieg der Zelltemperatur hat zwei wichtige Auswirkungen:
 
1. eine Anschaltung der HO-1 durch Akute-Phase-Proteine (Shibahara et al., 1987 und Taketani et al., 1988) und/oder
2. eine Anschaltung der HO-1 über ihre Hitzeschock-Protein-Funktion.
 
Die Rolle der HO-1 als ein Akute-Phase-Protein ist noch nicht geklärt. Unter anderem wird das Enzym durch einen erhöhten Gehalt an Sauerstoffradikalen induziert, die z.B. durch aktivierte Makrophagen produziert werden.
Die HO-1 (HSP 32) ist ein Hitzeschock-Protein und damit ein Streßprotein, daß unter anderem durch oxidative Schädigungen der Zelle induziert wird (Keyse & Tyrrell, 1989 und Nascimento et al., 1993). Durch die gesteigerte Synthese der HO-1 wird die Anpassung der Zelle an veränderte Situationen ermöglicht.
 
 

7.2 Ein oxidatives Streß-Protein

Der Zusammenhang zwischen oxidativen Veränderungen (Streß) und der Anschaltung der Hämoxygenase 1 basiert auf der Hypothese, daß eine Induktion des Enzyms die Balance von Antioxidanten und Pro-Oxidanten in der Zelle ausgleicht und erhält. Zum Teil wird dieser Schutzmechanismus durch die Produktion der Antioxidanten der Galle, Biliverdin und Bilirubin, erzeugt. Allerdings ist die komplexe Interaktion während oxidativem Streß und Zellantwort sowie die Rolle der Hämoxygenase-Induktion noch wenig bekannt.
Ein klarer Zusammenhang zwischen dem antioxidativen Glutathion-Gehalt (GSH) und der Hämoxygenase-Induktion konnte in kultivierten Ratten-Fibroblasten (Ketterer et al., 1988) festgestellt werden. Bei einer Zellexposition durch Streßagentien wie z.B. Häm oder Wasserstoffperoxid erfolgt eine Verminderung des zellulären GSH-Gehaltes. Diese Verminderung des Antioxidanten wird durch eine Inhibierung der HO-1-Aktivität noch erhöht. Lautier et al. (1992) zeigten unter Verwendung des Glutathion-Inhibitorstoffes D,L-Buthionin-S,R-sulfoxin ein komplettes Aufbrauchen des intrazellulären GSH-Gehaltes und einen daraus resultierenden Anstieg der HO-1.
Wenn die HO-1 induziert ist, wird der zelluläre Häm-Gehalt herabgesetzt, während der Gehalt an Eisen, Kohlenmonoxid und des Antioxidanten Bilirubin ansteigt. Von physiologischer Relevanz sind unter diesen Bedingungen das Biliverdin und das Bilirubin, die in der Lage sind, mit hoher Effizienz Peroxyl-Radikale einzufangen (Dennery et al., 1995). Die beiden Stoffe der Galle sind unter anderem potente "Einfänger" von singulärem Sauerstoff, und das Bilirubin kann Superoxid-Anionen neutralisieren und schützt somit viele Substrate vor Peroxidation bei der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid oder organischen Hydroperoxiden. Diese beiden Stoffe der Galle sind in der Lage, eine extrazelluläre Darreichung von Perchlorsäure einzufangen und zu neutralisieren, und sie agieren als Synergisten des a-Tocopherols (Vitamin E), das Zellmembranen vor Peroxidationen schützt (Stocker et al., 1990). Neuzil & Stocker (1993) beschrieben das an den Plasma-Transporter Albumin gebundene Bilirubin kann durch Hydroperoxide oder Superoxid-Anionen oxidiert werden und schützt somit das Transporter-Protein vor einer oxidativen Beschädigung. Bilirubin muß möglicherweise erst an Albumin binden, um als Antioxidant wirksam zu sein. Die Arbeitsgruppe um Wu et al. (1991) publizierte, daß in humanen ventrikulären Myozyten ein an Albumin gebundenes Bilirubin diese Zelle gegen Sauerstoff-Radikale zu schützen vermag, während unkonjugiertes Bilirubin und andere Antioxidanten wie das Ascorbat, die Superoxid-Dismutase und die Katalase keinen Schutz für die Zelle verschaffen.
In der Literatur wird freies Häm häufig als ein Pro-Oxidant der Zelle beschrieben, der das Gleichwicht zwischen Oxidanten und Antioxidanten stört. Allerdings ist das Häm selbst nicht das zytotoxische Produkt, sondern die katabolischen Degradationsprodukte Eisen (Fe2+ ) und Kohlenmonoxid (Balla et al., 1993). Das freigesetzte Eisen selbst scheint der Pro-Oxidant des Häms zu sein und ist verantwortlich für die oxidative Aktivierung vieler verschiedener Moleküle. Die Toxizität des Eisens ergibt sich aus seiner katalytischen Fähigkeit, in der Zelle Sauerstoffradikale anzureichern.
 
 
 
 
Abb.11: Entstehung von Radikalen durch UV-Licht und zweiwertiger Metalle 
Hydroperoxide werden leicht durch Licht (Reaktion 1) sowie durch Metall-Ionen gespalten. Die Reaktionen 2 und 3 bilden einen katalytischen Zyklus, so daß sehr kleine Spurenvon Eisen, Kobalt und Kupfer viele Kettenreaktionen einleiten können.
 
Dies ist vermutlich der Grund, weshalb bei einer induzierten HO-1 gleichzeitig die Synthese von Ferritin erhöht ist, um das Eisen durch Speicherung zu entfernen. Das Ferritin ist ein intrazelluläres Protein, das in der Lage ist, 4500 Eisen-Ionen in einer Fe-O-OH-Form zu speichern. Ist das Eisen erst einmal in dem Ferritin verankert, so ist es unfähig, ins Zytoplasma zu akkumulieren und dort als Oxidant zu wirken. Das Ferritin-Gen wird transkriptionell durch eine Veränderung des intrazellulären Eisen-Gehaltes via eines Eisen-responsiven Elementes reguliert (Hentze et al., 1987).
Die Arbeitsgruppe Balla et al. (1992) konnte in Endothelzellen innerhalb einer vierstündigen Häm-vermittelten HO-1 Induktion eine erhöhte Produktion des Ferritins feststellen. Während der ersten Stunde der Hämexposition zeigten sich die Endothelzellen gegenüber oxidativen Schädigungen äußerst sensibel; mit zunehmender Induktionszeit nahm diese Sensibilität ab. Die Zellen schienen vor oxidativen Einflüssen geschützt zu sein.
 
 

8. Pathophysiologie der Hämoxygenase

Seit das Enzym 1960 erstmals identifiziert wurde, konnte bei einer Anzahl von pathologischen Bedingungen eine Veränderung der HO-1-Aktivität beobachtet werden. Vor kurzer Zeit wurden erste Theorien zum molekularen Mechanismus der HO-1-Regulation aufgestellt. Die Kaskade der intrazellulären Veränderungen, welche bei einer aktivierten HO beteiligt sind, liefert ein Bild von der regulatorischen Rolle des Enzyms. Die HO-1 wird in vielen Geweben und Zelltypen in vivo und in vitro von Hämoglobin und Hämin induziert. Bei einer Induktion der HO-1 wird wahrscheinlich die Menge des Hämoglobins (Hämgehalt) dieser Gewebe minimiert und verringern somit die Gefahr der Toxizität und Beschädigung des Gewebes. Eine induzierte HO-1 wird gefolgt von einem Anstieg an freiem Eisen, Kohlenmonoxid und Bilirubin. Alle diese Stoffe sind wichtige Mediatoren bei etwaigen Zell-Beschädigungen. Die ansteigende Eisenkonzentration ist der Grund für eine Erhöhung der Ferritin-Expression und Ferritin-Synthese, welche die Speicherform des Eisens sowie einen starken Oxidanten für Zellen darstellt (Paller & Jacob, 1993).
Bilirubin und Biliverdin sind in vivo und in vitro starke, zelluläre, antioxidative Agentien (Stocker et al., 1987). Ein Ansteigen lokaler Antioxidanten-Konzentrationen auf Grund einer HO-1-Induktion dient als Schutz der Zellen gegen oxidative Schädigungen (z.B.: Induktion der HO-1 durch UV-Licht in der Retina) (Kutty et al., 1995).
Das Nebenprodukt der Hämdegradation, Kohlenmonoxid, ist genauso wie Stickstoffmonoxid ein bedeutender Modulator endothelialer Zellfunktionen. Kohlenmonoxid ist ein sehr effektiver Vasodilatator, der den vaskulären Zellwiderstand erniedrigt und somit eine gesteigerte Durchblutung des Gewebes erzeugt. Zusammen mit dem Stickstoffmonoxid wirken diese beiden Agentien dem blutgefäßverengenden Vermögen des Hämoglobins und des Häms entgegen (Verma et al.,1993).
 
 

8.1 Kohlenmonoxid und Stickstoffmonoxid als "Bote" (messenger)

Für Stickstoffmonoxid (NO) und für Kohlenmonoxid (CO) ist bekannt, daß sie die Guanylat-Zyklase aktivieren (Maines et al., 1993), um ansteigende Mengen des "zweiten Botenstoffes" (second messengers) cGMP zu produzieren.
Bei dem Kohlenmonoxid kann eine verstärkte Vasodilation mehrerer arterieller Gewebe und ein Ansteigen des Kaliumumsatzes im glatten Muskelgewebe beobachtet werden (Takeda et al., 1994). Diese sowie neuere Untersuchungen lassen darauf schließen, daß es sich bei dem Kohlenmonoxid um einen weiteren neuentdeckten Transmitter handelt.
In neuralen Geweben werden die Nervenimpulse an Synapsen durch chemische Neurotransmitter übertragen, wie z.B. durch das Acetylcholin. Zelluläre Transmitter sind chemische Botenstoffe in Geweben und Zellen (z.B. Stickstoffmonoxid und Kohlenmonoxid). Mit Hilfe dieser Transmitter erfolgen Signaltransduktionswege für die Regulation von Zellfunktionen und Zellkommunikation (Maines et al., 1993 und Takeda et al., 1994).
 
 

8.2 Hypoxie

Unter Hypoxie wird die Herabsetzung des Sauerstoffgehaltes in Geweben verstanden. Durch eine mangelhafte Sauerstoffversorgung, wie z.B. bei respiratorischer Insuffizienz, erfolgt eine Erniedrigung des arteriellen Sauerstoffpartialdruckes. Unter hypoxischen Bedingungen wird die HO-1 induziert, wobei der molekulare Mechanismus dieser Induktion noch völlig unbekannt ist. Als Grundlage des Regulationsweges wird die Zellschädigung durch den Mangel an Sauerstoff angenommen und die dadurch verbundene Ausschüttung von freien Radikalen. Die durch die Radikale erzeugte Veränderung des Zellzustandes bewirkt eine Anschaltung des zellulären Schutzsystemes und damit die Anschaltung der HO-1.
Die Hypoxie wirkt verstärkend auf Herzerkrankungen durch eine Drucküberladung im rechtem Herzventrikel. Katayose et al. (1993) konnte eine Induktion der HO-1 mRNA in beiden Herzventrikeln unter hypoxischen Bedingungen feststellen. Die Anschaltung der HO-1 in diesem kardialen Gewebe bildet möglicherweise einen Schutzmechanismus, da eine erhöhte HO-1-Aktivität eine erhöhte Kohlenmonoxidproduktion zur Folge hat, was koronare und arterielle Muskelgewebe relaxieren läßt (Maines et al., 1993) und damit die Bedingungen des Herzens unter Hypoxie durch eine Aufweitung der Arterien wesentlich verbessert.