Aus dem Zentralinstitut für Transfusionsmedizin

Direktor: Prof. Dr. med. A Poschmann
 
 

Durchflußzytometrische

Analysen von

thrombozytären Antikörpern
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

eines Doktors der Medizin
 
 
 
 
 
 

Dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg

vorgelegt von
 
 

Christian Niesytto

aus Hamburg
 
 
 
 

Hamburg, 1999

Inhaltsverzeichnis

A. Einleitung

A.1 Die Thrombozyten

A.2 Die Durchflußzytometrie

A.3 Problemstellung

B Material B.1 Das Durchflußzytometer

B.2 Lösungen und Puffer

B.3 Antikörper

B.4 Sonstige Materialien

C Methode C.1 Vorversuche

C.2 Hauptversuche

C.3 Patientenuntersuchungen

C.4 Entwicklung eines Computer-Auswertungsprogramms

C.5 Arbeiten mit dem Computerprogramm

D Ergebnisse D.1 Vorversuche

D.2 Hauptversuche

D.3 Patientenuntersuchungen

D.4 Arbeiten mit dem Computerprogramm

E Kasuistik einer NAITP der Spezifität HPA-5b (Bra) E.1 Klinische Angaben

E.2 Serologische Untersuchungen

F Diskussion

G Zusammenfassung

H Literaturverzeichnis

I Anhang

I.1 Turbo-Pascal Programm

I.2 Tabellarischer Anhang

K Lebenslauf

A. Einleitung

A.1 Die Thrombozyten

Die Thrombozyten haben eine Schlüsselfunktion im Hämostasesystem, bei Thrombozytopenie oder -pathie kommt es zu Petechien, Hämatomen und Schleimhautblutungen. Die Thrombozytopenie kann Ausdruck einer mangelhaften Produktion, eines krankhaft erhöhten Konsums oder einer Fehlsteuerung des Immunsystems sein. Bei immunologisch bedingten Thrombozytopenien bewirken thrombozytäre Antikörper einen beschleunigten Abbau, eine Funktionsstörung oder eine Bildungsstörung der Thrombozyten. Man unterscheidet Auto-, Allo-, und medikamentenabhängige Antikörper.

Die akute Autoimmunthrombozytopenie tritt vorwiegend postinfektiös bei Kindern auf und hat eine hohe Spontanheilungstendenz. Bei diskreter Symptomatik und Thrombozytenzahlen über 10 x 103/µl ist keine Therapie erforderlich.

Der chronische Verlauf wird mit Glukokortikoiden, Immunglobulinen, Thrombozytentransfusionen, Plasmaaustausch oder Immunsuppression therapiert. Bei 20 % der Patienten tritt eine Remission ein, eine Splenektomie führt bei 80 % der Patienten zur Remission. Eine chronische Autoimmunthrombozytopenie in der Schwangerschaft kann durch diaplazentaren Übertritt der Antikörper beim Kind eine Thrombozytopenie verursachen. [6, 11, 38, 39, 40, 62]

Der Nachweis der Autoantikörper ist schwierig, da ihre Serumkonzentration niedrig ist, Immunglobulin G (IgG) in den alpha -Granula der Thrombozyten enthalten ist, und sich Immunkomplexe und aggregiertes IgG an der Thrombozytenoberfläche unspezifisch binden können. Kann ein Autoantikörper nachgewiesen werden, ist er meist gegen das Glykoprotein IIb/IIIa gerichtet. Das Glykoproteine IIa/IX und das Integrin CD11b/CD18 wurden ebenfalls als Autoantigene beschrieben. [47, 56, 57, 70]

Die formale Pathogenese der neonatalen Alloimmunthrombozytopenie (NAITP) entspricht der Rhesusinkompatibilität. Antikörper der Mutter sind gegen ein kindliches Alloantigen, meist gegen das HPA-1a (PlA 1) oder HPA-5b (Bra) Antigen oder gegen ein Klasse I HLA-Antigen gerichtet. Durch diaplazentaren Übertritt gelangen diese in den fetalen Kreislauf und bedingen eine Thrombozytopenie, in 10-20 % eine intrakranielle Hämorrhagie.

Lokalisiert sind die Alloantigene auf Glykoproteinen der Thrombozytenmembran (siehe Tab. A-1). Diese Glykoproteine, auch Integrine genannt, haben ihre Funktion in der Aggregations- und Adhäsionsvermittlung, sowie in der Interaktion mit anderen Zellen [74]. Der Glykoproteinkomplex IIb/IIIa ist ein Fibrinogen-Rezeptor, gleichzeitig hat er eine wichtige Funktion für den zellulären Kalzium Haushalt [97].

Tab. A-1: DNA-Polymorphismus thrombozytärer Alloantigene [2, 34, 47, 56, 62, 106, 107]
HPA- Antigen Lokalisation Polymorphismus an Position Phenotyp Freq. in %
1 1a GP IIIa 33 (Leu/Pro) [68, 75, 104] 97,9
= PlA 1b     26,5
2 2a GP Ib 145 (Thr/Met) [46, 63] 14,6
= Ko 2b     99,3
3 3a GP IIb 843 (Ile/Ser) 87,7
= Bak 3b     64,1
4 4a GP IIIa 143 (Arg/Gln) [112] 99,9
= Yuk 4b     0,2
5 5a GP Ia 505 (Glu/Lys) [85, 92] 99,2
= Br 5b     20,6
6W 6bW GP IIIa 489 (Gln/Arg)  
7W 7bW GP IIIa 407 (Ala/Pro)  
8W 8bW GP IIIa 636 (Cys/Arg)  
9W 9bW GPIIb 837 (Met/Val)  

Etwa zwei Drittel des Gesamtgehalts des Blutes an HLA-A, B und C Antigenen werden auf der Thrombozytenmembran in starker Variabilität exprimiert. [63, 84].

Die Klasse-II-Antigene der D-Region, sowie die Merkmale Rhesus, Kell, Kidd und Lutheran werden nicht exprimiert.

Die Thrombozytenmembran enthält das A- und B-Antigen [63, 86], sowie das Disaccharid beta -D-Galactosyl-(1-3)-N-Acetyl-D-Galaktosamin, die Determinante des T-Antigens. Es läßt sich nur mit Hilfe der Sialidase freilegen und ist als Kryptantigen aufzufassen.

Die Diagnose der NAITP wird durch eine Typisierung der Plättchen von Mutter, Vater und Kind, sowie den Nachweis des Alloantikörpers im mütterlichen Serum gesichert.

Therapie ist die postnatale Transfusion von gewaschenen mütterlichen oder kompatiblen Spenderthrombozyten oder eine pränatale, intravenöse Infusion von Immunglobulinen. Wenn indiziert, können Thrombozyten auch intrauterin infundiert werden. [21]

Die Posttransfusionelle Purpura (PTP) tritt 3-12 Tage nach einer Transfusion von Erythrozytenkonzentrat, Vollblut oder einem Thrombozytenkonzentrat auf. Die pathogenetische Besonderheit der PTP ist darin zu sehen, daß nicht nur die fremden, sondern auch die autologen Thrombozyten zerstört werden.

Die Ätiologie der posttransfusionellen Purpura ist noch nicht eindeutig geklärt, Autoantikörper, Immunkomplexe oder eine Anlagerung von Antigenen an die eigenen Thrombozyten wird diskutiert. Meistens sind ältere Frauen, die sich durch Schwangerschaften oder Transfusionen immunisiert haben, betroffen. Die Therapie besteht in der hochdosierten intravenösen Gabe von IgG, der Gabe von hochdosierten Kortikosteroiden oder einen Plasmaaustausch. [45, 59, 62]

A.1.4 Immunologische Methoden zum Nachweis thrombozytärer Antikörper

Prinzipiell können zwei unterschiedliche Sachverhalte untersucht werden: Antikörper auf den autologen Patiententhrombozyten und freie thrombozytäre Antikörper im Serum. [39]

A.1.4.1 Nachweis thrombozytärer Antikörper im Serum

Das Prinzip besteht darin, daß freie plättchenreaktive Antikörper in dem zu untersuchenden Serum mit Testthrombozyten inkubiert werden. Nachfolgend werden die gebundenen Immunglobuline auf den Testthrombozyten mit Antikörpern gegen menschliche Immunglobuline und Komplementproteine beladen. Diese zweiten Antikörper gegen menschliche Immunglobuline sind mit radioaktiven Isotopen, Enzymen oder Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Weit verbreitete Verfahren sind der Plättchenimmunfluoreszenztest (PIFT [108, 109]), dessen Modifikation (PAIFT [89]) oder ein Festphasen-Immunoassay (z.B. Capture-P oder Thrombomatch EIA) [3, 5, 77]. Eine Differenzierung von Allo- und Autoantikörpern kann durch diese Tests nicht erreicht werden.

Um einen starken HLA-Antikörper von einem thrombozytären Alloantikörper abzugrenzen, müssen die Alloantigene der Thrombozyten isoliert werden. Die Bindung humaner Antikörper an diese Glykoproteine kann mit Jod125 oder Enzym markierten Antikörpern nachgewiesen werden. Wegen seiner Zuverlässigkeit hat sich der "monoclonal antibody immobilization of platelet antigens" (MAIPA)-Test [35, 36, 37, 39, 41] gegenüber anderen antigenspezifischen Tests durchgesetzt [58].

A.1.4.2 Nachweis von Autoantikörpern auf den autologen Plättchen

Autologe Plättchen werden nach dem Prinzip des direkten Coombs-Test mit markierten Antikörpern gegen menschliche Immunglobuline beladen und mit Enzymreaktionen oder Immunfluoreszenz nachgewiesen.

Nach Elution können diese Antikörper im MAIPA Assay weiter spezifiziert werden. [39]

A.1.5 Genotypisierung zur Bestimmung der thrombozytären Antigene

Eine Thrombozytenanreicherung ist nicht nötig, die DNA kann aus Leukozyten, Amnionflüssigkeit, Chorionzotten oder aus epidermalen Zellen gewonnen werden. Drei verschiedene Methoden zur Typisierung: der Restriktions Längen Polymorphismus, die allel-spezifischen DNA-Oligonukleotide oder die allel-spezifischen Primer stehen zur Verfügung. Allel-spezifische Primer stehen für das HPA –1, -2, -3 und –5 System zu Verfügung. Ein Genotyping liefert bei maximaler Spezifität und Sensitivität innerhalb von drei Stunden Ergebnisse.

Diese Methode ist unabhängig von Antiseren und Patiententhrombozyten. Auch HLA kompatible Thrombozytenpräparate können so für multitransfundierte immunisierte Empfänger ausgewählt werden. [4, 12, 18, 42, 54, 75, 91, 104]

A.2 Die Durchflußzytometrie

Die Durchflußzytometrie ist eine Technik, mit der Messungen von Partikeln oder Zellen, die in einem Flüssigkeitsstrom einen Meßsensor passieren, durchgeführt werden können; jedes Partikel wird einzeln ausgewertet. Die Fähigkeit, durch Lichtstreuung und Fluoreszenz, Subpopulationen von Zellen zu unterscheiden, hat die Durchflußzytometrie zu einem wichtigem Meßprinzip in der Biologie und Medizin gemacht.

Die Durchflußzytometrie hat ein breites Anwendungsgebiet gefunden. Mit käuflichen, fluoreszierenden Markern lassen sich direkte zelluläre Parameter, wie Nucleinsäuregehalt, Enzymaktivität, Kalziumfluß, Membranpotential und pH-Wert messen. Durch Konjugation der Fluoreszenz-Farbstoffe mit Liganden, mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, können einerseits die Verteilung und die Dichte von Zelloberflächen und zytoplasmatischen Determinanten und Rezeptoren gemessen, andererseits eine Differenzierung von Subpopulationen durchgeführt werden. Durch parallele Verarbeitung unterschiedlicher Parameter, Streulicht und Fluoreszenzemissionen, können korrelierte Messungen durchgeführt werden. [9]

A.2.1 Das Flüssigkeitssystem

Das Flüssigkeitssystem eines Durchflußzytometers dient dazu, aus einer Probe ein definiertes Volumen zu entnehmen und jedes darin enthaltene Partikel hintereinander durch den Strahl der Meßlampe zu leiten. Eine von Flüssigkeit durchströmte Röhre, in die die Probe injiziert wird, kann die Partikel mit einer Genauigkeit von ±1 Mikrometer durch den Meßstrahl leiten.

Grundsätzlich werden im Durchflußzytometer eine Proben- und eine Hüllflüssigkeitsleitung verwendet. Erst nach Zusammenführen beider Leitungen wird nach dem Prinzip der „hydrodynamischen Fokussierung" bei laminarer oder turbulenter Strömung der Partikel durch den Meßstrahl geleitet.

Durch eine unterschiedliche Einstellung der Flußgeschwindigkeiten beider Leitungssysteme können die Strömungsbedingungen und somit die Fokussierung des Probenflusses variiert werden [8, 9, 22, 32].

A.2.2 Meßröhre und Lichtstreuung

Analytische Meßröhren sind heute für eine Laserstrahl-Durchleuchtung konzipiert. Der Laserstrahl tritt im rechten Winkel auf die quadratische Meßröhre, um Streuung beim Lichteintritt in das dichtere Medium zu vermindern. Passiert eine Zelle den Strahlengang, wird das Licht je nach Beschaffenheit der Zellstruktur gestreut und die angelagerten Fluorochrome angeregt (siehe Abb. A-1).

Vorwärts-Streulicht in gerader Richtung korreliert mit der Größe der Zelle, Rechtwinkel-Streulicht mit der Zellgranularität und der Fluoreszenz.

Um ungestreutes Laserlicht nicht mitzumessen, muß dieses mit einem Filter (blocker bar) blockiert werden
.

Abb. A-1: Strahlengang bei Ablenkung in der Meßröhre


A.2.3 Detektoren und Datenverarbeitung

Für die analytische Durchflußzytometrie wird ein intensiv erregender Lichtstrahl benötigt, weil die Partikel klein sind und den Lichtstrahl schnell passieren. Außerdem muß der Lichtstrahl eine definierte Wellenlänge haben, um Fluorochromfarbstoffe anzuregen. Hierzu werden meist Laser eingesetzt. Das durch die Partikel erzeugte Streulicht und die Fluoreszenz werden mit Photodetektoren (PIN-Dioden oder Photomultiplier) gemessen. Sie wandeln Photonenimpulse in elektronische Signale um. Nachgeschaltete Prozessoren ermöglichen eine statistische Analyse und eine optische Darstellung der Meßergebnisse. [9]

A.2.4. Optische Filter

Die Aufgabe der optischen Filter ist es, Streu- und Fluoreszenzlicht, welches an den gefärbten Partikeln entsteht, zu trennen, so daß diese Parameter unabhängig gemessen und die Messungen korreliert werden können. Die Trennung verschiedener Wellenlängen kann mit Spiegeln, Interferenz- und Absorbtionsfiltern geschehen. In einem typischen optischen System für die Messung von Streulicht, FITC- und PE-Fluoreszenz werden diachronische Spiegel im 45 Grad Winkel, Absorbtions- und Interferenzfilter orthogonal im rechtem Winkel, in den Lichtstrahl eingebracht. (siehe Abb. A-2)
 

Abb. A-2: Ein typischer Strahlengang eines Durchflußzytometers [nach 9]


Der erste Spiegel im Strahlengang des Rechtwinkel-Streulicht ist ein 500 nm shortpass dichronic Filter. Er reflektiert Licht mit einer Wellenlänge, kleiner als 500 nm (488 nm Streulicht) auf den Rechtwinkel-Streulicht-Detektor. Licht größerer Wellenlänge tritt durch den Spiegel und trifft auf den zweiten Spiegel, ein 560 nm shortpass dichronic Filter. Dieser lenkt Licht, mit einer Wellenlänge größer als 560 nm, durch einen 578/28 nm Bandpass-Filter auf den Orange-Fluoreszenz-Detektor.

Der Rest des Lichtes, mit einer Wellenlänge zwischen 500 nm und 560 nm, gelangt auf einen 530/30 nm Bandpass-Filter und dahinter auf einen Grün-Fluoreszenz-Detektor.

Die Emissionsspektren beider Fluorochrom Farbstoffe FITC und PE überlappen, so daß immer ein Teil der Grün-Fluoreszenz im Orange-Fluoreszenz-Detektor und umgekehrt gemessen wird. Dieser Fehler kann aber in der nachfolgenden elektronischen Signalverarbeitung korrigiert werden. [9]

A.2.5. Signal Verarbeitung

Fällt Licht auf die Photomultiplier Oberfläche wird einen Stromimpuls erzeugt. Dieser ist proportional der Anzahl der Photonen, die auf den Photomultiplier einfallen.

Die Form des Signals wird durch die Größe des Partikels, dessen Geschwindigkeit, die Breite des Erregerlichtstrahls und, bei Fluoreszenzbestimmungen, von der Verteilung der Fluorochrome auf den Partikeln bestimmt.

Das elektronische Rauschen der Photomultiplier wird durch ein System, welches nur Signale verstärkt, die größer als eine bestimmte Spannung sind, unterdrückt.

Gewöhnlich wird die Rauschunterdrückung durch einen einzelnen Parameter eingeschaltet, um dann alle anderen Filter zu triggern. Vorwärts-Streulicht wird meist als Trigger eingesetzt, wenn Fluoreszenzmessungen durchgeführt werden. Wird Fluoreszenzlicht als Trigger eingesetzt, werden nicht fluoreszierende Partikel nicht registriert.

Die Ausgangsimpulse der Vorverstärker sind meistens zu kurz, um mit ihnen eine weitere Datenverarbeitung durchzuführen. Sie werden in nachfolgenden Schaltungen zu analogen länger dauernden Signalen (proportional zur Höhe, zur Fläche (Integral) und zur Breite des Impulses) verarbeitet. Impulse, die in die modifizierten Ausgangssignale fallen, können nicht verarbeitet werden. Sie fallen in die "Dead Time".

Für analytische Messungen muß eine lineare Beziehung zwischen Fluoreszenz Intensität und der Anzahl der Fluorochrom-Moleküle auf dem Partikel bestehen. Ist die Breite des erregenden Laserstrahls geringer als die des Partikels, werden nicht alle Fluorochrom-Moleküle zur gleichen Zeit erregt. Die Auswertung über das Integral ist in diesem Fall besser als über die Höhe des Signals. Nach diesem Prinzip kann auch unterschieden werden, ob Agglutinate gemessen werden.

Die vorverstärkten Signale können jetzt direkt oder nach logarithmischer Modulierung hauptverstärkt werden. [9]

A.2.6. Analyse und Darstellung der Messung

Die Ergebnisse der Analog/Digital-Umwandlung können in Dateien gespeichert werden, um sie später auszuwerten. Eine Darstellung auf einem Bildschirm, mit Hilfe geeigneter Software, veranschaulicht jedoch die Messung.

Das Histogramm stellt die Anzahl der Impulse für jeden Kanal (Intensität der Emission) dar. Ist ein Kanal als Grenze zwischen Positiv- und Negativ Bereich festgelegt, wird für jeden Bereich eine statistische Berechnung durchgeführt.

Das Cytogramm ist eine zweidimensionale Darstellung. Für jedes Ereignis wird die Intensität des ersten Parameters gegen die des zweiten aufgetragen. Um z.B. verschiedene Zellpopulationen zu differenzieren, trägt man im Cytogramm die Intensität des Rechtwinkel-Streulicht gegen die des Vorwärts-Streulicht auf.

Durch Legen eines Rahmens um eine Zellpopulation, ist eine selektive Betrachtung dieser möglich. Eine statistische Auswertung der Parameter einer Population oder die Darstellung in einem Fluoreszenz-Histogramm schließt sich an das Einrahmen an. Erst durch diese Technik wird es möglich aus Vollblut nur die Lymphozyten oder Thrombozyten zu betrachten. Cytogramme können auch Isolinien darstellen, sogar dreidimensionale Darstellung mit entsprechender Software ist möglich. [9, 71, 78]

A.3 Problemstellung

Ziel der Dissertation war es, mit dem Durchflußzytometer eine Methode zu entwickeln, thrombozytäre Antikörper nachzuweisen. Diese Methode sollte auf einer Inkubation von Thrombozyten mit monoklonalen oder humanen Antikörpern und die anschließende Markierung mit einem Fluorochromfarbstoff beruhen.

Im ersten Teil der Arbeit sollten die Grundlagen für den Test entwickelt werden. Optimale Thrombozytenkonzentrationen, geeignete Puffer- und Meßlösungen, sowie positiv und negativ Kontrollen sollten gefunden werden. Eine Anleitung für den direkten und den indirekten Immunfluoreszenztest war zu erstellen.

Der zweite Teil beschäftigte sich mit der Frage nach Stätigkeit und Beständigkeit der Meßergebnisse. Dabei sollten Normbereiche erarbeitet werden. Die Blutgruppenantigene A, B und 0 sollten nachweisbar sein, die den Thrombozyten fehlenden Rhesuseigenschaften dagegen durften nicht nachweisbar sein. Störende Einflüsse von HLA-Antikörpern sollten minimiert werden. Um klinische Fragestellungen beantworten zu können, mußte untersucht werden, ob sich unser Verfahren auf Thrombozyten hämatologisch erkrankter Menschen anwenden läßt und sich das Verhalten der Thrombozyten von denen gesunder Blutspender unterscheidet.

Besonders interessant erschien uns die Fragestellung, ob die Sensitivität und Spezifität der Methode durch eine Modifizierung der Auswertung verbessert werden konnte und somit statistisch fundierte Aussagen getroffen werden können.

Im letzten Teil der Arbeit sollte die Methode angewandt und überprüft werden. Es war zu testen, ob die erarbeiteten Normbereiche auf klinische Fragestellungen angewandt werden können. Wie weit konnten die vorhandenen Antikörperseren verdünnt werden, wo lag die Nachweisgrenze ? Können Mischungen von fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Thrombozyten unterschieden und deren prozentualer Anteil verfolgt werden ? Gelang der Nachweis des T-Krypantigen nach Sialidasebehandlung ? Konnten die HLA-Antigene von der Thrombozyten Membran abgesprengt werden, um Störungen durch HLA-Antikörper zu minimieren? Auch sollte jetzt untersucht werden, ob sich die theoretische Abhängigkeit der Fluoreszenz zu Größe oder Granularität mit unseren Versuchen bestätigen läßt, oder ob es noch andere Größen gibt, die Einfluß nehmen.

Abschließend wollten wir die Vorzüge der neuen Methode, an einem klinischen Fall einer neonatalen Alloimmunthrombozytopenie demonstrieren und die Möglichkeit einer Thrombozytentypisierung für eine Transfusionstherapie aufzeigen.

B Material

B.1 Das Durchflußzytometer

Verwendet wurde das Durchflußzytometer "ORTHO® CYTORONABSOLUTE" der Firma Ortho Diagnostic Systems, D-6903 Neckargemünd.
 

B.1.1 Geräte Einstellungen

· Sample Rate: High Sheath Rate: Low

· Ending Parameter: Total Count Total Count: 30.000

· Amplifier Gain: FW-Scatter: Det Gain = 16, Amp Gain = Log

· RT-Scatter: Det Gain = 50, Amp Gain = Log

· Gr-Fluoreszenz: Det Gain = 90, Amp Gain = Log, Compensation = 0

  · Or-Fluoreszenz: Det Gain = 90, Amp Gain = Log, Compensation = 20   · Trigger Region: Central Point: 104/77, Angle: 32, Length: 64/35

· Adj. Noise Trash: Channel = 52, Angle = -6
 

B.1.2 Reagenzien · Spül- und Hüllstrom Lösung: Isolac®-D, Dr. Molter GmbH, D-6903 Neckargemünd

· Reinigungslösung: Natriumhypochlorit 7%ig ad Aqua dest.
 
 

B.1.3 Hard- und Software · externes IBM-kompatibles Rechnersystem 486-33 MHz

· Software-Programm A.R.S 4.0e by Ortho Diagnostic Systems
 
 

B.2 Lösungen und Puffer

B.2.1 Thrombozyten Separation

· Salvi® asept Kochsalz 0,9, 1000 ml, Clintec Salvia GmbH + Co. BRD-6550 Homburg/Saar

· Boseral® 500 ml Typ 20T, Bovine Serum Solution, Fa. Organon Teknika, Med. Prod. GmbH, BRD-6904 Eppelheim

· PBS-Lösung: 1,37 g Na2HPO4 x 2 H2O (Merck 6580) + 0,39 g NaH2PO4 x H2O (Merck 6346) ad 1000 ml Salvi® asept Kochsalz 0,9

· 5% ige EDTA-NaCl-Lösung: 5 g Titriplex III (Merck 8418) ad 100 ml Salvi® asept Kochsalz 0,9

· 0,25%ige EDTA- 0,44% BSA-PBS-Lösung: 0,25 g Titriplex III + 2 ml Boseral® + 98 ml PBS-Lösung

· 0,44%ige BSA-NaCl-Lösung: 2 ml Boseral® + 98 ml Salvi® asept Kochsalz 0,9

· 0,1%ige Natriumazid-, -0,44%ige BSA,-NaCl-Lösung: 0,1 g N3Na (Merck 6688) + 2 ml Boseral® + 98 ml Salvi® asept Kochsalz 0,9
 
 

B.2.2 Sonstige Lösungen · Zitronensäurelösung pH 3,0: 2,76 g C6H8O7 x H2O (Merck 6448) + 1,09 g Na2HPO4 x 2 H2O (Merck 6580) + 2 ml Boseral® ad 98 ml Aqua dest.

· Zitronensäurepuffer pH 6,5: 1,5 g C6H5Na3O7 x 2 H2O (Merck 2445) ad 250 ml PBS-Lösung

· 0,5 x10-3 molare Ca2+-PBS-Lösung: 55,5 mg CaCl2 ad 1000 ml PBS-Lösung
 
 

B.3 Antikörper

B.3.1 Fluoreszierende Antikörper

· FITC-Conjugated F(ab')2 Fragment of Rabbit anti-Human IgG (g -Chains), F/P ratio = 0,65 ± 0,05;Fa.: Dako, DK-2600 Glostrup, Denmark, Code No. F 315

· a - Human Platelet GP Ib, CD 42b, AN 51, FITC-konj., monoklonal, Code F 802, Fa. Dako, Hamburg BRD

· a - Human IgG1 Aff FITC, Code: AF 006, Fa. The Binding Site Ltd. Birmingham, England

· a - Human IgG2 Aff FITC, Code: AF 007, Fa. The Binding Site Ltd. Birmingham, England

· a - Human IgG3 Aff FITC, Code: AF 008, Fa. The Binding Site Ltd. Birmingham, England

· a - Human IgG4 Aff FITC, Code: AF 009, Fa. The Binding Site Ltd. Birmingham, England

· Arachis hypogaea, PNA (peanut agglutinin), FITC-conjugated with a ratio of 2-6 molecule of FITC to each lectin molecule,Cat. No. 2030B, Lot. No. 30356 1, Fa. KemEnTec, Lerso, Parkallé 42, 2100 Copenhagen, Denmark

· Fluoreszein (DTAF) conjugated affinity purified anti-mouse, F(ab')2 (goat), Code Nr.: 610-1204, 3,0 moles/mole IgG, Fa. Rockland, P. O. Box 316, Gilbertsville, PA. 19525
 
 

B.3.2 Nicht fluoreszierende humane Antikörper · anti-PlA1-Serum, enthält unspezifische HLA-Antikörper, zur Verfügung gestellt von PD Dr. Budde, AK Harburg

· AB-Serum, gepoolt aus 10 Spender Seren, mit NaCl 1:5 verdünnt

· Immunglobulin Alpha, IgG vom Menschen; Fa.: alpha Therapeutic GmbH,6070 Langen,BRD,Nr.:4801011/91

· anti-A Testserum, Ch.-B./Lot.: 34199, Immucor GmbH, D-6074 Rödermark

· anti-B Testserum, Ch.-B./Lot.: 26292, Immucor GmbH, D-6074 Rödermark
 
 

B.3.3 Nicht fluoreszierende monoklonale Antikörper · monoklonales IgG anti-D, Fa. Biotest AG, D-63303 Dreieich, über Dr. Sonneborn

· monoklonales IgG anti-A, Fa. Biotest AG, D-63303 Dreieich, über Dr. Sonneborn

· monoklonales IgG anti-B, Fa. Biotest AG, D-63303 Dreieich, über Dr. Sonneborn

· Mouse IgG anti GP IIb/IIIa, CD 41a, Cat.-Nr. 0145, Dianova-Immunotech Vertriebsgesellschaft mbH, D-20095 Hamburg
 
 

B.4 Sonstige Materialien · Wasserbad

· 50 Objektträger 76 x 26, geputzt/gebrauchsfertig, Art.Nr. 021102, Menzel-Gläser

· Rinderblut, Hamburger Schlachthof Betriebsgesellschaft, Hr. Schmidt

· Test-Neuraminidase aus Vibrio Cholera, 1 U/ml, Fa. Behring, Marburg, Ch-B.: 253032A

· Coulter Counter® T 660, Coulter Electronics GmbH, 47807 Krefeld

· 10 ml Kunststoff-Probenröhrchen; A/S Nunc, Kamstrup, DK-4000 Roskilde, Denmark, Nr.: 3-42919

· Zentrifuge Hettich Rotanta Typ 3500, Durchmesser = 33cm, Hettich Tutlingen BRD
 
 

C Methode

C.1 Vorversuche

C.1.1 Gewinnung der Thrombozyten von Blutspendern

Die Blutentnahme erfolgte vormittags an Blutspendern des Blutspendedienstes Eilbek. Abgenommen wurden 9 ml Blut in Probenröhrchen, in die 1 ml einer 5 %igen EDTA-NaCl-Lösung vorgelegt wurde.

Anschließend wurden die Thrombozyten durch eine Dichtegradient-Zentrifugation bei Raumtemperatur gewonnen. Das EDTA-Blut wurde 30 min mit 800 U/min, entsprechend 130 x g, zentrifugiert. Das plättchenreiche Plasma wurde abgehoben, in ein zweites Probenröhrchen überführt, mit 0,25 %iger EDTA-, 0,44 %iger Rinderalbumin-NaCl-Lösung auf 10 ml verdünnt und mit 2800 U/min, entsprechend 1400 x g, für 10 min zentrifugiert.

Nach Abgießen des Überstandes wurde das Thrombozytenpellet mit 1 ml 0,44 %igen Rinderalbumin-NaCl-Lösung resuspendiert, mit 0,44 %iger Rinderalbumin-NaCl-Lösung auf 10 ml aufgefüllt und für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde insgesamt drei Mal durchgeführt.

Die Thrombozyten wurden mit 0,1 %iger Natriumazid-, 0,44 %iger Rinderalbumin-NaCl-Lösung resuspendiert und auf eine Konzentration von 100 x 103 Thrombozyten/µl eingestellt.

C.1.2 Einstellung des Hintergrundrauschens

Aus einer nach C.1.1. gewonnenen Thrombozytensuspension wurde eine Verdünnungsreihe mit 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung von 1:1 bis 1:64 erstellt. In jeweils ein Probenröhrchens wurden 100 µl der Verdünnungen pipettiert und mit 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung auf 5 ml aufgefüllt. Ein Probenröhrchen wurde nur mit 5 ml 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung, ein anderes nur mit 5 ml PBS-Lösung befüllt. Es erfolgte die Messung im RT/FW-Streulicht Cytogramm mit Endpunkt nach 65.520 gemessenen Impulsen.

C.1.3 Einstellung der Thrombozytenkonzentration

Aus einer nach C.1.1.gewonnen HPA-1a positiven Thrombozytensuspension der Blutgruppe 0 wurden folgende Konzentrationen hergestellt: 20 x 103, 50 x 103, 100 x 103 und 200 x 103 Thrombozyten/µl. In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl der verschiedenen Thrombozytensuspensionen pipettiert und mit 50 µl anti-HPA-1a-Serum für 30 min bei 37 °C inkubiert.

Die Probenröhrchen wurden mit 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung auf 10 ml aufgefüllt und für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Thrombozytenpellet mit 50 µl des anti-Human-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:30 resuspendiert und bei Raumtemperatur für 20 min im Dunkeln inkubiert.

Anschließend wurden 10 ml 0,44 %ige Rinderalbumin-PBS-Lösung hinzugegeben und für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Pellet mit 1 ml 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung resuspendiert und auf 5 ml aufgefüllt.

Die Messung erfolgte im RT/FW-Streulicht Cytogramm im vorgegebenen Rahmen mit Endpunkt nach 65.520 gemessenen Impulsen.

C.1.4 Inkubation mit AB-Serum

Von vier Blutspendern der Blutgruppe 0 wurden die Thrombozyten nach C.1.1.gewonnen. In jeweils ein Probenröhrchen wurden 100 µl der Thrombozytensuspension pipettiert, mit 100 µl verdünntem AB-Serums für 30 min bei 37 °C inkubiert.

Die Probenröhrchen wurden mit 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung auf 10 ml aufgefüllt und 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Thrombozytenpellet mit 50 µl des anti-Human-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:30 resuspendiert und bei Raumtemperatur für 20 min im Dunkeln inkubiert.

Anschließend wurden 10 ml 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung hinzugegeben und 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Pellet mit 1 ml 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung resuspendiert und auf 5 ml mit PBS-Lösung aufgefüllt. Gemessen wurde die Grün-Fluoreszenz im vorgegebenen Rahmen mit Endpunkt nach 65.520 gemessenen Impulsen.

C.1.5 Titration von anti-HPA-1a-Serum

Von zwei HPA-1a-positiven Blutspendern der Blutgruppe 0 wurden die Thrombozyten nach C.1.1.gewonnen. Eine Verdünnungsreihe des anti-HPA-1a-Serums von 1:2 bis 1:64 wurde hergestellt. In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert und mit 50 µl des verdünnten Serums versetzt. Eine Negativkontrolle mit 50 µ l verdünntem AB-Serum wurde nach gleichem Schema erstellt. Die Inkubation erfolgte für 30 min bei 37 °C.

Die Probenröhrchen wurden mit 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung auf 5 ml aufgefüllt und 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Thrombozytenpellet mit 50 µl des anti-Human-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:30 resuspendiert und bei Raumtemperatur für 20 min im Dunkeln inkubiert.

Anschließend wurden 5 ml 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung hinzugegeben, für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Pellet mit 1 ml PBS-Lösung resuspendiert und auf 5 ml mit 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung aufgefüllt. Gemessen wurde die Grün-Fluoreszenz im Histogramm mit Endpunkt nach 30.000 gemessenen Impulsen.

Danach erfolgte eine erneute Zentrifugation mit 2800 U/min für 10 min, anschließende Resuspension, Auffüllung auf 5 ml mit 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung und erneute Messung.

C.1.6 Inkubation mit AB-Serum, anti-A, anti-B und anti-HPA-1a-Serum

Von fünf Blutspendern der Blutgruppe A1 und fünf Blutspendern der Blutgruppe B wurden die Thrombozyten nach C.1.1. gewonnen. Humanes anti-A und anti-B Testserum wurde mit Digitoninsäure an Erythrozyten eluiert [110]. In jeweils vier Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, so daß vier Versuchsreihen entstanden.

Die erste Versuchsreihe wurde mit 50 µl verdünntes AB-Serum, die zweite Versuchsreihe mit 50 µl HPA-1a Serum in einer Verdünnung von 1:4, die dritten Versuchsreihe mit 50 µl anti-A Eluat und die vierten Versuchsreihe mit 50 µl anti-B Eluat für 30 min bei 37 °C inkubiert.

Die Probenröhrchen wurden mit 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung auf 5 ml aufgefüllt und 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Pellet mit 50 µl des anti-Human-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:60 resuspendiert und bei Raumtemperatur für 20 min im Dunkeln inkubiert.

Anschließend wurden 5 ml 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung hinzugegeben und für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Pellet mit 1 ml PBS-Lösung resuspendiert und auf 5 ml mit 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung aufgefüllt.

Gemessen wurde die Grün-Fluoreszenz im Histogramm mit Endpunkt nach 30.000 gemessenen Impulsen.

C.2 Hauptversuche

C.2.1 Standardvorschrift zur Gewinnung der Thrombozyten von Blutspendern

Die Thrombozyten wurden nach C.1.1 gewonnen, separiert und gewaschen. Auf Natriumazid wurde bei der Preparation verzichtet.

C.2.2 Standardvorschrift zur Messung der Autofluoreszenz

In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl einer nach C.2.1 gewonnen Thrombozytensuspension pipettiert und mit PBS-Lösung auf 5 ml aufgefüllt.

Als Endpunkt für jede Messung wurden 30.000 gemessene Impulse gewählt, die mit der Software ARS 4.0e auf einer Diskette gespeichert wurden.

C.2.3 Standardvorschrift zur Inkubation im direkten Immunfluoreszenztest

In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl einer nach C.2.1 gewonnen Thrombozytensuspension pipettiert, mit 50 µl eines anti-human-IgG-FITC markierten Antikörpers in einer Verdünnung von 1:60 vermischt und bei Raumtemperatur für 20 min im Dunkeln inkubiert.

Anschließend wurden 5 ml 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung hinzugegeben und für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Pellet mit 1 ml PBS-Lösung resuspendiert und auf 5 ml aufgefüllt.

Als Endpunkt für jede Messung wurden 30.000 gemessene Impulse gewählt, die mit der Software ARS 4.0e auf einer Diskette gespeichert wurden.

C.2.4. Standardvorschrift zur Inkubation im indirekten Immunfluoreszenztest

In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl einer nach C.2.1 gewonnenen Thrombozytensuspension pipettiert und mit 50 µl der Antikörperlösung für 30 min bei 37 °C inkubiert.

Die Probenröhrchen wurden mit 5 ml 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung aufgefüllt und für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Thrombozytenpellet mit 50 µl des anti-Human-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:60 resuspendiert und bei Raumtemperatur für 20 min im Dunkeln inkubiert.

Anschließend wurden 5 ml 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung hinzugegeben und 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Pellet mit 1 ml PBS-Lösung resuspendiert und auf 5 ml aufgefüllt.

Als Endpunkt für jede Messung wurden 30.000 gemessene Impulse gewählt, die mit der Software ARS 4.0e auf einer Diskette gespeichert wurden.

C.2.5 Inkubation mit AB-Serum, anti-HPA-1a-Serum und anti-Human-IgG-FITC

Von 24 Blutspendern wurden die Thrombozyten nach C.2.1 gewonnen. In jeweils drei Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, so daß drei Versuchsreihen entstanden. Zu den Thrombozyten der ersten Versuchsreihe wurden 50 µl des verdünnten AB-Serums, zu den Thrombozyten der zweiten Versuchsreihe 50 µl anti-HPA-1a-Serum (1:16) pipettiert und nach C.2.4 weiterverfahren.

Zu den Thrombozyten der dritten Versuchsreihe wurden ebenfalls 50 µ l des anti-Human-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:60 pipettiert und nach C.2.2 weiterverfahren.

C.2.6 Titration von monoklonalem anti-A und anti-B der Spezifität Maus-IgG

Von einem Blutspender der Blutgruppe A1 und einem Blutspender der Blutgruppe B wurden die Thrombozyten nach C.2.1. gewonnen. Eine Verdünnungsreihe von 1:1 bis 1:1024 der monoklonalen Antikörper wurde erstellt. Zu jeweils 50 µl A-Thrombozyten wurden 50 µl der erstellten anti-A Verdünnungen und zu jeweils 50 µl B-Thombozyten 50 µl der erstellten anti-B Verdünnungen pipettiert. Eine Positivkontrolle mit anti-GP IIb/IIIa (1:40) und eine Negativkontrolle mit 50 µl verdünntem AB-Serum wurden ebenfalls erstellt. Der weitere Ansatz erfolgte nach C.2.4 mit 50 µl anti-Mouse-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:60.

C.2.7 Inkubation mit monoklonalem anti-A, anti-B, anti-D und anti-GP IIb/IIIa der Spezifität Maus-IgG

Für diesen Versuch wurde auf die Zellen aus Versuch C.2.6 zurückgegriffen. Der anti-A Antikörper wurde 1:16, der anti-B Antikörper und der anti-D Antikörper 1:4 und der anti-GP IIb/IIIa 1:40 verdünnt. In jeweils fünf Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, so daß fünf Versuchsreihen entstanden.

Zu den Thrombozyten der ersten Versuchsreihe wurde 50 µl anti-A, zu den Thrombozyten der zweiten Versuchsreihe 50 µl anti-B, zu den Thrombozyten der dritten Versuchsreihe 50 µl anti-D, zu den Thrombozyten der vierten Versuchsreihe 50 µl anti-GP IIb/IIIa und zu den Thrombozyten der fünften Versuchsreihe 50 µl verdünntes AB-Serum pipettiert. Der weitere Ansatz erfolgte nach C.2.4 mit 50 µl anti-Mouse-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:60.

C.2.8 Titration von anti-HPA-1a-Eluat

Das anti-HPA-1a Serum wurde 1:16 verdünnt, anschließend erfolgte eine Säureelution mit HPA-1a positiven Thrombozyten (73, modifiziert nach Kiefel).

Von einem Blutspender der Blutgruppe 0 wurden die Thrombozyten nach C.2.1.gewonnen. Eine Verdünnungsreihe von 1:8 bis 1:2048 des anti-HPA-1a-Eluats wurde erstellt und nach C.2.4 weiterverfahren.

C.2.9 Titration von Polyglobin

Von zwei Blutspendern der Blutgruppe 0 wurden die Thrombozyten nach C.2.1 gewonnen. Eine Verdünnungsreihe von 5 % bis 0,25 % des Polyglobin wurde erstellt. In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl der Thrombozytensuspension pipettiert und nach C.2.4 weiterverfahren.

C.2.10 Inkubation mit AB-Serum, anti-HPA-1a-Eluat und anti-Human-IgG-FITC

Von 27 Blutspendern wurden die Thrombozyten nach C.2.1. gewonnen. In jeweils drei Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, so daß drei Versuchsreihen entstanden. Zu den Thrombozyten der ersten Versuchsreihe wurden 50 µl verdünntes AB-Serum, zu den Thrombozyten der zweiten Versuchsreihe wurden 50 µl des HPA-1a-Eluats in einer Verdünnung von 1:16 pipettiert und nach C.2.4 weiterverfahren.

C.2.11 Inkubation mit Polyglobin, anti-HPA-1a-Eluat, AB-Serum und anti-Human-IgG-FITC, sowie Messung der Autofluoreszenz

Von 36 Blutspendern wurden die Thrombozyten nach C.2.1 gewonnen. In jeweils fünf Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, so daß fünf Versuchsreihen entstanden. Zu den Thrombozyten der ersten Versuchsreihe wurden 50 µl 2 %iges Polyglobin, zu den Thrombozyten der zweiten Versuchsreihe 50 µl anti-HPA-1a-Eluat (1:16) und zu den Thrombozyten der dritte Versuchsreihe 50 µl verdünntes AB-Serum pipettiert und nach C.2.4 weiterverfahren.

Die Thrombozyten der vierten Versuchsreihe wurden nach C.2.3 mit 50 µl des anti-Human-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:60 versetzt. Zu den Thrombozyten der fünften Versuchsreihe wurden 5 ml PBS-Lösung nach C.2.2 pipettiert.

Für alle Ansätze der Zellen 3033723 wurde die Inhalte der einzelnen Kanäle bestimmt. Dieses geschah durch schrittweises Verschieben der Positiv – Negativbereichs-Grenze.

C.2.12 Inkubation mit monoklonalem anti-A und anti-B der Spezifität Maus IgG

Von den aus C.2.8 gewonnenen Thrombozyten wurden 20 Suspensionen ausgewählt. Der anti-A und der anti-B Antikörper wurden unverdünnt angewandt. In jeweils zwei Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, so daß zwei Versuchsreihen entstanden. Zu den Thrombozyten der ersten Versuchsreihe wurden 50 µl des anti-A-, zu denen der zweiten Versuchsreihe 50 µl des anti-B-Antikörpers pipettiert. Der weitere Ansatz erfolgte nach C.2.4 mit 50 µl anti-Mouse-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:60.

C.3 Patientenuntersuchungen

Innerhalb des Zeitraumes vom 26.8.93 bis zum 7.10.93 wurde von 115 hämato-onkologischen Patienten, die im Allgemeinen Krankenhaus St.-Georg ambulant oder stationär behandelt wurden, EDTA-Blut und Serum abgenommen. Die Blutentnahme wurde vormittags durchgeführt.

Um die Blut- und Serumproben den Krankheitsbildern zuordnen zu können, wurde ein Begleitschein entworfen. Dieser enthielt Informationen zur Patientenidentifikation, Diagnose und vorhergehende Thrombozytensubstitutionen.

Bei thrombozytopenischen Patienten wurden 10 ml und bei Patienten, deren Thrombozytenzahl im Normbereich lag, 5 ml Blut in mit EDTA beschichtete Probenröhrchen abgenommen und durch vorsichtiges Schwenken vermischt. Zusätzlich wurden von jedem Patienten 10 ml Blut in ein Serumröhrchen abgenommen, die Gerinnung abgewartet, zentrifugiert, das Serum abgehoben und portioniert bei -20 °C eingefroren. Ein automatisches Blutbild wurde von allen Bluten mit dem Zell-Counter erstellt. Anschließend wurde das plättchenreiche Plasma durch eine Dichtegradient-Zentrifugation (nach C.2.1) bei Raumtemperatur gewonnen.

C.3.1 Untersuchung der nativen Thrombozyten

In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert und mit PBS-Lösung auf 5 ml aufgefüllt (nach C.2.2).

Gemessen wurde die Grün-Fluoreszenz im Histogramm sowie das Verhältnis "Gated/Total" im Vorwärts-Rechtwinkel-Streulicht Diagramm.

C.3.2 Inkubation der Thrombozyten mit anti-Human-IgG-FITC

Durchführung nach C.2.3

C.3.3 Inkubation der Thrombozyten mit AB-Serum

In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, mit 50 µl des verdünnten AB-Serums durchmischt und nach C.2.4. weiterverfahren.

C.3.4 Inkubation der Thrombozyten mit anti-HPA-1a-Eluat

In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, mit 50 µl des anti-HPA-1a-Eluats (aus C.2.8) durchmischt und nach C.2.4. weiterverfahren.

C.3.5 Inkubation der Thrombozyten mit eigenem Serum

In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, mit 50 µl des Patientenserums in einer Verdünnung von 1:5 durchmischt und nach C.2.4. weiterverfahren.

C.3.6 Inkubation von Pool-Thrombozyten mit Patientenserum

Von vier Blutspendern der Blutgruppe 0 wurden die Thrombozyten separiert, gewaschen, gepoolt und auf eine Konzentration von 100 x 103 Thrombozyten/µl eingestellt. In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl der Thrombozytensuspension pipettiert, mit jeweils 50 µl des Patientenserum durchmischt und nach C.2.4 weiterverfahren.

C.4 Entwicklung eines Computer-Auswertungsprogramms

Die Darstellung der Fluoreszenz in einem Histogramm war für uns zunächst die einzige Möglichkeit eine Messung auszuwerten. Neben dem Ausdruck des Histogramms wird eine knappe statistische Analyse des Negativ- und des Positivbereichs geliefert.

Eine Information über den Inhalt der einzelnen Kanäle konnte nur durch Verschieben der Negativ-Positiv Grenze über die 256 Kanäle ermittelt werden. Diese Prozedur dauert etwa 20 min pro Messung, bedingt einen erhöhten Verschleiß der Schaltelemente und liefert keine speicherbaren Dateien.

Die Auswertung der Messung mit der Software "ARS 4.0e" von ORTHO Diagnostic-System kann auch keine Informationen über den Inhalt der Kanäle liefern. Sie gestattet jedoch die Speicherung der Meßdaten auf Datenträgern, die mit dem Betriebssystem MS-DOS weiterverarbeitet werden können.

Die Speicherung einer Messung von 30.000 Thrombozyten benötigt einen Speicherplatz von circa 235 KByte und geschieht nach einem festgelegtem Protokoll [13, 14, 64].

Die gespeicherte Datei enthält einen Dateikopf, Text, nachfolgend die verschlüsselten sequentiell angeordneten Informationen und eine Datenanalyse. Für einen Impuls werden 8 Byte belegt, darin sind die Informationen über den Vorwärts-Rechtwinkel-Streulicht Kanal sowie über den Kanal für die Grün- und Orange-Fluoreszenz enthalten. Die Entwicklung eines eigenen Programms zur Entschlüsselung der Informationen und selektiven Darstellung der Grün-Fluoreszenz Kanäle wurde mit der Software "TURBO PASCAL V 6.0" [69, 90] durchgeführt. Um die Geschwindigkeit des Programmes zu erhöhen, wurde eine Assembler Routine [25] entwickelt.

Hauptaufgabe dieses Programms ist es, die verschlüsselten Informationen einzulesen, den Grün-Fluoreszenz-Kanal jeden Impulses zu berechnen, die Impulse eines Kanals zu addieren und in einer ASCII Code Datei abzuspeichern. Diese neue Datei benötigt einen Speicherplatz von 1 KByte, kann über jeden Editor gelesen werden und eignet sich zur statistischen Weiterverarbeitung mit eigener oder professioneller Software.

Das entwickelte Auswertungsprogramm befindet sich als Quellcode im Anhang I.1.

Die Darstellung der Fluoreszenz-Messung in einem Histogramm (siehe Abb. C-1) wurde durch Einfügen eine Grafikprozedur möglich.
 

Abb. C-1 Histogramm einer stark fluoreszierenden Probe


Eine andere Darstellungsform der Messung ist die Summenhäufigkeitsprozentkurve (siehe Abb. C-2). In den einzelnen Kanälen werden nicht mehr absolute Werte dargestellt, sondern Summenhäufigkeitsprozente [83].

Der Kanal 0 stellt das Summenhäufigkeitsprozent von Kanal 0 bis 255 dar. Er beträgt immer 100 %. Der Kanal 1 stellt das Summenhäufigkeitsprozent von Kanal 1 bis 255 dar, Kanal 2 das Summenhäufigkeitsprozent von Kanal 2 bis 255. Die nach diesem Prinzip entstandene Kurve ist eine stetig abfallende.
 

Abb. C-2 Summenhäufigkeitsprozentkurve von Abb. C-1


Um Vergleiche zwischen verschiedenen Messungen anstellen zu können, eignet sich die Regressionsanalyse der Summenhäufigkeitsprozentkurve (siehe Abb. C-3). Die Berechnung einer Regressionsgleichung über den Bereich von 20 bis 80% der Summenprozente kann für die 50 %-Summe den zugehörigen Kanal (50%-Kanal) und dessen Standardabweichung schätzen. Prinzip der Schätzung ist „die Methode der kleinsten Quadrate" [83].
 

Abb. C-3 Regressionsanalyse von Abb. C-2


Die Berechnung der Regressionsanalyse und dessen grafische Darstellung wie in Abb. C-3 liegt als PASCAL Programmcode im Anhang I.1 vor.

Eine weitere Möglichkeit mehrere Messungen zu vergleichen, bietet eine Übereinanderprojektion von Histogrammen (siehe Abb. C-4, Seite 26) oder Summenhäufigkeitsprozentkurven (siehe Abb. C-5, Seite 26). Diese Darstellungen lassen sich ebenfalls durch das Einfügen weiterer Prozeduren in den Programmcode realisieren. So wird dem Betrachter ein Bild geliefert, welches alle wesentlichen Informationen liefert, die zur Beurteilung einer Meßreihe notwendig sind.
 
 

Abb. C-4 Projektion dreier Histogramme bei Fragestellung nach NAITP

Abb. C-5 Titrationsreihe mit a- Human Platelet GP Ib, FITC-konj.


Um einen Unterschied der Fluoreszenzintensität zweier Messungen zu erkennen, haben wir die 3 sigma-Vertrauensbereiche der 50%-Kanäle betrachtet. Die Nullhypothese, kein Unterschied der Fluoreszenzintensität, sollte verworfen werden, wenn sich die 3 sigma -Vertrauensbereiche nicht überschneiden. Eine Aussage über unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten zweier Ansätze konnte mit einem Signifikanzniveau von alpha = 0,01 getroffen werden (siehe Formel 1).

Formel 1 Berechnung des Fluoreszenzunterschieds mit einem Signifikanzniveau von alpha = 0,01

Ist die Differenz D > 0 besteht ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Fluoreszenzen beider Ansätze.

Für einen anschaulichen Vergleich der statistischen Unterschiede wurde die Darstellung in einem Balkendiagramm (siehe Abb. C-6) entwickelt. Auch diese Darstellungsform wurde mit einem eigenen PASCAL Programm gestaltet.
 

Abb. C-6 Balkendiagramm mit Eintragung der Standardabweichungsintervalle


C.5 Arbeiten mit dem Computerprogramm

C.5.1 Titration von monoklonalem anti-GP Ib-FITC

Von zwei Blutspendern der Blutgruppe 0 wurden die Thrombozyten nach C.2.1. gewonnen. Eine Verdünnungsreihe von 1:4 bis 1:4096 des monoklonalen anti-GP Ib-FITC wurde erstellt. In jeweils zwölf Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, elf wurden mit jeweils 50 µl der Antikörperverdünnung versetzt und nach C.2.3 weiterverfahren, das zwölfte wurde mit PBS-Lösung auf 5 ml aufgefüllt.

Um beurteilen zu können, ob bei künftigen Auswertungen das Anlegen eines Rahmens sinnvoll ist, wurde eine Programmprozedur entwickelt. Aufgabe dieser Prozedur war es:

· Alle gespeicherten Daten einer Messung einzulesen,

· Darstellung der Vorwärts-Rechtwinkel-Streuung in einem Cytogramm,

· Farbige Darstellung der Datendichte im Cytogramm,

· Prüfung der Daten, ob sie in einen vorgegebenen Rahmen fallen,

· selektive Speicherung der "Gated Cells".

Die Koordinaten und die Größe des Rahmen wurden vom Cytoron® übernommen und nach Abspeicherung korrigiert.

Um beurteilen zu können, ob die Zellgranularität und die Zellgröße mit der Fluoreszenzintensität korreliert, wurde ein Programmprozedur entwickelt. Aufgabe dieser Prozedur war es:

· Einlesen der gespeicherten Daten,

· Grafische Darstellung der Punktwolken in einem Dot-Plot-Diagramm,

· Korrelation zwischen Grün-Fluoreszenz (Impuls > Kanal 16) und FW-Streulicht,

· Korrelation zwischen Grün-Fluoreszenz (Impuls > Kanal 16) und RT-Streulicht.

C.5.2 Erstellung eines Normbereiches für native Thrombozyten

An verschiedenen Tagen wurden von 59 Blutspendern die Thrombozyten nach C.2.1 separiert und nach C.2.2 weiterverfahren.

C.5.3 Erstellung eines Normbereiches für anti-human-IgG-FITC markierte Thrombozyten

In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension (aus Versuch C.5.1) pipettiert und nach C.2.3 weiterverfahren.

C.5.4 Inkubation von Thrombozyten mit HPA-1a-Eluat

In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension (aus Versuch C.5.1) pipettiert und mit 50 µl des HPA-1a-Eluats (aus C.2.8) in einer Verdünnung von 1:16 vermischt und nach C.2.4 weiterverfahren.

C.5.5 Mischung von humanen und Rinder-Thrombozyten, Markierung mit anti-GP Ib-FITC

Von einem Blutspender der Blutgruppe 0 und aus 40 ml frischem Rinderblut wurden die Thrombozyten separiert, gewaschen und nach C.2.1 auf eine Konzentration von 100 x 103 Thrombozyten/µl eingestellt. Aus den beiden Thrombozytensuspensionen wurden fünf Mischungen hergestellt. Die erste Mischung bestand aus 100 % Rinder-Thrombozyten, die zweite aus 75 % Rinder- und 25 % humanen Thrombozyten, die dritte aus 50 % Rinder- und 50 % humanen Thrombozyten, die vierte aus 25 % Rinder- und 75 % humanen Thrombozyten und die fünfte aus 100 % humanen Thrombozyten. In jeweils ein Probenröhrchen wurden 50 µl jeder erstellten Mischung pipettiert und mit 50 µl des anti-GP Ib-FITC in einer Verdünnung von 1:40 nach C.2.3 behandelt. In ein sechstes Probenröhrchen wurde 50 µ l Rinder-Thrombozyten, in ein siebtes 50 µl humane Thrombozyten pipettiert und auf 5 ml mit PBS-Lösung aufgefüllt.

C.5.6 Behandlung von Thrombozyten mit Sialidase, Inkubation mit anti-T-Lektin-FITC

Von zwei Blutspendern der Blutgruppe 0 wurden die Thrombozyten separiert, gewaschen und mit Ca2+-PBS-Lösung auf eine Konzentration von 100 x 103 Thrombozyten/µl eingestellt. In jeweils vier Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, so daß vier Versuchsreihen entstanden. Die Thrombozyten der ersten und zweite Versuchsreihe wurden in 1 ml Sialidase in einer Verdünnung von 1:100 für 30 min bei 37 °C inkubiert.

Die Probenröhrchen wurden mit 5 ml 0,44 %iger Rinderalbumin PBS-Lösung aufgefüllt, für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen. Auf das Thrombozytenpellet der ersten Versuchsreihe und zu den Thrombozyten der dritten Versuchsreihe wurden 50 µl des anti-T-Lektin-FITC in einer Verdünnung von 1:30 pipettiert und für 20 min im Dunkeln inkubiert.

Anschließend wurden 5 ml 0,44 %iger Rinderalbumin PBS-Lösung hinzugegeben, für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Pellet mit 1 ml PBS-Lösung resuspendiert und auf 5 ml aufgefüllt. Die Thrombozyten der vierten Versuchsreihe wurden ebenfalls auf 5 ml mit PBS-Lösung aufgefüllt.

Jede Messung umfaßte 30.000 Impulse, die mit der Software ARS 4.0e auf einer Diskette gespeichert wurden.

C.5.7 Absprengung der HLA-Antigene bei pH 3.0 und HPA-1a Typisierung

Von sechs Blutspendern wurden die Thrombozyten nach C.2.1. gewonnen. Zur Absprengung der HLA-Antigene [48, 49, 96] wurden jeweils 1 ml der Thrombozytensuspension in ein Probenröhrchen pipettiert, für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert und das Pellet mit 0,5 ml Zitronensäurepuffer (pH 3,0) resuspendiert. Die Suspensionen wurden 10 min im Eisbad gelagert, mit Zitratpuffer (pH 6,5) auf 10 ml aufgefüllt, für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, das Thrombozytenpellet mit 1 ml PBS-Lösung resuspendiert und mit PBS-Lösung auf 5 ml aufgefüllt. Nach einem zweiten Waschvorgang konnte eine Konzentration der Zellen von 100 x 103 wieder eingestellt werden. In jeweils drei Probenröhrchen wurden 50 µl einer Thrombozytensuspension pipettiert, so daß drei Versuchsreihen entstanden.

Zu den Thrombozyten der ersten Versuchsreihe wurden 50 µl des HPA-1a-Eluats in einer Verdünnung von 1:16 pipettiert und nach C.2.4 verfahren.

Die Thrombozyten der zweite Versuchsreihe wurden nach C.2.3 behandelt. Die Thrombozyten der dritten Versuchsreihe wurden nach C.2.2 behandelt.

Eine Typisierung der Thrombozyten im MAIPA-Test sollte zur Bestätigung der Ergebnisse durchgeführt werden.
 
 

D Ergebnisse

D.1 Vorversuche

D.1.1 Einstellung des Hintergrundrauschens

Im RT/FW-Streulicht Cytogramm kristallisierten sich zwei Populationen heraus. Die Trennung dieser Populationen ist bei der 1:8 Verdünnung, entsprechend 1,25 x 106 Zellen pro Ansatz, am schärfsten. Ausgehend von der 1:1 Verdünnung, bei der sich die größte Dichte der Punktwolke in der Mitte des Cytogramms zeigte, wanderte diese bei höherer Verdünnung auf die x-Achse zu. Bei Messung der 0,44 %igen Rinderalbumin-PBS-Lösung zeigte sich das gleiche Bild wie bei der 1:64 Verdünnung. Diese Punktwolke in dem unteren Bereich des Cytogramms wurde durch eine Trennlinie weggeschnitten.

Die Trennlinie hatte folgende Einstellung: Channel = 52, Angle = -6.

Die Messung reiner PBS-Lösung zeigte vereinzelte, langsam einfallende Impulse.

D.1.2 Einstellung der Thrombozytenkonzentration

Die Ansätze, die aus den Konzentrationen 20 x 10font size=-2>3 und 50 x 103 Thrombozyten/µl hergestellt wurden, lieferten weniger als 65.520 Impulse in 120 Sek. und überschritten die maximale Meßzeit. Der Anteil "Gated Cells" betrug 37,5 bzw. 64,9 % aller Impulse.

Bei dem Ansatz, der aus 100 x 103 Thrombozyten/µ l hergestellt wurde, konnten 65.520 Impulse gemessen werden, der Quotient "Gated/Total Cells" betrug 68,8 %.

Als optimal hat sich der letzte Ansatz herausgestellt. Bei einer Konzentration von 200 x 103 Thrombozyten/µl wurden 65.520 Impulse gezählt, von denen sich 95,4 % im vorgegebenen Rahmen befanden.

Als Vorlage für weitere Versuche wurden entsprechend 10 x 106 Thrombozyten pro Ansatz (Aufschwemmung in 5 ml PBS) eingesetzt.

D.1.3 Inkubation mit AB-Serum

Bei allen 4 Messungen zeigte sich im linken Bereich des Grün-Fluoreszenz Histogramms ein steil ansteigender Peak. Für weitere Versuche wurden der Negativbereich auf die Kanäle 0-19 und der Positivbereich auf die Kanäle 20-255 festgelegt. (siehe Tab. I-1)

D.1.4 Titration von anti-HPA-1a-Serum

Die Fluoreszenz der markierten Thrombozyten nahm mit höherer Verdünnung des Testserums ab (siehe Tab. I-2). Eine Verdünnung des Testserum von 1:4 stellte sich als geeignet heraus, eine hohe Ausbeute an fluoreszierenden Thrombozyten, sowie eine starke Fluoreszenz (mittl. Kanal des Positivbereichs) zu erzielen. Nach zweimaligem Waschen des Ansatzes nahm die Fluoreszenz ab. Die Ansätze mit verdünntem AB-Serum zeigten im Histogramm eine geringe Fluoreszenz von maximal 8,1 % im Positivbereich.

Der prozentuale Anteil der "Gated Cells" zeigte keine großen Unterschiede zu den vorherigen Messungen, wurde aber kleiner, wenn öfter gewaschen wurde.

Die Verringerung der eingesetzten Thrombozytenzahl pro Ansatz auf 50 x 105 Thrombozyten konnte durch Reduktion der Waschlösung von 10 auf 5 ml und bessere Handhabung des Versuchsablaufs erreicht werden.

D.1.5 Inkubation mit AB-Serum, anti-A, anti-B, und anti-HPA-1a-Serum

Die unspezifische Fluoreszenz der Thrombozyten, die mit verdünntem AB-Serum inkubiert wurden, konnte trotz einer höheren Verdünnung des anti-IgG-FITC nicht gesenkt werden. Diese höhere Verdünnung hatte keinen Einfluß auf die Fluoreszenz der mit anti-HPA-1a markierten Zellen (siehe Tab. I-3).

Eine Typisierung der Antigene A und B konnte mit dem eluierten Serum nicht durchgeführt werden.

Für weitere Messungen wurden die Thrombozyten nicht in 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung, sondern in PBS-Lösung aufgenommen.

D.2 Hauptversuche

D.2.1 Inkubation mit AB-Serum, anti-HPA-1-Serum und anti-Human-IgG

Nach Separation und Lagerung der Thrombozyten in 0,44 %iger Rinderalbumin-PBS-Lösung konnte die Fluoreszenz der Negativkontrollen vermindert werden (siehe Tab. I-4). Nach Inkubation mit verdünntem AB-Serum, sowie mit anti-IgG-FITC wurden die Peaks in den Histogrammen steil und symmetrisch.

Da sich die Einstellungen des Negativ- und des Positivbereichs als unzureichend erwiesen, wurde der Negativbereich auf die Kanäle 0-24 und der Positivbereich auf die Kanäle 25-255 festgestellt, so daß die Fluoreszenz der anti-IgG markierten Zellen zwischen 0 und 1,0 % im Positivbereich lag.

Die Grün-Fluoreszenz der Zellen der Spendennummer 3025148 fielen durch ihre starke Fluoreszenz auf.

Die Fluoreszenz der anti-HPA-1a markierten Zellen fiel geringer als in den Vorversuchen aus.

D.2.2 Titration von monoklonalem anti-A und anti-B der Spezifität Maus-IgG

Die Fluoreszenz der Thrombozyten nahm mit höherer Verdünnung der Antikörper ab. Bei allen Ansätzen der Titrationsreihe war die Fluoreszenzintensität nicht mit der Positivkontrolle vergleichbar (siehe Tab. D-1, D-2). Die Stärke der Fluoreszenz war bei den A-Thrombozyten im Vergleich zu den B-Thrombozyten höher.

Tab. D-1 Fluoreszenz der A-Thrombozyten nach Inkubation mit anti-A-Testserum im indirekten Immunfluoreszenztest
Ansatz und Fluoreszenz im Positivbereich in %
Pos-Ko 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Neg-Ko
83,9 42,6 41,4 35,9 26,4 22,5 15,1 10,0 3,3 0,4
Tab. D-2 Fluoreszenz der B-Thrombozyten nach Inkubation mit anti-B-Testserum im indirekten Immunfluoreszenztest
Ansatz und Fluoreszenz im Positivbereich in %
Pos-Ko 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Neg-Ko
83,9 14,9 13,4 10,8 4,9 2,7 2,0 1,0 0,6 0,5

D.2.3 Inkubation mit monoklonalem anti-A, anti-B, anti-D und anti-GP IIb/IIIa der Spezifität Maus-IgG

Nach Markierung der Thrombozyten mit dem monoklonalem anti-GP IIb/IIIa wurde eine starke Grün-Fluoreszenz von 80 - 90 % im Positivbereich gemessen (siehe Tab. I-5). Die Inkubation mit verdünntem AB-Serum dagegen konnte keine Reaktion hervorrufen.

Von den Thrombozyten, die mit anti-A inkubiert wurden, zeigten die der Blutgruppe A1 im Gegensatz zu Thrombozyten der Blutgruppe 0 und B eine Fluoreszenz. Maximal 16.9 % der Impulse befanden sich im Positivbereich, der Peak war deutlich nach rechts, entsprechend höherer Fluoreszenz, verschoben.

Von den Thrombozyten, die mit anti-B markiert wurden, fluoreszierten die B-Thrombozyten im Gegensatz zu allen anderen zwar stärker, aber ein deutlicher Unterschied, wie er sich in der anti-A Reihe herausstellte, konnte nicht erreicht werden.

Eine Fluoreszenz nach Inkubation mit anti-D konnte nicht gemessen werden.

Auch bei diesen Versuchsreihen fiel die Fluoreszenz des Thrombozyten der Spendennummer 3025148 stärker aus.

D.2.4 Titration von anti-HPA-1a-Eluat

Die Grün-Fluoreszenz der markierten Thrombozyten lag deutlich im Positivbereich. Mit zunehmender Verdünnung des Eluats nahm die Fluoreszenzintensität ab. Der mittlere Kanal des Positivbereichs näherte sich dem Kanal 25, der Grenze zum Negativbereich, an (Tab. I-6).
 

Abb. D-1 Titration von anti-HPA-1a-Eluat


D.2.5 Titration von Polyglobin

Nach Inkubation mit Polyglobin konnte eine leichte Rechtsverschiebung der Fluoreszenz im Histogramm beobachtet werden. Die prozentuale Verteilung im Positivbereich zeigte mit zunehmender Verdünnung keine Effekte. Eine Auswertung des mittleren Kanals des Negativbereichs zeigte jedoch, daß die gesamte Population bei Inkubation mit 5 %igem Polyglobin um circa 0,5 Kanäle nach rechts verschoben war und daß mit zunehmender Verdünnung des Polyglobins dieser Effekt verschwand (siehe Tab. D-3).
 

Tab. D-3 Fluoreszenz nach Titration von Polyglobin im indirekten Immunfluoreszenztest
Verdünnung in Massenprozent 5 4 3 2 1 0,5 0,25 Nativ anti-IgG
Fluoreszenz im Positivbereich in % 1,4 0,8 1,1 1,2 1,2 1,1 0,8 0,0 0,3
mittl. Kanal im Negativbereich 7,2 7,1 6,6 6,5 6,6 6,6 6,5 5,9 6,8
                   
Fluoreszenz im Positivbereich in % 0,9 0,8 1,0 1,1 0,8 0,9 0,8 0,0 1,0
mittl. Kanal im Negativbereich 7,0 6,8 6,9 6,6 6,7 6,4 6,4 5,9 7,3

D.2.6 Inkubation mit AB-Serum, anti-HPA-1a-Eluat und anti-Human-IgG-FITC

Die Ergebnisse aus den vorhergehenden Versuchen spiegelten sich auch hier wieder (siehe Tab. I-7). Thrombozyten, die mit anti-IgG-FITC inkubiert wurden, haben eine maximale Fluoreszenz von 0,5 % im Positivbereich. Die Fluoreszenz nach Inkubation mit AB-Serum war heterogener, sie betrug maximal 1,9 % im Positivbereich.

Die Fluoreszenz nach Inkubation mit dem anti-HPA-1a-Eluat ließ eine deutlich positive Reaktion erkennen.

D.2.7 Inkubation mit Polyglobin, anti-HPA-1a-Eluat, AB-Serum, anti-Human-IgG-FITC, sowie Messung der Autofluoreszenz

Die Autofluoreszenz betrug bei allen Messungen 0,0 % im Positivbereich.

Thrombozyten, die mit anti-IgG-FITC inkubiert wurden, zeigten eine geringe Fluoreszenz. Das Spektrum reichte von 0,1 bis 0,6 % im Positivbereich.

Wurden Thrombozyten mit AB-Serum inkubiert, lagen die Ergebnisse mit 0,2 bis 1,2 % wenig höher. Die Inkubation mit anti-HPA-1a-Eluat zeigte eine durchweg starke Fluoreszenz, die mit etwa 80 bis 90 % im Positivbereich lag. Nach Zugabe von 2 %igem Polyglobin lag die Fluoreszenz der Thrombozyten gering über der Kontrolle mit verdünntem AB-Serum (siehe Tab. I-8).

Analysiert man die Anzahl der Impulse, die in den einzelnen Kanälen registriert wurden, so ergibt sich in der Darstellung als Summenhäufigkeitsprozentkurve folgendes Bild:
 

Abb. D-2 Summenhäufigkeitsprozentkurven bei Messungen der Zelle 3033723


D.2.8 Inkubation mit monoklonalem anti-A und anti-B der Spezifität Maus-IgG

Thrombozyten der Blutgruppe 0 zeigten nach Inkubation mit anti-A und anti-B eine Fluoreszenz von weniger als 1 % im Positivbereich.

Thrombozyten der Blutgruppe A1 zeigten eine deutliche Reaktion nach Inkubation mit anti-A, jedoch nicht mit anti-B. Die Reaktion der Thrombozyten der Blutgruppe A2 war hingegen nur schwach.

Thrombozyten der Blutgruppe B zeigten eine geringe Fluoreszenz von 5,8 bis 7,0 % nach Inkubation mit anti-B und keine Reaktion mit anti-A.

Die Thrombozyten der Blutgruppe AB ergaben ähnliche Fluoreszenzen (siehe Abb. D-3 und Tab. I-9).

Abb. D-3 Typisierung der Merkmale A und B

D.2.9 Zusammenfassung der Ergebnisse

Es wurden von 99 Blutspendern die Thrombozyten separiert und direkt mit anti-IgG-FITC inkubiert.

Die Analyse der Grün-Fluoreszenz der Thrombozyten ergab folgendes Bild:

Die Spannweite der Prozente im Positivbereich lag von 0,0 bis 0,8 % mit einem Mittelwert von 0,16 % bei einer Standardabweichung von 0,1 %. Signifikante blutgruppenspezifische Unterschiede der Fluoreszenzen ließen sich nicht erkennen (siehe Tab. D-4).

Abb. D-4 Häufigkeitsverteilung nach Inkubation mit anti-IgG-FITC


Tab. D-4 Blutgruppenspezifische Betrachtung der Fluoreszenzen im direkten Immunfluoreszenztest
Blutgruppe Anzahl der Meßwerte Mittelwert der Fluoreszenz im Positivbereich in % Standardabweichung des Mittelwerts in %
0 48 0,16 0,1
A 37 0,14 0,09
AB 6 0,1 0
B 8 0,3 0,26
gesamt 99 0,16 0,1

Betrachtet man die Fluoreszenz der Thrombozyten, die indirekt mit verdünntem AB-Serum inkubiert wurden, ergibt sich folgendes Bild:

Die Spannweite der Prozente im Positivbereich erstreckte sich von 0,1 bis 2,7 % mit einem Mittelwert von 0,7 % bei einer Standardabweichung von 0,46 %. Auch hier ergaben sich keine blutgruppenspezifischen Unterschiede (siehe Tab. D-5).

Abb. D-5 Häufigkeitsverteilung nach Inkubation mit AB-Serum


Tab. D-5 Blutgruppenspezifische Betrachtung der Fluoreszenzen nach Inkubation mit AB-Serum im direkten Immunfluoreszenztest
Blutgruppe Anzahl der Meßwerte Mittelwert der Fluoreszenz im Positivbereich in % Standardabweichung des Mittelwerts in %
0 48 0,75 0,45
A 37 0,62 0,38
AB 6 0,63 0,45
B 8 0,88 0,82
gesamt 99 0,7 0,46

D.3 Patientenuntersuchungen

D.3.1 Thrombozytenzahl und Thrombozytensubstitution

Analysiert man die Thrombozytenzahlen des untersuchten Patientengutes (Abb. D-6), so ergab sich, daß 42 % (n = 48) im Normbereich von 150 - 350 x 103 Thrombozyten/µl lagen. Ebensoviel Prozent der Blutproben (n = 48) kamen von thrombozytopenischen Patienten, wobei 14 % (n = 16) weniger als 50 x 103 Zellen/µl aufwiesen. Von diesen Patienten wurden 29 % mit Thrombozyten substituiert. 8,7 % der untersuchten Proben enthielten mehr als 350 x 103 Thrombozyten/µl, eine Probe sogar 769 x 103 Thrombozyten/µl

Abb. D-6 Thrombozytenzahl der Patienten

D.3.2 Diagnosen

Bei dem untersuchten Krankheitsgut handelte es sich um Patienten einer hämato-onkologischen Abteilung. Der Anteil der onkologischen Patienten nahm den größten Teil des Untersuchungsgutes ein (siehe Abb. D-7). In dem Patientengut fanden sich 4 % mit diagnostizierter Immunthrombozytopenie.

Abb. D-7 Diagnosen des Patientengutes (n=115)

D.3.3 Untersuchungen der nativen Thrombozyten im Vorwärts-Rechtwinkel-Streulicht Diagramm

Von 113 separierten Thrombozyten waren 108 Thrombozytensuspensionen so beschaffen, daß sich mindestens 85 % der gemessenen Impulse im angelegten Rahmen befanden (siehe Abb. D-8). Lediglich bei 5 Proben konnten dieses Ergebnis nicht erreicht werden. Diese Proben waren von thrombozytopenischen Patienten entnommen, deren Thrombozytenzahl unter 72 x 103/µl lag.

Abb. D-8 Häufigkeitsverteilung; Darstellung des Quotienten "Gated/Total Cells"

D.3.4 Untersuchungen der nativen Thrombozyten auf Autofluoreszenz

Von den 113 untersuchten nativen Thrombozyten der hämato-onkologischen Patienten ergab sich für die Autofluoreszenz folgende Häufigkeitsverteilung:

Tab. D-6 Autofluoreszenz der nativen Thrombozyten
Autofluoreszenz im Positivbereich in % absolute Häufigkeit Thrombozytenzahl
0,0 98 µ  = 188
0,1 13 µ  = 154
0,2 1 82
0,3 1 28

D.3.5 Inkubation der Thrombozyten mit anti-Human-IgG-FITC

Nach Inkubation der Patiententhrombozyten mit anti-Human-IgG-FITC zeigte sich, daß der größte Teil gering fluoreszierte. Auffällig waren jedoch vereinzelte Werte (Abb. D-9).

Abb. D-9 Häufigkeitsverteilung; Darstellung der Fluoreszenz nach Inkubation mit anti-Human-IgG-FITC

Betrachtet man die Diagnosen der Messungen (siehe Tab I-10), die mehr als 1 % im Positivbereich fluoreszierten, so befanden sich drei Immunthrombozytopenien, eine HIV-Infektion und ein Lupus erythematodes darunter. Die vierte Immunthrombozytopenie wies eine Fluoreszenz von 0,4 % im Positivbereich auf.

D.3.6 Inkubation der Thrombozyten mit AB-Serum

Nach Inkubation der Patiententhrombozyten mit verdünntem AB-Serum entstand im Positivbereich von 0,0 bis 1,1 % eine angenäherte Normalverteilung der Fluoreszenzen mit einem Mittelwert von 0,50 % und einer Standardabweichung von 0,21 %. Die 15 Messungen, die mehr als 1,1 % im Positivbereich fluoreszierten, ließen sich nicht mit einem bestimmtem Krankheitsbild oder einem anderen gemessenen Parameter korrelieren.

Abb. D-10 Häufigkeitsverteilung; Darstellung der Grün-Fluoreszenz nach Inkubation mit verdünntem AB-Serum

D.3.7 Inkubation mit anti-HPA-1a-Eluat

Die Inkubation der Thrombozyten mit HPA-1a-Eluat als Positivkontrolle gelang in allen Messungen, mit einem breit gefächerten Spektrum an Ergebnissen. So ließen sich bei 86,5 % aller Messungen mehr als 60 % der Thrombozyten markieren. Bei 5,4 % aller Messungen ließen sich weniger als 40 % der Thrombozyten mit dem HPA-1a-Eluat markieren.

Abb. D-11 Häufigkeitsverteilung; Darstellung der Grün-Fluoreszenz nach Inkubation mit anti-HPA-1a-Eluat

D.3.8 Inkubation der Thrombozyten mit dem eigenen Serum

Im Bereich von 0,0 bis 1,2 %. befanden sich 82,4 % aller Meßwerte annähernd normalverteilt. 17,6 % der Proben zeigten eine stärkere Fluoreszenz. Eine Probe fluoreszierte so, daß sich 6,2 % aller Impulse im Positivbereich befanden. Eine Korrelation mit der Fluoreszenz der anti-IgG-FITC Markierung lag nicht vor (R = 0,004).

Abb. D-12 Häufigkeitsverteilung; Darstellung der Grün-Fluoreszenz nach Inkubation mit dem eigenen Serum

D.3.9 Inkubation von Pool-Thrombozyten mit Patientenserum

Wurden Pool-Thrombozyten mit den Seren der Patienten inkubiert, zeigte sich in der Häufigkeitsverteilung der Fluoreszenzen im Positivbereich eine heterogene Verteilung. 84 % aller Meßwerte befanden sich im Bereich von 0,0 bis 1,7 %.

Abb. D-13 Häufigkeitsverteilung; Darstellung der Grün-Fluoreszenz nach Inkubation von Pool-Thrombozyten mit Patientenserum

Betrachtet man die Diagnosen der Messungen, die mehr als 1,7 % im Positivbereich fluoreszieren, so befindet sich keine der ITP unter den auffälligen Ergebnissen. (siehe Tab. I-12)

D.4 Arbeiten mit dem Computerprogramm

D.4.1 Titration von monoklonalem anti-GP Ib

D.4.1.1 Ergebnisse des Quotienten "Gated/Total Cells"

Bei den durchgeführten 24 Messungen befanden sich durchschnittlich 78,55 % der Impulse im Rahmen. Nach Verschiebung des Rahmens um 7 Kanäle nach rechts stieg der Mittelwert des Quotienten "Gated/Total" auf 89,91 %.

Die Auswertung der Messung von nativen Thrombozyten (Abb. D-14, Objekt links) zeigte 90,13 % der gemessenen Impulse in dem eingerichteten Rahmen.

Die Auswertung der Messung von fluoreszierenden Thrombozyten (Objekt rechts) zeigte 89,46 % der gemessenen Impulse in dem angelegten Rahmen. Im Vergleich war die Punktwolke jedoch schmaler und nach oben ausgezogen. Bei den Verdünnungen 1:4 und 1:8 der Antikörper war der Quotient "Gated/Total Cells" (Tab. I-13 und I-14) kleiner als bei den anderen Ansätzen. Grundlage weiterer Auswertungen war der korrigierte Rahmen.

Abb. D-14 Cytogramme; Links native, Rechts fluoreszierende Thrombozyten

D.4.1.2 Ergebnisse der Grün-Fluoreszenz

Nach Erstellung einer Titrationsreihe mit monoklonalem anti-GP Ib ergab die Darstellung der 50%-Kanäle in einem Diagramm (Abb. D-15) eine stetig ansteigende Kurve.
Bei den nativen Thrombozyten betrug der 50%-Kanal 3,38 bzw. 3,37. Nach Inkubation mit der Antikörperverdünnung von 1:4 betrug der 50%-Kanal 86,9 bzw. 84,5. Entsprechend verschub sich das Regressionsintervall und die Standardabweichung des 50%-Kanals in einen Bereich stärkerer Fluoreszenz. Die Höhe des Antikörpertiters betrug 1:512 (Tab. D-7).

Abb. D-15 50%-Kanäle der Grün-Fluoreszenz

Die Titerberechnung des Antikörpers wurde nach Formel 1 durchgeführt. Die Berechnung der Standardabweichungsintervalle (Tab. D-7) zeigte einen signifikanten Unterschied der Titerstufen 1:512 zu 1:1024.

Tab. D-7 Titerberechnung der 50%-Kanäle nach Inkubation mit monoklonalem anti-GP Ib-FITC
Ansatz Mittelwert - 3*sigma Mittelwert + 3*sigma
nativ 1,78  4,96
1:4096 3,05 4,17
1:2048 4,04 5,52
1:1024 4,87 6,67
1:512 9,33 10,51
1:256 16,41 17,39

Der Vergleich der Fluoreszenzen der "Gated Cells" mit denen der "Total Cells" der gleichen Messungen brachte folgendes Ergebnis (Tab. I-13 und I-14):

· Der Regressionskoeffizient zeigte keinen Unterschied

· Der 50%-Kanal war bei den "Gated Cells" kleiner

· Die Standardabweichung des 50 %- Kanals war bei den "Gated Cells" kleiner
 
 

D.4.1.3 Korrelationsanalyse

Die grafische Darstellung in einem Cytogramm ließ eine bessere Korrelation zwischen Rechtwinkel-Streuung (RT-Streulicht) und Grün-Fluoreszenz (Abb. D-16, Obj. rechts) als zwischen Vorwärts-Streuung und Grün-Fluoreszenz (Abb. D-16, Obj. links) vermuten.

Abb. D-16 Cytogramme; Darstellung der Korrelation von Grün-Fluoreszenz und Lichtstreuung

Die Berechnung der Korrelation über die ganze Verdünnungsreihe ergab eine, mit höherer Konzentration der Antikörper zunehmende Korrelation. Die Korrelation der Grün-Fluoreszenz zur Rechtwinkel-Streuung (r (RT-GR)) war stärker als zur Vorwärts-Streuung (r (FW-GR)). Nach Inkubation mit dem monoklonalem Antikörper in einer Verdünnung von 1:4 betrug der Korrelationskoeffizient (r (RT-GR)) 0,82 (siehe Tab. D-8).

Tab. D-8 Korrelation der Fluoreszenz zur Lichtstreuung
Zelle und Ansatz   1:512 1:256 1:128 1:64 1:32 1:16 1:8 1:4
Zelle 250 r (RT-GR) 0,25 0,39 0,54 0,65 0,66 0,74 0,81 0,82
r (FW-GR) 0,30 0,34 0,43 0,50 0,53 0,65 0,75 0,76
                 
Zelle 253 r (RT-GR) 0,24 0,39 0,54 0,64 0,69 0,75 0,76 0,82
r (FW-GR) 0,39 0,32 0,41 0,49 0,55 0,63 0,75 0,72

D.4.2 Erstellung eines Normbereiches für native Thrombozyten

Aus 59 untersuchten Thrombozytensuspensionen ergab die Darstellung der 50%-Kanäle der Autofluoreszenz ein heterogenes Bild (Abb. D-17). Eine Normalverteilung, sowie eine Lognormalverteilung konnten nicht abgeleitet werden. Alle Meßwerte, die größer als 6,0 waren, wurden an einem Tag erstellt, so daß eine durch das Gerät bedingte Streuung der Werte angenommen werden muß.

Die Spannweite der 50%-Kanäle erstreckte sich von 3,15 bis 7,00. Der Median betrug 4,19 mit einem Standardfehler von 0,25 und einer Median-Deviation von 0,71. Der 95% Vertrauensbereich des Medians der 50%-Kanäle lag zwischen 3,75 und 4,63.

Abb. D-17 Häufigkeitsverteilung; Autofluoreszenz der nativen Thrombozyten

Die Regressionskoeffizienten der angelegten Regressionsgeraden lagen im Bereich von -0,97 bis -1,00.

Die Standardabweichungen der 50%-Kanäle lagen im Bereich von 0,11 bis 0,56.

D.4.3 Erstellung eines Normbereiches für anti-Human-IgG-FITC markierte Thrombozyten

Von 55 untersuchten Thrombozytensuspensionen ergab die Darstellung der 50%-Kanäle ein heterogenes Bild (Abb. D-18). Eine Normalverteilung, sowie eine Lognormalverteilung konnten nicht abgeleitet werden. Alle Meßwerte, die größer als 7,0 waren, wurden an dem gleichen Tag wie die auffälligen Werte aus D.4.2 erstellt.

Die Spannweite der 50%-Kanäle erstreckte sich von 3,58 bis 11,60. Der Median betrug 5,35 mit einem Standardfehler von 0,24 und einer Median-Deviation von 1,17. Der 95% Vertrauensbereich des Medians der 50%-Kanäle lag zwischen 4,83 und 5,87.

Abb. D-18 Häufigkeitsverteilung; Grün-Fluoreszenz anti-IgG-FITC markierter Thrombozyten

Die Regressionskoeffizienten der angelegten Regressionsgeraden lagen im Bereich von -1,00 bis -0,99.Die Standardabweichungen der 50%-Kanäle lagen im Bereich von 0,11 bis 0,33.

D.4.4. Inkubation von Thrombozyten mit HPA-1a-Eluat

Nach Inkubation von 42 Thrombozytensuspensionen mit HPA-1a-Eluat und anschließender anti-IgG-FITC Beladung konnte bei jeder Messung eine Fluoreszenz beobachtet werden. Die 50%-Kanäle der Grün-Fluoreszenz erstreckten sich von 15,98 bis 72,35 (Abb. D-19). Die Regressionskoeffizienten lagen im Bereich von -1 bis -0,86. In allen Fälle konnte ein signifikanter Unterschied der Grün-Fluoreszenz zwischen Inkubation mit anti-HPA-1a-Eluat und anti-IgG-FITC und Inkubation mit anti-IgG-FITC berechnet werden (nach Formel 1, alpha = 0,01).

Abb. D-19 Häufigkeitsverteilung; Grün-Fluoreszenz HPA-1a markierter Thrombozyten

D.4.5 Unterschiede der Fluoreszenz der anti-human-IgG-FITC markierten Thrombozyten zur Autofluoreszenz

Um beurteilen zu können, ob sich die Fluoreszenz der nativen und anti-human-IgG-FITC markierten Thrombozyten signifikant unterscheidet, wurden die 50%-Kanäle und deren Standardabweichungen nach Formel 1 verglichen.

Einen statistisch signifikanter Unterschied (alpha = 0,01) zwischen den Fluoreszenzen konnte für 35 % der Messungen berechnet werden.

D.4.6 Mischung von humanen und Rinder-Thrombozyten, Markierung mit anti-GP Ib-FITC

Die Separation der Rinder-Thrombozyten bereitete keine Probleme. Der Vergleich der nativen Rinder- mit den humanen Thrombozyten zeigte nahezu gleiche Eigenschaften im RT/FW-Streulicht Modus (Abb. D-20).

Abb. D-20 Cytogramme; Vergleich humaner- und Rinder-Thrombozyten

Die Granularität und die Größe der Rinder-Thrombozyten war geringer als die der humanen Thrombozyten, somit ihr Quotient "Gated/Total-Cells" kleiner (siehe Tab. D-9).

Tab. D-9 Vergleich der Lichtstreuung humaner und Rinder-Thrombozyten
Lichtstreuung 50%-Kanal Standardabweichung Gated/Total in %
humane Thrombozyten     92,58 
RT-Streulicht 80,96 0,45  
FW-Streulicht 98,53 0,41  
Rinder-Thrombozyten     83,56
RT-Streulicht 70,61 0,56  
FW-Streulicht 88,12 0,27  

Die Autofluoreszenzen der nativen Rinder- und humanen Thrombozyten zeigten keinen Unterschied (siehe Tab. D-10).

Wurden Rinder-Thrombozyten mit anti-GP Ib-FITC inkubiert, fand keine Reaktion statt. Der Antikörper band nicht an Rinder-Thrombozyten.

Nach Inkubation mit dem fluoreszierenden Antikörper spiegelten sich die eingestellten Mischungen der Thrombozyten in der Grün-Fluoreszenz wieder. Es entstanden zwei Peaks in den Histogrammen. Der rechte Peak entstand durch die starke Fluoreszenz der humanen Thrombozyten, der linke durch die schwache Fluoreszenz der Rinder-Thrombozyten. Ein Rückschluß auf die prozentuale Verteilung der Mischung war nicht möglich.

Die Projektion der Summenprozentkurven der Grün-Fluoreszenzen (Abb. D-21) veranschaulicht die Fluoreszenz der verschiedenen Mischungen. In den dargestellten Kurven sind drei Abschnitte zu unterscheiden. Abschnitt 1 stellt nicht fluoreszierende Thrombozyten dar. Anschließend ist ein Plateau zu erkennen. Es entsteht durch den Abstand beider Peaks im Histogramm. Abschnitt 3 spiegelt die starke Fluoreszenz der humanen Thrombozyten wieder.

Abb. D-21 Summenhäufigkeitsprozentkurven; Darstellung der Grün-Fluoreszenz der Mischungen

Die Berechnung der 50%-Kanäle verdeutlicht die zunehmende Fluoreszenz (Tab. D-10). Je größer der Anteil an humanen Thrombozyten ist, desto größer ist der 50%-Kanal.

Tab. D-10 Fluoreszenz der verschiedenen Mischungen nach Inkubation mit anti-GP Ib
Ansatz, Mischungsverhältnis Regressions-koeffizient 50%- Kanal Standard-abweichung Gated/Total in % Fluoreszenz im Positivbereich in %
native humane Thrombozyten -0,98 3,67 0,36 92,5 0,0
native Rinderthrombozyten -0,99 3,96 0,31 83,6 0,0
100 % Rinderthrombozyten -0,99 3,77 0,39 85,7 0,0
75 % Rinderthrombozyten -1,00 5,07 0,22 85,4 12,1
50 % Rinderthrombozyten -0,80 9,12 8,71 86,0 26,2
25 % Rinderthrombozyten -0,97 30,8 4,50 88,4 51,4
100 % humane Thrombozyten -0,97 47,0 4,04 90,2 72,0

Der Regressionskoeffizient der 50 % Mischung betrug -,080. Die Regressionsgerade konnte nicht optimal angelegt werden. Eine Abschnitts-Regressionsanalyse über dem Bereich von 5 - 25 % konnte den 15%-Kanal bestimmen (siehe Abb. D-22). Er betrug 59,5 mit einer Standardabweichung von 0,8.

Abb. D-22 Regressionsanalyse über dem 5 - 25 % Intervall

D.4.7 Behandlung von Thrombozyten mit Sialidase, Inkubation mit anti-T-Lektin

Die Behandlung der Thrombozyten mit Sialidase hatte Einfluß auf die Darstellung im FW/RT-Streulicht Diagramm. 83,6 bzw. 84,1 % der Impulse befanden sich im angelegten Rahmen, bei Messung der nativen Thrombozyten befanden sich 92,8 bzw. 92,9 % im Rahmen.

Die mit Sialidase behandelten und mit anti-T-Lektin markierten Thrombozyten zeigten im Gegensatz zu den anderen Ansätzen (Abb. D-23) eine zweigipflige Kurve. Der linke Peak der Kurve lag in dem Bereich der Fluoreszenz der nativen Thrombozyten. Der rechte Peak dagegen lag deutlich in einen Bereich hoher Fluoreszenz.

Abb. D-23 Histogramm; Darstellung der Grün-Fluoreszenz

Das Vorhandensein von zwei Peaks bereitete für die Berechnung des 50%-Kanals über dem Regressionsintervall von 20 - 80 % Schwierigkeiten. Der errechnete Kanal war mit einer großen Standardabweichung verbunden (siehe auch D.4.6).

Um einen Vergleich anstellen zu können, kann man nach gleichem Prinzip den 20%-Kanal über dem Regressionsintervall von 5 - 40 % (5 - 30 %) errechnen (Abb. D-24). Die Regressionsgerade liegt der Kurve genauer an und der errechnete Kanal hat keine große Standardabweichung (Tab. D-11).

Abb. D-24: Berechnung des 20%-Kanals


Tab. D-11 Fluoreszenzen der Sialidase behandelten und anti-T-FITC markierten Zellen, Vergleich der Regressionsanalysen über verschiedene Bereiche
20 - 80% Intervall 5 - 40% Intervall
Zelle Ansatz Korrelations-koeffizient 50%-Kanal Standard-abweichung Korrelations-koeffizient 20%-Kanal Standard-abweichung
A native Thrombozyten -1,00 6,94 0,11
+ Sialidase -1,00 7,70 0,21
+ anti-T -0,99 13,5 0,57
+ Sialidase + anti-T -0,89 47,1 13,3 -0,99 110,6 1,17
5 - 30% Intervall
B native Thrombozyten -1,00 7,00 0,13
+ Sialidase -1,00 7,36 0,22
+ anti-T -0,99 13,1 0,54
+ Sialidase + anti-T -0,84 28,3 15,1 -0,99 104,7 0,82

D.4.8 Absprengung der HLA-Antigene bei pH 3.0 und HPA-1a Typisierung

Die Behandlung der Thrombozyten mit Zitronensäure hatte geringen Einfluß auf den Quotienten "Gated/Total" Cells. Im FW/RT-Streulicht-Diagramm (Abb. D-25) lag die Punktwolke der Thrombozyten mittig im festgesetzten Rahmen. Eine Vermehrung von Einzelimpulsen außerhalb des Rahmens ließ jedoch auf eine Schädigung einzelner Zellen schließen (siehe Tab. I-15).

Abb. D-25 FW/RT-Streulicht Cytogramm einer mit Zitronen-säure behandelten Thrombozytensuspension

Die Zitronensäure Behandlung der Thrombozyten war nötig, da das zur Typisierung zur Verfügung stehende HPA-1a-Serum unspezifische HLA-Antikörper enthielt. Erst durch eine Absprengung der HLA-Antigene konnte die Reaktion der HLA-Antikörper vermindert werden.

Nach Regressionsanalyse und Berechnung des 50%-Kanals der Grün-Fluoreszenz mit der Standardabweichung (Tab. I-16 und Abb. D-26) konnte in drei Fällen ein signifikanter Unterschied (alpha = 0,01) nach Zugabe von anti-HPA-1a-Serum festgestellt werden. Die Bestätigung der Ergebnisse erfolgte im MAIPA-Test.

Abb. D-26 Balkendiagramm; HPA-1a Typisierung

E Kasuistik einer NAITP der Spezifität HPA-5b (Bra)

E.1 Klinische Angaben

Die Kindsmutter war eine 3. Gravida, II Para. Das erste Kind ist gesund. Am 29.5. erfolgte die stationäre Aufnahme wegen vorzeitiger Wehen und Blasensprung.

Es erfolgte eine eilige Sektio aus Beckenendlage, die Plazenta zeigte Zeichen einer vorzeitigen Lösung.

Das Geburtsgewicht der Tochter betrug 1520 g, bei einer Körperlänge von 42 cm und einem Kopfumfang von 29 cm. (Apgar 1/4/6)

Das Kind war perinatal schlaff, so daß eine Beatmung und eine Herzdruckmassage erforderlich wurden. Die Herzfrequenz stieg an und das Kind wurde auf die Frühgeborenen-Intensivstation verlegt.

Bei Aufnahme auf die Intensivstation war das Kind intubiert und beatmet, das Hautkolorit blaß, der Tonus schlaff und die Eigenatmung unregelmäßig. Die Herzfrequenz betrug 100/min, die Herztöne waren laut und rein. Die Lunge war seitengleich belüftet, das Abdomen unauffällig, die Fontanelle im Niveau. Blutungszeichen ließen sich nicht erkennen.

Labor vom 29.5.: Leukozyten 29,7 /nl, Hb 18,3 /dl, Thrombozyten 80 /nl, Stabkernige 3 /nl, Segmentkernige 21 /nl, Lymphozyten 75 /nl, CRP 1 mg/l, Blutgruppe A Rh pos.

Bakteriologie: Es konnte kein Nachweis pathogener Keime geführt werden.

Plazentahistologie: Es handelte sich um eine unreife Plazenta mit ausgedehnten Infarkten und Merkmalen einer chronischen utero-plazentaren Minderdurchblutung. Der Befund war schwerwiegend. Hinweise auf eine Infektion ergaben sich nicht.

Es erfolgte die Stabilisierung des Stoffwechsellage innerhalb der ersten vier Lebenstage.

Die schon bei Aufnahme niedrige Thrombozytenzahl von 80 /nl sank im Verlauf weiter bis auf 7 /nl ab. Durch tägliche Gabe von Thrombozytenkonzentraten der Blutgruppe 0 konnte ein Niveau von 20 - 40 Thrombozyten/nl gehalten werden. Erst nach der einmaligen Gabe eines mütterlichen, gewaschenen und bestrahlten (30 Gray) Thrombozytenhochkonzentrats und der intravenösen Applikation von IgG (0,4 g/kg KG) konnten kontinuierlich steigende Thrombozytenzahlen beobachtet werden. (6. Tag 59/nl, 7. Tag 150 /nl, 21. Tag 521 /nl, Hb: 15,1 g/dl)

Am 7.6. konnte das Kind auf die Nachsorgestation verlegt werden. Der weiter Verlauf gestaltete sich unkompliziert.

E.2 Serologische Untersuchungen

E.2.1 Routine Diagnostik

Im Thrombozytenantikörpersuchtest (PSIFT und Capture-P) wurden im Serum der Mutter thrombozytäre Antikörper nachgewiesen.

Durch den MAIPA-Assay konnte der Antikörper als allo-anti-HPA-5b spezifiziert werden (Titer 1). Zusätzlich konnten im Serum der Mutter zytotoxische anti-HLA-A2-Antikörper nachgewiesen werden (Titer 16).

Der Thrombozytenphänotyp der Mutter war: HPA-1a pos, HPA-5b neg und HPA-5a pos.

Der Thrombozytenphänotyp des Vaters war: HPA-1a pos, HPA-5b pos und HPA-5a neg, sowie HLA A2

Material vom Kind stand für eine Phänotypisierung nicht zur Verfügung.

E.2.2 Durchflußzytometrische Untersuchungen

Die Thrombozyten des Vaters und der Mutter wurden nach C.2.1. gewonnen.

E.2.2.1 Antikörper Suchtest

In jeweils drei Kunststoff-Probenröhrchen wurden 50 µl der väterlichen Thrombozytensuspension pipettiert, der erste Ansatzes wurde mit 50 µl des mütterlichen Serums in einer Verdünnung von 1:4 versetzt und nach C.2.4 verfahren. Die Thrombozyten des zweiten Ansatzes wurden nach C.2.3. mit 50 µl des anti-human-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:60 inkubiert.

Die dritte Ansatz wurde nach C.2.2 mit 5 ml PBS versetzt.

Jede Messung umfaßte 30.000 Impulse, die mit der Software ARS 4.0e auf einer Diskette gespeichert wurden. Die Analyse der Daten erfolgte mit dem eigenen Auswertungsprogramm.

E.2.2.2 Titration des mütterlichen Serums gegen väterliche Thrombozyten

Eine Verdünnungsreihe des Serums der Mutter von 1:4 bis 1:4096 wurde erstellt.

In jeweils elf Plastik Probenröhrchen wurden 50 µl der Thrombozytensuspension pipettiert. Zu neun Thrombozytensuspensionen wurden jeweils 50 µl der erstellten Verdünnungen, zu einer Suspension 50 µl anti-HPA-1a-Eluat und zu der letzten 50 µl verdünntes AB-Serum pipettiert und nach C.2.4. verfahren.

Jede Messung umfaßte 30.000 Impulse, die mit der Software ARS 4.0e auf einer Diskette gespeichert wurden. Die Analyse der Daten erfolgte mit dem eigenen Auswertungsprogramm.

E.2.2.3 IgG Subklassen Bestimmung

In jeweils neun Kunststoff-Probenröhrchen wurden 50 µl der väterlichen Thrombozytensuspension pipettiert. Zu vier Thrombozytensuspensionen wurden 50 µl Serum (Verdünnung 1:16) der Mutter pipettiert und für 30 min bei 37 °C inkubiert, mit 5 ml 0,44 %iger Rinderalbumin PBS-Lösung aufgefüllt, für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert und der Überstand vorsichtig abgegossen.

Zu jeweils einem Pellet und einer Thrombozytensuspension wurden 50 µ l anti-IgG1-FITC (Verdünnung 1:20), anti-IgG2-FITC (Verdünnung 1:10), anti-IgG3-FITC (Verdünnung 1:10) und anti-IgG4-FITC (Verdünnung 1:5) pipettiert und resuspendiert und für 20 min im Dunkeln inkubiert. Die eingesetzten Verdünnungen der monoklonalen Antikörper wurden nach Herstellerangaben ausgewählt.

Anschließend wurden 5 ml 0,44 %iger Rinderalbumin PBS-Lösung hinzugegeben, für 10 min mit 2800 U/min zentrifugiert, der Überstand abgegossen, das Pellet mit 1 ml PBS-Lösung resuspendiert und auf 5 ml aufgefüllt.

Die neunte Thrombozytensuspension wurde ebenfalls mit 5 ml PBS-Lösung aufgefüllt.

Jede Messung umfaßte 30.000 Impulse, die mit der Software ARS 4.0e auf einer Diskette gespeichert wurden. Die Analyse der Daten erfolgte mit dem eigenen Auswertungsprogramm.

E.2.3 Ergebnisse des Antikörpersuchtests

Bei Darstellung der drei Meßergebnisse in einem Histogramm (siehe Abb. E-1) erkannte man, daß nach Zugabe des mütterlichen Serums zu den väterlichen Thrombozyten eine starke Grün-Fluoreszenz auftrat. Der 50%-Kanal dieses Ansatzes betrug 22,94 (siehe Tab. E-1). Die Grün-Fluoreszenz der nativen und der anti-IgG-FITC markierten Thrombozyten lag im erarbeiteten 95% Vertrauensbereich.

Tab. E-1 Fluoreszenz der väterlichen Thrombozyten
Ansatz Regressionsintervall
von Kanal bis Kanal
Regressions-
koeffizient
50%-Kanal Standard-abweichung Differenz nach Formel 1
nativ 1 7 -0,98 3,68 0,49
anti-IgG-FITC 2 8 -1,00 4,18 0,17 -1,48
Serum der Mutter (1:4)

+ anti-IgG-FITC

7 39 -1,00 22,94 0,15 17,8

Die Stärke der Grün-Fluoreszenz der Thrombozyten, die mit Serum der Mutter inkubiert wurden, unterschied sich signifikant (alpha = 0,01) von den anderen Ansätzen (Berechnung nach Formel 1).

Die Fluoreszenz der Thrombozyten der Mutter in allen drei Ansätzen lag in den erarbeiteten Vertrauensbereichen (siehe Tab. I-17).

Abb. E-1 Histogramm, Fluoreszenz der väterlichen Thrombozyten

E.2.4 Ergebnisse der Titration des mütterlichen Serums gegen väterliche Thrombozyten

Die stärkste Grün-Fluoreszenz ergab sich bei der 1:8 Verdünnung, sie war stärker als nach Inkubation mit anti-HPA-1a-Eluat. Die Titerberechnung über die Standardabweichungsintervalle des 50%-Kanals (siehe Tab. E-2) ergab einen Titer von 512.

Tab. E-2 Fluoreszenz nach Titration mit mütterlichem Serums im indirektem Immunfluoreszenztest
Ansatz "Gated/Total"
in %
Regressionsintervall
von Kanal bis Kanal
Regressionskoeffizient 50%-Kanal Standardabweichung Differenz nach Formel 1
verd. AB-Serum 92,26 2 11 -1,00 5,76 0,23 x
1:2048 91,04 2 8 -1,00 4,14 0,20 -2,91
1:1024 91,45 2 10 -1,00 5,04 0,19 -0,27
1:512 91,11 2 12 -1,00 6,82 0,30 0,31
1:256 91,04 3 14 -1,00 9,01 0,29 0,42
1:128 91,33 8 20 -1,00 13,60 0,16 3,42
1:64 91,37 12 28 -1,00 19,60 0,28 4,68
1:32 91,05 16 36 -1,00 26,06 0,23 4,93
1:16 90,74 25 48 -1,00 36,51 0,26 8,98
1:8 91,54 25 52 -1,00 38,97 0,32 0,72
alpha -HPA-1a-Eluat 90,44 16 49 -1,00 31,91 0,44 x

E.2.5 IgG Subklassen Bestimmung

Die Darstellung der Summenhäufigkeitsprozentkurven (Abb. E-2) zeigte eine starke Grün-Fluoreszenz nach Inkubation mit anti-IgG1-FITC. Bei allen anderen Ansätzen war die Fluoreszenz deutlich geringer.

Die Berechnung der Standardabweichungsintervalle (nach Formel 1, siehe Tab. I-18) nach Inkubation mit den IgG-Subklassen ergab nur bei der Inkubation mit IgG1 einen signifikanten (alpha  = 0,01) Unterschied.

Abb. E-2 Summenhäufigkeitsprozentkurven, IgG Subklassen Bestimmung

F Diskussion

Um im Blutspendedienst Eilbek neben den Routineverfahren PSIFT und MAIPA eine dritte Methode zum Nachweis thrombozytärer Antikörper zu benutzen, wurde eine durchflußzytometrische Methode entwickelt. Die Anwendung mehrerer serologischer Screening-Tests in der Antikörperdiagnostik bietet eine hohe Spezifität und Sensitivität [113].

Die Thrombozytenseparation erfolgte durch eine Dichtegradient-Zentrifugation nach der Vorschrift für den PSIFT [109] und PAIFT [89]. Nach der Separation wurden die Thrombozyten auf eine Konzentration von 100 x 103 eingestellt und in EDTA-Lösung gelagert. Die erhaltene Suspension zeigte sich im Phasenkontrastmikroskop homogen, Agglutinate und Verunreinigungen konnten nicht erkannt werden.

Statt EDTA-Lösung als vorzulegendes Entnahmemedium schreibt das "Düsseldorf I"-Protokoll [101, 102, 103] eine Vorlage von Citrat-Lösung, Acetylsalizylsäure und Prostaglandin E1 vor. Die Thrombozyten werden in ihrer Oberfläche stabilisiert und eine semiquantitative Bestimmung der Oberflächenproteine ist möglich. Eine Bestimmung der Antigendichte kann jedoch auch nach Vorlage von EDTA-Lösung erfolgen [17]. Auch wird EDTA-Lösung zum Nachweis von plättchengebundenem IgG (PaIgG) [52, 80] und freiem anti-thrombozytären IgG verwendet [79, 114].

Werden Thrombozyten isoliert untersucht, geschieht die Separation durch eine Dichtegradient-Zentrifugation. Lediglich Marti et al. [55] trennen das plättchenreiche Plasma über einen Arabinogalactan Gradienten.

Eine Fixation der Thrombozyten mit Paraformaldehyd [1, 109] wurde nicht durchgeführt, um keine unspezifischen Reaktionen durch Manipulation der Oberfläche zu erhalten [78]. Um die Thrombozyten trotzdem lagern zu können, sollte eine Aufbewahrung in Natriumazid-Lösung [36] erfolgen. Dieses Verfahren bereitete große Probleme. Die Fluoreszenz nach Inkubation mit AB-Serum und nachfolgender Inkubation mit anti-IgG-FITC war nicht reproduzierbar.

Eine Fluoreszenz von 14,0 % bis 0,1 % im Positivbereich (siehe Tab. I-1 und I-3) wurde gemessen. Durch Lagerung der Thrombozyten in Rinderalbumin-PBS-Lösung und Verzicht auf Natriumazid konnte die unspezifische Fluoreszenz unterdrückt werden (siehe Tab. I-4). Marti et al. [55] modifizierten ihren Test, indem sie ebenfalls auf Natriumazid für ihre Analyse verzichten.

Die Aufnahme der Thrombozyten für den Meßvorgang in eine Rinderalbumin-PBS-Lösung, wie sie zu Lagerung und zum Waschen benutzt wird, stellt sich als ungünstig heraus. Die Zeit, in der 65.500 Impulse registriert werden, ist viel kürzer als wenn die Thrombozyten in PBS-Lösung aufgenommen werden. Im RT/FW-Streulicht Diagramm erkennt man viele Impulse, die durch einen hohen RT-Streulicht - und einen niedrigen FW-Streulicht - Wert auffallen (siehe D.1.2). Betrachtungen im Phasenkontrastmikroskop liefern keine Erklärung für die vermehrt registrierten Impulse.

Eine Erklärung dieser unspezifischen Impulse könnte in der Funktionsweise des Flüssigkeitssystems (siehe A.2.1) liegen. Die Probenflüssigkeit gewinnt durch den Zusatz von Rinderalbumin eine andere optische Dichte als die Hüllflüssigkeit. Durch Verwirbelung der Probenflüssigkeit mit der Hüllflüssigkeit entstehen an den Grenzflächen beider Medien Reflektionen und Brechungen und gerade diese werden im RT-Streulicht-Detektor registriert. Im FW-Streulicht-Detektor gibt es jedoch nur ein schwaches Korrelat zu diesem Phänomen, so daß im RT/FW-Streulicht-Diagramm eine RT-Streulicht achsennahe Punktwolke entsteht.

Zwei zusätzliche Möglichkeiten unspezifische Impulse zu unterdrücken wurden eingesetzt. Die Rauschschwelle wurde angehoben und zur Betrachtung der Grün-Fluoreszenz ein Rahmen eingerichtet. Das Legen eines Rahmens kann Fehler bedingen. Werden Thrombozyten untersucht, die in ihrer Größe oder Granularität von der Norm abweichen, fallen diese aus der Betrachtung heraus [78]. Von 113 untersuchten Patiententhrombozyten fielen 5 Suspensionen durch einen niedrigen Quotienten "Gated/Total" auf (siehe Abb. D-8). Diese 5 Patienten waren alle thrombozytopenisch und zeigten bei der Separation der Thrombozyten eine Beimengung von Erythrozyten. Eine schlechte Zelltrennung muß für den niedrigen Quotienten verantwortlich gemacht werden.

Eine geringe Verformung der Thrombozytenwolke im RT/FW-Streulicht Diagramm wird beobachtet (siehe D.4.8), wenn eine Absprengung der HLA-Antigene erfolgt [nach 48, 49, 60, 94, 96]. Durch die Behandlung mit Zitronensäure werden einzelne Zellen geschädigt, der Großteil der Thrombozyten erfährt jedoch keine ultrastrukturellen Veränderungen [49, 94]. So scheint der Verlust des beta2-Mikroglobulins keinen Einfluß auf die Zellgranularität zu haben, die Thrombozytenwolke wird nicht im Diagramm verschoben, der Quotient "Gated/Total-Cells" bleibt konstant (siehe Tab. I-15).

Eine Verkleinerung des Quotienten "Gated/Total-Cells" kann jedoch nach Inkubation mit hochtitrigen Antiseren beobachtet werden (siehe Tab. I-13 und I-14). Hier konnte gezeigt werden, daß Verdünnungen von 1:4 und 1:8 des anti-GP Ib-FITC eine Verkleinerung des Quotienten um mehr als 10 % bedingen.

Das Anlegen eines Rahmens an die Thrombozytenwolke im RT/FW-Streulicht Diagramm ist nicht nur eine Hilfe, unspezifisches Rauschen und zerstörte Zellen herauszufiltern, sondern kann auch Rückschlüsse auf die Morphologie der Thrombozyten und die Qualität der Probenvorbereitung zulassen. Holme et al. [27] beschreiben die Lichtstreuung an Thrombozyten als Meßwerkzeug für ihre Größe und Morphologie.

Die für eine Färbung eingesetzte Zellzahl sollte 0,2 bis 1 x 107 Zellen betragen und sich in einem Volumen von 20 - 100 µl befinden [78]. Carter [9] empfiehlt eine Zellkonzentration von 5 x 103 /µl und ein eingesetztes Volumen von 100 µl, entsprechend 5 x 105 Zellen. Für unsere Untersuchungen hat sich eine Zellkonzentration von 100 x 103/µl und ein eingesetztes Volumen von 50 µl bewährt. Die von uns eingesetzte Zellzahl beträgt 5 x 106. Rosenfeld et al. [79, 80] setzen 1 - 5 x 107 Zellen ein, das "Düsseldorf I"-Protokoll [101, 102, 103] empfiehlt 107 Zellen. Lazarchick und Hall [52], sowie Worfolk und Mac Pherson [114] setzten 2 x 106 Thrombozyten ein.

Aus der Labor-Routine mit dem PSIFT [109] und PAIFT [89] ist bekannt, daß die erforderliche Zellzahl von 2 x 106 Zellen für einen Ansatz oft nicht erreicht werden kann. Das Untersuchungsgut stammt meistens von thrombozytopenischen Patienten und die Thrombozytenmenge reicht nicht immer aus, um mehrere Messungen anzusetzen. So war eine Forderung an die Entwicklung eines neuen Testes auch aus thrombozytopenischen Material mehrere Ansätze herzustellen.

Von 102 untersuchten Patientenproben hatten 42 % weniger als 150 x 103 Thrombozyten/µl Vollblut (siehe Abb. D-6). Die eingesetzte Thrombozytenmenge reichte in 94,6 % der Untersuchungen aus, um mehr als 40 % der Thrombozyten nach Inkubation mit anti-HPA-1a-Eluat zu markieren. In 86,5 % aller Messungen konnten mehr als 60 % der Zellen markiert werden (siehe Abb. D-11).

Die eingesetzten Thrombozyten reichten aus, um eine Markierung mit anti-thrombozytären Antikörpern durchzuführen. Bei den untersuchten Blutspendern wurden keine Probleme durch eine schlechte Markierung mit anti-HPA-1a-Eluat registriert (siehe Tab. I-8).

Die Ergebnisse der Markierung der Glykoproteine IIb/IIIa und Ib nach dem "Düsseldorf I"-Protokoll zeigen ähnliche Resultate. Es können mehr als 90 % aller Zellen markiert werden, eine Markierung aller Zellen gelingt jedoch nicht [103]. Iwamoto et al. konnten anti GPIIb/IIIa oder anti-GPIIb Antikörper nicht an Thrombozyten mit diallelen Defekt des GPIIb Genes anlagern [29]. Daß Thrombozyten mit monoallelem Defekt die spezifischen Antikörper vermindert anlagern, konnten Jennings et al. zeigen [30].

Um die Thrombozyten nach dem indirekten Antiglobulinverfahren zu markieren, wurden zu den vorgelegten Thrombozyten 50 µl Antikörperlösung pipettiert. Die optimale Verdünnung wurde durch Titrationen ermittelt (siehe C.1.5, C.2.6 und C.2.8). Die Antikörper-Thrombozyten-Suspension wurde für 30 min bei 37 °C inkubiert.

Ein einmaliger Waschvorgang mit 5 ml PBS-Lösung schloß sich an, so daß die Suspension auf das 50fache verdünnt wurde. Zentrifugation, Abgießen der Waschlösung und Resuspension mit 50 µl anti-IgG-FITC reduzierten das Suspensionsvolumen auf 100 µl. Die primäre Antikörperlösung wurde somit um ein 100faches verdünnt.

Die Verdünnung des anti-IgG-FITC war durchweg 1:60. Nach Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur erfolgte ein zweiter Waschvorgang. Das nach Zentrifugation erhaltene Pellet wurde mit 1 ml PBS-Lösung resuspendiert und auf 5 ml zum Messen aufgefüllt.

Da jede Manipulation an den Thrombozyten zu einem Meßfehler [78] oder zu einer Strukturänderung der Thrombozyten [26] führen kann, wurde nur zwei Mal zentrifugiert. Dem Meßprinzip folgend, darf die Fluoreszenz freier FITC-Moleküle nicht als "zelluläre Fluoreszenz" interpretiert werden, denn die Registrierung von Fluoreszenzimpulsen wird nur durch Signale, die in den Rahmen fallen, getriggert (siehe A.2.5).

Eine optische Täuschung des menschlichen Auges wie sie beim Mikroskopieren entstehen kann, wird durch das Meßprinzip ausgeschlossen. Einziger Sinn des Waschvorganges kann es sein, unspezifisch gebundene FITC-Moleküle zu entfernen und das Abfangen des zweiten Antikörpers durch freie Antikörper zu unterbinden [78]. So schlägt Radbruch [78] für den direkten Test ein einmaliges Waschen und für den indirekten Test ein zweimaliges Waschen vor.

Das durch einen dritten Waschvorgang die Fluoreszenzintensität abnimmt, zeigt Tab. I-1.

Die Vorschrift des "Düsseldorf I"-Protokolles [101, 102, 103] sieht keinen Waschvorgang vor. Hier wird jedoch der anti-IgG-FITC-Antikörper in einem 10fachen Proteinüberschuß zugegeben und zur Messung auf 2,5 ml verdünnt. Sintnicolaas et al. [93] und Rosenfeld et al. [79] waschen nach Inkubation mit dem Testserum dreimal und nach Inkubation mit anti-IgG-FITC einmal. Worfolk und Mac Pherson [114] waschen 4 Mal bevor eine Messung durchgeführt wird.

Der Vorschlag die Inkubationen bei einer Temperatur von 4 - 12 °C durchzuführen [1, 78] wurde von uns nicht befolgt. Eine niedrige Temperatur soll den Antigenverlust durch Modulation an der Zelloberfläche verhindern, dieser Effekt wurde bei Lymphozyten beobachtet. Einige Arbeitsgruppen [79, 114] inkubieren bei 37 °C, andere [52, 93] bei Raumtemperatur.

Eine Markierung der Thrombozyten nach dem direkten Antiglobulinverfahren wurde nach ähnlichem Muster durchgeführt. Zu den vorgelegten Thrombozyten wurden 50 µl des anti-IgG-FITC in einer Verdünnung von 1:60 eingesetzt. Nach Inkubation bei Raumtemperatur wurden 5 ml Waschlösung hinzugegeben und zentrifugiert. Der Überstand abgegossen, das Thrombozytenpellet resuspendiert und mit PBS-Lösung auf 5 ml aufgefüllt. Der einzige Unterschied zum indirekten Antiglobulinverfahren besteht darin, daß kein Testserum hinzugefügt wird und ein Waschvorgang entfällt.

Lazarchick und Hall [52] verfahren ähnlich. Sie führen jedoch einen zweiten Waschvorgang durch. Christopoulos et al. [10] legen 6 - 8 x 106 Thrombozyten vor und inkubieren mit dem anti-IgG-FITC Antikörper eine Stunde bei Raumtemperatur.

Für das direkte und das indirekte Antiglobulinverfahren setzten wir zur Färbung einen FITC-konjugierten F(ab')2 Fragment of Rabbit anti-human IgG oder einen FITC-konjugierten F(ab')2 Fragment of Donkey anti-Mouse IgG Antikörper ein. Durch den Einsatz von F(ab')2 Fragmenten wird die Kopplung an die Fc-Rezeptoren der Thrombozytenoberfläche verhindert und eine unspezifische Fluoreszenz unterdrückt [47]. Ebenfalls mit einem F(ab')2 Fragment werden der PAIFT [89] und zahlreiche durchflußzytometrische Tests [1, 51, 52, 93, 101, 102, 103, 114] durchgeführt.

Die Basiseinstellungen des Durchflußzytometers wurden von Ortho-Diagnostics durchgeführt und von uns nicht verändert. Einstellungen des Rahmens und der Grenze von Positiv- und Negativbereich der Grün-Fluoreszenz wurden jedoch durchgeführt.

Radbruch [78] schlägt zwei Prinzipien vor, die Grenze zwischen Positiv- und Negativbereich zu positionieren. Nach der ersten Methode wird die Grenze so gesetzt, daß bei Negativkontrollen 99 % der Impulse in den Negativbereich fallen. Um die Grenze nach der zweiten Methode zu positionieren, wird ein Zellgemisch von Positiv- und Negativkontrolle hergestellt. Zwischen beiden sichtbaren Peaks im Histogramm wird die Diskriminierung gesetzt. Ein großer Nachteil beider Methoden ist, daß nach Positionierung keine Aussage über die Fluoreszenzintensität gemacht werden kann. Auch wird Information über die Anzahl und Form der Peaks unterdrückt.

Um dieses Problem zu umgehen, wird in der Literatur ein anderes Auswertungsverfahren beschrieben. Die Diskriminierung durch eine Grenze entfällt. Unterschiede in der Fluoreszenzintensität werden als Differenz der mittleren Fluoreszenzen zweier Messungen ausgedrückt. Dieses Verfahren setzt jedoch standardnormalverteilte Fluoreszenzen voraus, da sonst kein Mittelwert (MCN = mean channel number) errechnet werden kann.

Ein technologisch hochentwickeltes Verfahren wie die Durchflußzytometrie sollte adäquate Lösungen anbieten, Messungen auszuwerten, ohne daß Informationen unterdrückt werden oder eine Fehlinterpretation der gewonnenen Daten entsteht.

Um für unsere Messungen eine Grenze zu ermitteln, inkubierten wir Thrombozyten von Blutspendern mit anti-IgG-FITC. Unter der Annahme, daß Negativkontrollen eingesetzt werden, konnte die Grenze zwischen die Kanäle 24/25 eingestellt werden. Von 101 untersuchten Thrombozytensuspensionen zeigten 5 Suspensionen eine Fluoreszenz von mehr als 0,5 % im Positivbereich (siehe Abb. D-4).

Die größte gemessene Fluoreszenz betrug 0,8 % im Positivbereich. Der Mittelwert der Fluoreszenzen im Positivbereich beträgt 0,16 % mit einer Standardabweichung von 0,1 %. Blutgruppenspezifische Unterschiede in der Fluoreszenz konnten nicht festgestellt werden (siehe Tab. D-4).

Nach Inkubation der gleichen Thrombozytensuspensionen mit verdünntem AB-Serum und anschließender anti-IgG-FITC Zugabe stieg die Fluoreszenz im Positivbereich an (siehe Abb. D-5). Hier beträgt der Mittelwert 0,7 % mit einer Standardabweichung von 0,46 %. Wiederum konnten keine blutgruppenspezifischen Unterschiede festgestellt werden (siehe Tab. D-5).

Eine stärkere Fluoreszenz wird nach Inkubation mit 2 %igem Polyglobin im indirekten Antiglobulintest beobachtet. Der Mittelwert der Fluoreszenzen steigt auf 1,52 % mit einer Standardabweichung von 0,43 % (siehe D.2.7). Betrachtet man die Grün-Fluoreszenz der Titrationsreihe des Polyglobins und vergleicht sie mit den mittleren Kanälen im Negativbereich, so scheinen die mittleren Kanäle die feinen Fluoreszenzunterschiede besser zu erfassen (siehe Tab. D-3).

Um den Einfluß einer Autofluoreszenz der Thrombozyten auszuschließen, wurde grundsätzlich von allen separierten Thrombozytensuspensionen 50 µl in ein Kunststoff-Probenröhrchen pipettiert und mit PBS-Lösung auf 5 ml verdünnt. Eine Fluoreszenz im Positivbereich wurde nicht beobachtet (siehe Tab. I-8).

Eine Beeinflussung der Fluoreszenzintensität durch eine Fähigkeit der Thrombozyten zur Autofluoreszenz muß somit ausgeschlossen werden.

Zur Positivkontrolle für den direkten und den indirekten Antiglobulintest verwendeten wir das Eluat eines Serum einer multitransfundierten Patientin der Blutgruppe B. Im MAIPA wurde ein allo-anti-HPA-1a Antikörper und im Lymphotoxicitätstest polyspezifische HLA-Antikörper nachgewiesen. Ein lagerungsbedingter Aktivitätsverlust des Serums (siehe Tab. I-3, I-4) machte den Einsatz eines Antikörpereluats als Positivkontrolle notwendig. Nach Elution konnte die alte Aktivität des Serums wieder erreicht werden (siehe Tab. I-6).

Die maximale Fluoreszenz im Positivbereich nach Inkubation mit dem anti-HPA-1a-Eluat betrug 95,90 %, der Mittelwert 72,75 % mit einer Standardabweichung von 19 %. Diese starke Fluoreszenz unterscheidet sich signifikant von den Negativkontrollen. Das breite Spektrum der Ergebnisse kann darauf zurückgeführt werden, daß die HLA-Antikörper eine unterschiedlich starke Affinität zu den verschiedenen Thrombozytensuspensionen besitzen. Rosenfeld et al. [80] benutzten als Positivkontrolle für den direkten Test ein anti-Faktor VIII (vWF), Christopoulos et al. [10] und Lazarchick und Hall [52] einen anti-HPA-1a Antikörper.

Zur Kontrolle des entwickelten Systems setzten wir monoklonale Antikörper hoher Spezifität ein. 24 Thrombozytensuspensionen wurden mit monoklonalem anti-D und monoklonalem anti-GP IIb/IIIa der Spezifität Maus-IgG im indirekten Test inkubiert (siehe D.2.3). Die Fluoreszenz nach Inkubation mit anti-D ist mit der Fluoreszenz nach Inkubation mit verdünntem AB-Serum im humanen System vergleichbar. Der Mittelwert beträgt 1,02 %, die Standardabweichung 0,4 %. Dagegen fluoreszierten die Thrombozyten nach Inkubation mit anti-GP IIb/IIIa stark. Es ergibt sich ein Mittelwert von 86,00 % mit einer Standardabweichung von 3,56 %. Hier sind die Peaks im Histogramm gleichförmig und symmetrisch.

Tschöpe [103] konnte zeigen, daß sowohl das Glykoprotein IIb/IIIa als auch Ib auf mehr als 90 % der "normalen" Thrombozyten exprimiert wird. Die Merkmale des Rhesus-Systems konnten auf Thrombozyten nicht nachgewiesen werden [63].

Der Nachweis der Blutgruppenantigene, deren Ausprägung auf Thrombozyten schwach und unregelmäßig ist [17, 63], konnte durchgeführt werden. 20 Thrombozytensuspensionen wurden im indirekten Antiglobulinverfahren mit monoklonalem anti-A- und anti-B-Antikörpern der Spezifität Maus-IgG inkubiert (siehe D.2.8). Für das A-Antigen konnten Fluoreszenzen im Positivbereich bis 60,8 %, für das B-Antigen bis 7,0 % gemessen werden (siehe Tab. I-9 und Abb. D-3). Thrombozyten der Blutgruppe 0 zeigten keine auffällige Fluoreszenz. Dunstan und Simpson [17] wiesen in durchflußzytometrischen Tests nach, daß die Blutgruppenantigene A und B auf Thrombozyten vorhanden sind. Sie werden schwächer als das HPA-1a Antigen (MCN = 178) exprimiert, wobei das B-Antigen (MCN = 103) geringer als das A-Antigen (MCN = 157) ausgeprägt wird.

Da blutgruppenspezifische Antikörper einen Einfluß auf die Fluoreszenz haben, sollte eine Testung auf thrombozytenspezifische Antikörper nur mit Zellen der Blutgruppe 0 erfolgen.

Nachdem sich die entwickelte Methode, thrombozytäre Antikörper an Thrombozyten von Blutspendern nachzuweisen, bewährt hatte, sollte ein klinisches Untersuchungsgut den gleichen Tests unterzogen werden.

Insgesamt konnte in 39 Tagen Blut von 102 stationären und ambulanten Patienten der hämato-onkologische Abteilung des Allgemeinen Krankenhauses St.-Georg untersucht werden. Onkologischen Patienten lieferten den Hauptanteil des Untersuchungsmaterials, eine rein thrombozytäre Erkrankung konnte in 4 % des Patientengutes verzeichnet werden (siehe Abb. D-7).

Die Thrombozytenzahl der Patienten erstreckte sich über einen großen Bereich (siehe Abb. D-6). 42 % der Patienten waren thrombozytopenisch, insgesamt hatten 14 % weniger als 50 x 103 Thrombozyten/µl.

Von allen erhaltenen Proben konnten mindestens so viel Thrombozyten isoliert werden, daß die Fluoreszenz im direkten Test und die Autofluoreszenz untersucht werden konnten.

Bei Untersuchung der Spenderthrombozyten ergab sich ein konstante Stärke der Autofluoreszenz. Dieses Beobachtung konnte bei Patiententhrombozyten nicht gemacht werden .Von 113 untersuchten Thrombozytensuspensionen zeigten 15 eine Autofluoreszenz von maximal 0,3 % (siehe Tab. D-6). Ein Einfluß von Medikamenten auf die Autofluoreszenz könnte diesen Effekt bedingen. Chemotherapeutika und Immunsuppressiva verändern zelluläre Strukturen und können in die Zellen aufgenommen werden [66]. Viele dieser Medikamente haben freie Elektronen, die eine Fluoreszenz bedingen können.

Größere Abweichungen von den "Normwerten" wurden beim direkten Test gefunden. Fluoreszenzen bis 33 % im Positivbereich konnten gemessen werden. Mit einer Fluoreszenz von 2,4 %, 6,4 % und 7,3 % fielen drei Patienten mit einer Immunthrombozytopenie auf. Zwei Patienten, die an Lupus erythematodes leiden, zeigten eine Fluoreszenz von 3,2 und 10,3 %. Thrombozyten eines HIV infizierten Patienten fluoreszierten zu 15 % im Positivbereich (siehe Tab. I-10).

Betrachtet man die weiteren Diagnosen der auffälligen Messungen, so ergibt der Vergleich mit der Literatur (siehe Tab. F-1) eine große Übereinstimmung. Viele Autoimmunerkrankungen können den Immunglobulingehalt der Plättchenoberfläche beeinflussen. Auch bei onkologischen Erkrankungen und Infektionen wird ein vermehrtes plättchenassoziiertes IgG beschrieben.

Tab. F-1 Übersicht von Krankheiten, bei denen plättchenassoziiertes IgG vorkommen kann
Autor Methode PaIgG bei Diagnosen
Borne von dem et al. [108] PSIFT Autoimmunhämolytische Anämie, Autoimmun Granulozytopenie, perniziöse Anämie, Autoimmun Thyreoiditis, rheumatoide Arthritis, L. erythematodes und ITP
Christopoulos et al. [10] Flow Cytometry frühe CLL, chronische Lebererkrankung und ITP
Kaden et al. [31] Antiglobulin Consumption Test CLL, Hodgkin Lymphom, NHL
Kelton et al. [33] Antiglobulin Consumption Test oder Fluorescent Assay L. erythematodes, aplastische Anämie, multiple Myelome, Leukämie unter Chemotherapie, ITP
Kunicki und Newman [47]   L. erythematodes, HIV Infektion
Lazarchick und Hall [52] Flow Cytometry Adenokarzinom, autoimmunhämolytische Anämie, L. erythematodes und ITP
McMillan et al. [57] Immunobead Assay oder Microtiter-well Assay ITP
Müller-Eckhardt et al. [61] Platelet radioactive anti-IgG test (PRAT) ITP, SLE, autoimmunhämolytische Anämie, CLL, CML, ALL, AML, Lymphome, Myelome, chronische Lebererkrankung, 
Rosenfeld et al. [80] Flow Cytometry Sepsis, myelodysplastisches Syndrom und ITP
Lin et al. [53] Flow Cytometry und ELISA HIV Infektion

Eine Betrachtung der Fluoreszenzstärke nach dem Mittelwert im Negativbereich ergibt ein ähnliches Diagnosengut (siehe Tab. I-11).

Eine Korrelation der Diagnosen beider Auswertungsmöglichkeiten ist allerdings unbefriedigend, so daß zwei Mechanismen der Anlagerung von plättchenassoziiertem IgG angenommen werden müssen. Alle untersuchten Zellen lagern IgG an, so daß der Fluoreszenzpeak im Histogramm nach rechts wandert und der mittlere Kanal im Negativbereich größer wird.

Lagern nur einige Zellen vermehrt IgG an, so entsteht eine Population, die stärker fluoresziert. Im Positivbereich erscheinen die Impulse, aber der mittlere Kanal im Negativbereich bleibt konstant. Sicherlich treten beide Mechanismen parallel auf, eine genauere Auswertung ist mit den vorhandenen Möglichkeiten nicht durchzuführen.

Ein Rückschluß auf das Vorliegen einer Immunthrombozytopenie bei Nachweis von plättchenassoziiertem IgG kann nicht erfolgen. Christopoulos et al. fanden im Durchschnitt 1463 Moleküle PaIgG (SD = 927) pro normalem Thrombozyt, Patienten mit Immunthrombozytopenie hatten eine PaIgG Dichte von 690 bis 32328 pro Thrombozyt [10].

Eine weitere Diagnostik muß durchgeführt werden, da eine Freisetzung von plättchenassoziierten IgG aus alpha -Granula die Analysen verfälschen kann [7, 23].

Die Positivkontrolle durch eine Inkubation mit anti-HPA-1a-Eluat ergibt ein nahezu identisches Bild (siehe Abb. D-11) wie es bei den untersuchten Blutspendern entstand. Der Mittelwert der Fluoreszenzen im Positivbereich beträgt 72,75 % mit einer Standardabweichung von 14,53% (bei Blutspendern µ  = 72,75 % mit sigma  = 19 %).

Weiter wurde geprüft, ob sich nach Inkubation der Patiententhrombozyten mit eigenem Serum im indirekten Test die Ergebnisse des direkten Testes wiederholen lassen. Der Mittelwert der Fluoreszenzen im Positivbereich nach Inkubation mit dem eigenem Serum beträgt 0,76 % mit einer Standardabweichung von 0,89 % (nach Inkubation mit verdünntem AB-Serum µ  = 0,63 % mit sigma  = 0,41 %). Eine Korrelation der Fluoreszenzen mit den Ergebnissen des direkten Tests liegt nicht vor (R = 0,004). Ein Grund dafür könnte sein, daß keine fixierten Zellen eingesetzt wurden. Durch ein weniger schonendes Vorgehen beim indirekten Test, sowie die Inkubation bei 37 °C wird die Thrombozytenoberfläche geschädigt. Angelagerte Antikörper werden eluiert und Antigene abgestoßen [78].

Ein Problem der Durchflußzytometrie war es, die produzierte Datenflut auszuwerten. Die gemessenen Impulse werden in einer hohen Frequenz an die nachgeschalteten Medien gesendet. Um die empfangenen Daten auszuwerten, Berechnungen anzustellen, eine grafische Darstellung zu liefern und diese auch noch zu speichern, ist eine umfangreiche Datenverarbeitung erforderlich. Mit niedriggetackteten Mikroprozessoren war diese Aufgabe nicht zu bewältigen. Diese Problematik wurde umgangen, indem die empfangenen Daten zuerst abgespeichert wurden. Danach konnte eine weitere Auswertung erfolgen.

Stewart und Price [95] entwickelten 1984 ein System, um die gemessenen Daten während des Meßvorganges auszuwerten. Durch den Einsatz geeigneter Hardware und die Entwicklung eines Assembler-Programms konnte eine 3-Parameter Auswertung erfolgen. Der einzelne Datensatz wird sofort gespeichert, korreliert und in einem farbigen Diagramm auf dem Bildschirm eingetragen.

Heutige Mikroprozessoren haben ein Vielfaches der Leistung früherer Systeme. Umfangreichere statistische Berechnungen, eine bessere grafische Darstellung und die Korrelation von mehr als 3 Parametern sind möglich.

Das CLASSIF1 Programmsystem [105] bietet die Möglichkeit Unterschiede zwischen normalen und abnormen Proben aus mehreren Messungen mit verschiedenen Markern gemeinsam auszuwerten. Unbekannte Proben können prospektiv klassifiziert werden.

Das ONESTEP Programm [99] gibt eine Möglichkeit Zellpopulationen zu identifizieren. Durch die Auswertung von 5 Parametern können in einer grafischen Darstellung die unterschiedlichen Populationen identifiziert werden.

In unserem Labor ist das A.R.S. 4.0e Programmsystem installiert. Es bietet die Möglichkeit 5 Parameter wahlweise zu korrelieren, sowie eine grafische Darstellung in einem Histogramm oder Cytogramm. Ein direkter Vergleich zweier Messungen kann nur durch eine Berechnung der Mittelwerte und der Standardabweichungen der Parameter erfolgen.

Diese Methode, Messungen auszuwerten, bietet vielleicht in der Laborroutine Vorteile, sie eignet sich jedoch nicht für wissenschaftliche Untersuchungen [105]. Eine Analyse der einzelnen Kanäle ist z.B. notwendig, um zwei Populationen in einer Meßprobe zu unterscheiden. Auch die Beurteilung der Fluoreszenzstärke ist nur über die Kenntnis der Verteilung über die Kanäle möglich. Die Aussage, 80% der gemessenen Zellen befinden sich im Positivbereich, läßt keine Schlüsse über die Verteilung zu (siehe Abb. F-1). [78]

Abb. F-1 Histogramme; 80 % der Impulse im Positivbereich

Um jedoch eine selektive Analyse der Grün-Fluoreszenzen durchzuführen, müssen die Inhalte der einzelnen Kanäle bekannt sein. Da die zu Verfügung stehende Software nicht die gewünschten Informationen liefern kann, haben wir ein eigenes Auswertungsprogramm entwickelt.

Mit der Software A.R.S. 4.0e werden die Messungen gespeichert und anschließend mit unserem Programm verarbeitet. Durch eine Assembler-unterstützte Berechnung liegen dann die Inhalte der einzelnen Kanäle der Grün-Fluoreszenz (oder anderer Parameter) in einer neuen Datei gespeichert vor. Diese Dateien sind durch ihren komprimierten Inhalt klein, so daß viele Messungen in einer Datenbank verwaltet werden können. Eine Verlaufskontrolle eines klinischen Falles oder ein Vergleich mit ähnlichen Messungen wird durch eine schnell abrufbare Datensammlung möglich.

Dieser Zugriff auf die niedrigste Ebene, nämlich auf die gemessenen Impulse, eröffnet eine Fülle von weiteren Ansätzen, Messungen auszuwerten und darzustellen;

Eine Korrelation zweier Parameter, wie z. B. RT-Streulicht und FW-Streulicht oder das Setzen eines Rahmens zur selektiven Betrachtung der Grün-Fluoreszenz ist möglich.

Die Projektion mehrerer Messungen in ein Histogramm oder eine Teildarstellung sind weitere Möglichkeiten eine aussagefähige Darstellungsmethode zu erhalten.

Um den statistischen Vergleich mehrerer Messungen anstellen zu können, wird über der Summenhäufigkeitsprozentkurve der Grün-Fluoreszenz eine Regressionsanalyse durchgeführt. Die Berechnung des 50%-Kanals und dessen Standardabweichung liefert ein Parameter, mit welchem der direkte Vergleich zweier Messungen erfolgen kann. Da der 50%-Kanal ein Maß der Fluoreszenzintensität ist, wird eine semiquantitative Aussage möglich.

Ein weiterer Vorteil dieser neu entwickelten Methode ist, daß der Benutzer eine adäquate Darstellung der Ergebnisse wählen kann und die Möglichkeit hat, durch Projektion von mehreren Messungen in ein Diagramm, einen Vergleich anzustellen. Weiterhin kann die statistische Aufarbeitung durch den Anwender dirigiert werden. Eine Bereichsanalyse eines Histogrammabschnitts bietet die Möglichkeit einzelne Peaks getrennt auszuwerten.

Um das entwickelte Programmpaket zu testen, haben wir weitere Versuche durchgeführt.

Durch eine farbige Darstellung der Punktdichte in dem FW/RT-Streulicht Diagramm (siehe Abb. D-14) konnten wir feststellen, daß das gesetzte Fenster nicht optimal positioniert war. Der Bereich größter Dichte an Impulsen lag nicht mittig, er wurde für weitere Auswertungen korrigiert. Die Entdeckung dieses Auswertungsfehlers wurde erst durch eine Darstellung der Impulsdichte möglich. Die Standardauswertung bietet nicht die Möglichkeit die Position des gesetzten Fensters zu kontrollieren, da keine Darstellung der Impulsdichte angezeigt wird. Eine Darstellung von Isolinien, die ebenfalls die Impulsdichte berücksichtigt, ist eine weitere Methode die Einstellung des Fensters zu überprüfen [9, 78].

Ob der Quotient "Gated/Total-Cells" nach Inkubation mit einem FITC konjugierten Antikörper konstant bleibt, wurde durch die Analyse einer Titrationsreihe mit anti-GP Ib überprüft. Es zeigte sich, daß bei niedrig verdünntem (hochtitrigem) Antikörper eine Verschiebung der Punktwolke im RT/FW-Streulicht Diagramm stattfindet (siehe Tab. I-13 und I-14). Die einzelnen Impulse zeigen dabei eine vermehrte Rechtwinkel- und Vorwärts-Streuung. Der Quotient sinkt um circa 10 %. Ursache für diese Verschiebung kann die Entstehung von Thrombozytenagglutinaten sein [78]. Gerade bei Fluoreszenzanalysen verfälschen Agglutinate die Ergebnisse. Sie werden als Impuls einer Zelle registriert, fluoreszieren aber deutlich mehr, als bei einer Zelle zu erwarten ist.

Vergleicht man die Fluoreszenzen von allen registrierten Impulsen (Total Cells) mit den Fluoreszenzen der "Gated Cells", so wird diese Annahme bestätigt. Der 50%-Kanal ist nach Inkubation mit niedrig- und mitteltitrigem Antikörper gleich. Wird der Quotient "Gated/Total-Cells" jedoch durch Inkubation mit hochtitrigem Antikörper kleiner, differieren die 50%-Kanäle der Grün-Fluoreszenz.

Die Grün-Fluoreszenz aller registrierten Impulse nimmt stärker zu, als die der "Gated-Cells". Zusätzlich wird die Standardabweichung der 50%-Kanäle größer und die Trennschärfe der Messung somit kleiner, so daß wir uns entschieden haben alle weiteren Betrachtungen an "Gated-Cells" durchzuführen.

Die Abhängigkeit der Fluoreszenzstärke von der Zellgröße und -Granularität läßt sich weiter untersuchen. Hierzu wurde die Grün-Fluoreszenz gegen die Vorwärts-Streuung und gegen die Rechtwinkel-Streuung in einem Diagramm aufgetragen (siehe Abb. D-16). Gleichzeitig wurden die Korrelationskoeffizienten berechnet (siehe Tab. D-8). Bei stark fluoreszierenden Thrombozyten besteht ein stochastisch linearer Zusammenhang zwischen Grün-Fluoreszenz und Rechtwinkel- oder Vorwärts-Streulicht, wobei die Korrelation zum Rechtwinkel-Streulicht (r = 0,82) und somit zur Zellgranularität höher als zur Zellgröße (r = 0,76) ist. Holme et al. [27] fanden durch ihre Untersuchungen ebenfalls einen stochastisch linearen Zusammenhang, jedoch fielen die Korrelationskoeffizienten kleiner aus. In einer anderen Arbeit von Holme et al. [28] wurden die Mittelwerte der Grün-Fluoreszenz mit dem plättchengebundenem IgG korreliert. Die Korrelation der Zellgröße und -Granularität war noch schwächer. Diese schwache Korrelation findet sich auch in unseren Untersuchungen, wenn der FITC gekoppelte Antikörper hoch verdünnt wird (siehe Tab. D-8). Solche Untersuchungen scheinen aber doch erst dann plausibel, wenn der Antikörper in einer hohen Konzentration vorliegt, so daß die Antikörper-Antigen Bindung nicht zufällig erfolgt, sondern unter einer Konkurrenzsituation.

Um signifikante Unterschiede der Fluoreszenzintensität festzustellen, entwickelten wir ein Rechenmodell. Von zwei Messungen werden die Intervalle berechnet, in denen die 50%-Kanäle zu 99,9 % (±3 Sigma) liegen. Überschneiden sich die Intervalle nicht, so besteht ein signifikanter (alpha = 0,01) Unterschied in der Fluoreszenzintensität beider Messungen.

Radbruch [78] rechnet bei logarithmischer Darstellung mit dem geometrischem Mittel und dem Variationskoeffizienten der Fluoreszenzen. Die Bestimmung beider Maße kann aber nur durchgeführt werden, wenn die Verteilung der Fluoreszenzen symmetrisch um den Mittelwert verteilt ist. Vergleiche der Fluoreszenzintensität erfolgen über die Differenz der Mittelwerte und der Variationskoeffizienten.

Mit unseren Berechnungen kann ein signifikanter Unterschied der Fluoreszenzen bis zu einer Verdünnung von 1:512 des anti-GP Ib Antikörpers festgestellt werden (siehe Tab. D-7).

Die Erstellung von Normbereichen mit dem entwickelten Programm zeigte eine gerätebedingte Schwäche auf. Zur Feststellung der Normbereiche wurden 59 Thrombozytensuspensionen untersucht. Nach Messung der Autofluoreszenz liegt die Spannweite der 50%-Kanäle zwischen 3,15 und 7,0. Die Darstellung in einem Häufigkeitsdiagramm zeigt eine ungleichmäßige Verteilung (Abb. D-17). Auffällig ist, daß Messungen, deren 50%-Kanal größer als 6,0 ist, an einem Tag erstellt wurden. Da ein Einfluß der Färbung und der Probenaufbereitung auf die Ergebnisse auszuschließen ist, muß eine gerätebedingte Streuung der Werte angenommen werden. Durchflußzytometer reagieren auf Schwankungen der Umgebungstemperatur empfindlich [82]. Sie sollten deswegen in einem temperaturkonstanten Labor aufgestellt werden. Auch sind die Signal-registrierenden Photomultiplier temperaturempfindlich. Eine Zeitspanne nach Einschalten des Gerätes bis zur ersten Messung sollte eingehalten werden, die empfindlichen Sensoren können so ihre Arbeitstemperatur erreichen.

Die Grün-Fluoreszenz nach Inkubation mit anti-IgG-FITC bestätigt die gerätebedingte Streuung. Die Spannweite der 50%-Kanäle reicht von 3,58 bis 11,6. Die Darstellung der Werte im Häufigkeitsdiagramm zeigt wiederum eine ungleichmäßige Verteilung (siehe Abb. D-18).

Messungen, deren 50%-Kanäle größer als 7,0 sind, wurden an dem gleichen Tag erstellt wie die auffälligen Messungen der Autofluoreszenz.

Die Berechnung der 95% Vertrauensbereiche ist unbefriedigend. So fallen bei der Autofluoreszenz 50 % der Werte und bei der Grün-Fluoreszenz 62 % aus dem 95% Vertrauensbereich des Medians heraus. Nach unseren Erkenntnissen kann die Erstellung eines Normbereiches nur in einem temperaturstabilen Labor unter Einhaltung einer definierten Vorwärmzeit des Gerätes geschehen. Diese Beobachtung konnten wir nur machen, nachdem die Auswertungsmethode in ihrer Sensitivität verbessert wurde.

Die entwickelte Auswertungsmethode sollte weiterhin an Mischpopulationen getestet werden. Da wir keine thrombozytären Antikörper hatten, mit denen sich Mischpopulationen untersuchen lassen, haben wir Zellen gesucht, die keine humanen thrombozytären Antigene an ihrer Oberfläche exprimieren. Rinder-Thrombozyten zeigten nach Inkubation mit anti-GP Ib-FITC keine Fluoreszenz, ein statistisch signifikanter Unterschied zur Autofluoreszenz konnte nicht festgestellt werden. Ebenso konnte kein signifikanter Unterschied in der Autofluoreszenz von humanen und Rinder-Thrombozyten festgestellt werden (siehe Tab. D-10).

Die Darstellung der Rinder-Thrombozyten im FW/RT-Streulicht Diagramm (siehe Abb. D-20) zeigt eine starke Ähnlichkeit zu humanen Thrombozyten.

Ein Vergleich der 50%-Kanäle des Vorwärts- und des Rechtwinkel-Streulichts ergibt, daß die Größe und die Granularität von Rinder-Thrombozyten kleiner als die von humanen Thrombozyten ist (siehe Tab. D-9). Dieser Unterschied beträgt für beide Streulichter 10 Kanäle und bedingt, daß der Quotient "Gated/Total" der Rinder-Thrombozyten ebenfalls kleiner ist.

Humane Thrombozyten wurden mit Rinder-Thrombozyten gemischt und anschließend mit anti-GP Ib-FITC inkubiert. Im Histogramm zeigten sich zwei Peaks; der rechte entsteht durch fluoreszierende humane Thrombozyten, der linke durch die Rinder-Thrombozyten. Die gleichen Daten in einer Summenhäufigkeitsprozentkurve (siehe Abb. D-21) aufgetragen, verdeutlichen das Vorliegen einer Mischung. Wiederum liegt rechts ein Abschnitt, der durch die Fluoreszenz der humanen Thrombozyten erzeugt wird und links ein Abschnitt, der durch die Rinder-Thrombozyten gebildet wird. Zwischen beiden Abschnitten liegt ein Plateau. Dieses ist bei hoher Trennung beider Populationen x-Achsen parallel. Die Regressionsanalyse der Summenhäufigkeitsprozente ist hier mit einem größeren Fehler behaftet. Der Regressionskoeffizient variiert in der Meßreihe von -0,99 bis -0,80.

Beim Vorliegen einer Mischung von fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Zellen haben wir jedoch mit unserer Auswertungsmethode die Möglichkeit beide Peaks getrennt zu analysieren. Für den Ansatz, bei dem 50 % Rinder-Thrombozyten und 50 % humane Thrombozyten gemischt wurden, haben wir eine Regressionsanalyse über den Bereich von 5 bis 25 % durchgeführt (siehe Abb. D-22). Der Regressionskoeffizient ist -1,00 und der 15%-Kanal 59,20. Für semiquantitative Betrachtungen der Fluoreszenz der humanen Thrombozyten konnte durch eine Abschnitts-Regressionsanalyse ein Wert gewonnen werden.

Wünschenswert für eine Weiterentwicklung des Auswertungsprogramms wäre die mathematische Berechnung der Bereichsgrenzen der verschiedenen Peaks und auf diesen Daten basierend eine Regressionsanalyse. Ein möglicher Ansatz könnte die Differentialrechnung bieten.

Eine Mischpopulation entsteht ebenfalls nach Freilegung des T-Kryptantigen von Thrombozyten (siehe Abb. D-23). Das Kryptantigen wurde nach einer enzymatischen Behandlung durch Vibrio Cholera Sialidase mit anti-T-Lektin-FITC (Erdnuß) markiert. Auch die Sialidase-Behandlung hat Einfluß auf den Quotienten "Gated/Total-Cells"; er sinkt um 9,2 bzw. 8,8 %.

Eine Diskriminierung in Positiv- und Negativbereich bei Kanal 24/25 teilt 51 % aller Thrombozyten als fluoreszierend ein. Nicht Sialidase behandelte Thrombozyten, die mit anti-T-FITC markiert wurden, fluoreszieren zu 14,7 % im Positivbereich, nur Sialidase behandelte zu 4,2 %, die Autofluoreszenz beträgt 0 %.

Eine Auswertung nach unserer regressionsanalytischen Methode zeigt, daß zwischen der Fluoreszenz, der nur mit Sialidase behandelten Zellen, und der Autofluoreszenz kein signifikanter Unterschied besteht (siehe Tab. D-11). Nach Inkubation mit anti-T-FITC läßt sich jedoch ein signifikanter Unterschied (alpha = 0,01) feststellen.

Eine Regressionsanalyse, der Sialidase und anti-T-FITC behandelten Zellen, ist mit einem großen Fehler behaftet.

Wegen des Vorhandenseins von 2 Peaks muß eine Abschnittsanalyse durchgeführt werden. Über dem Bereich von 5 - 40 % läßt sich analog der 20%-Kanal bestimmen (siehe Abb. D-24). Dieser 20%-Kanal, der die stark fluoreszierenden Thrombozyten beschreibt, liegt statistisch signifikant von den anderen Messungen entfernt.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß eine reine Sialidase Behandlung von Thrombozyten keinen Einfluß auf die Fluoreszenz hat, daß anti-T-FITC gering an Thrombozyten angelagert wird (spezifisch oder unspezifisch?) und daß nach Sialidase Behandlung das T-Kryptantigen bei circa 50 % aller Thrombozyten nachweisbar ist.

Für die Versorgung von Patienten mit thrombozytenspezifischen Antikörpern ist es wünschenswert, ein Register von typisierten Thrombozytenspendern anzulegen, um möglichst schnell kompatible Thrombozytenpräparate zur Verfügung stellen zu können. Für die Typisierung wird der MAIPA [35, 36, 37, 39, 41] in unserem Labor angewandt. Die uns zur Verfügung stehenden Testseren enthalten HLA-Antikörper, durch sie wird eine Typisierung der thrombozytenspezifischen Antigene im indirekten Immunfluoreszenztest erschwert. Eine Möglichkeit die Bindung der HLA-Antikörper zu verhindern, ist die Absprengung der HLA-Antigene mit Chloroquin [50, 94] oder Zitronensäure [49, 60, 96]. Freedman et al. [19] testen Serum gegen Thrombo- und Lymphozyten gleichzeitig, Fluoreszenz der Lymphozyten bestätigt das Vorhandensein von HLA-Antikörpern. In einem zweiten Schritt werden die HLA-Antigene abgesprengt und die Proben auf thrombozytenspezifische Antikörper getestet.

Für die Durchflußzytometrie ist die Zitronensäurebehandlung ein geeignetes Verfahren zur Antigenabsprengung. Wenig Zellen werden durch die Behandlung zerstört, Thrombozyten spezifische Antigene erhalten, HLA-Klasse I Aktivität reduziert und unspezifische Fluoreszenzen vermindert [48, 67].

Sechs, im MAIPA typisierte Blutspender, sollten im durchflußzytometrischen Test nachtypisiert werden. Nach Zitronensäurebehandlung der Thrombozyten ist eine geringe Verschiebung der Punktwolke im RT/FW-Streulicht Diagramm zu beobachten (siehe Abb. D-25).

Der Quotient "Gated-Total-Cells" ist nicht signifikant geringer (siehe Tab. I-15). Kurata et al. beschreiben eine Ausbeute nach Säurebehandlung von 83,4 % im Gegensatz zur Chloroquin-Behandlung mit 52,6 % [48]. Die Autofluoreszenz der manipulierten Thrombozyten differiert gering von der Fluoreszenz unbehandelter Thrombozyten. Von drei Messungen liegen die 50%-Kanäle innerhalb des 95% Vertrauensbereichs, die der restlichen knapp darüber.

Die 50%-Kanäle der Fluoreszenz nach Inkubation mit anti-IgG-FITC liegen außerhalb des 95% Vertrauensbereichs. Der Wert dieser Aussagen sei in Frage gestellt, da eine gerätebedingte Erhöhung der Meßwerte nicht ausgeschlossen werden kann. Die berechneten Werte liegen jedoch innerhalb der beobachteten Spannweite der Normbereiche. Der Vergleich der Fluoreszenzen nach Inkubation mit anti-IgG-FITC mit den Autofluoreszenzen zeigt eine statistisch signifikante Erhöhung der Fluoreszenz (siehe Tab. I-16). Dieser Unterschied konnte bei den gleichen Zellen ohne Säurebehandlung nicht nachgewiesen werden.

Nach Inkubation mit dem anti-HPA-1a-Eluat, welches unspezifische HLA-Antikörper enthielt, konnte das "offizielle" MAIPA Ergebnis wiederholt werden. Die Fluoreszenz HPA-1a positiver Thrombozyten unterscheidet sich statistisch signifikant von der HPA-1a negativer Zellen und von der der Negativkontrollen. Die Fluoreszenz HPA-1a negativer Thrombozyten unterscheidet sich dagegen nicht signifikant von der Fluoreszenz der Negativkontrollen. Auch die Thrombozytentypisierung läßt sich mit dem entwickelten Auswertungsprogramm eindeutig durchführen. Die Darstellung der Ergebnisse im Balkendiagramm (Abb. D-26) verdeutlicht und erleichtert die Interpretation der berechneten Werte. Wang et al. [111] konnten nachweisen, daß eine Abstoßungsreaktion nach Nierentransplantation durch einen durchflußzytometrischen Thrombozytencrossmatch signifikant gesenkt werden kann. Gates et al. [20] fanden in einer retrospektiven Studie, daß die Sensitivität der Durchflußzytometrie für Crossmatch höher ist, als im PAIFT oder im Lymphozytotoxizitätstest. Plättchen-reaktive Antikörper können mit einer Sensitivität von 94,7 % und einer Spezifität von 96,3 % gefunden werden, wenn der MAIPA als Referenzmethode eingesetzt wird. In Bezug auf adäquaten Transfusions-Erfolg bietet der durchflußzytometrische Test von Thrombozyten eine höhere Sensitivität und Effizienz als der Lymphozytotoxizitätstest oder die Lymphozyten-Durchflußzytometrie [43].

Die neonatale Alloimmunthrombozytopenie (NAITP) wird durch mütterliche Immunisierung gegen ein fetales, vom Vater geerbtes thrombozytäres Antigen hervorgerufen. In den meisten Fällen sind die Antigene HPA-1a und HPA-5b beteiligt, während die Immunisierung gegen andere Merkmale weitaus seltener ist. Die Frequenz der NAITP liegt zwischen 1:2000 bis 1:5000 Geburten. In den meisten Fällen ist sie benigne und dauert 2 - 14 Tage. Panzer et al. [72] fanden unter 933 Neugeborenen 18 Seren mit thrombozytenspezifischen Alloantikörpern, ein Serum mit anti-HPA-3a und 17 mit anti-HPA-5b Antikörpern. Keines dieser Neugeborenen war thrombozytopenisch, jedoch vier der 933 Neugeborenen mit anti-HLA Klasse I Antikörpern. Eine schwere Komplikation ist die intracranielle Hämorrhagie, fast alle beschriebenen Blutungen gehen mit anti-HPA-1a Antikörpern einher.

Der Pathomechanismus ist unklar, HPA-1a und HPA-5b Antigene werden auch auf Endothelzellen exprimiert. Eine intracranielle Hämorrhagie in Verbindung mit einer NAITP der Spezifität anti-HPA-5b wurde noch nicht beschrieben.

Die beschriebene Frühgeborene zeigte, neben einer allgemeinen Unreife, Zeichen einer milden Thrombozytopenie von 80 Thrombozyten/nl. Im weiteren stationären Verlauf sank die Thrombozytenzahl auf 7/nl. Durch tägliche Gabe von Thrombozytenkonzentraten konnte ein Niveau von 20 - 40 Thrombozyten/nl gehalten werden. Klinisch konnten keine Zeichen einer Infektion oder einer anderen Ursache gefunden werden, so daß der Verdacht auf eine NAITP bestand.

Zur Sicherung der Diagnose wurde Blut der Mutter und des Frühgeborenen in unserem Labor untersucht. Im PSIFT fanden sich thrombozytäre Antikörper, die mit dem MAIPA als niedrigtitrige anti-HPA-5b Antikörper spezifiziert wurden. Weiterhin fanden sich im Lymphotoxicitätstest hochtitrige anti-HLA-A2 Antikörper. Nach einmaliger Gabe eines mütterlichen, gewaschenen und bestrahlten (30 Gray) Thrombozytenhochkonzentrats am 6. Tag konnten kontinuierlich steigende Thrombozytenzahlen festgestellt werden.

Ob sich der klinische Erfolg durch die Gabe der mütterlichen Thrombozyten oder durch ein Wegfangen der Antikörper durch die nicht typisierten Thrombozyten einstellte, konnte nicht nachgeprüft werden. Ein Zusammenhang des milden klinischen Verlaufes mit der zusätzlichen Präsenz von HLA-Antikörpern, wie bei der Rhesus-Erythroblastose beschrieben [15, 16, 65, 73], ist zu überlegen, wurde in der Literatur bis jetzt aber noch nicht erwähnt.

Die Autofluoreszenz, sowie die Fluoreszenz der Thrombozyten der Mutter und des Vaters nach Inkubation mit anti-IgG liegen in den erarbeiteten 95% Vertrauensbereichen, sie unterscheiden sich nicht signifikant (siehe Tab. E-1 und Tab. I-17). Es ist somit davon auszugehen, daß eine milde Autoimmunthrombozytopenie [98] der Mutter nicht vorliegt.

Werden jedoch Thrombozyten des Vaters mit Serum der Mutter im indirekten Test inkubiert, entsteht eine Fluoreszenz. Der 50%-Kanal weicht signifikant (alpha = 0,01) von den Kontrollen ab. Im Histogramm (siehe Abb. E-1) erkennt man einen breitbasigen Peak.

Es konnte mit diesem Test der Nachweis erbracht werden, daß im Serum der Mutter Antikörper vorliegen, die mit Thrombozyten des Vaters reagieren. Eine milde Autoimmunthrombozytopenie der Mutter als Ursache einer neonatalen Thrombozytopenie konnte nicht nachgewiesen werden, da die Thrombozyten der Mutter im direkten Test nicht fluoreszierten (siehe Tab. I-17).

Die Durchführung des Testes dauert circa 80 min (ohne Thrombozytenseparation), das Ergebnis ist eindeutig und erhärtet den Verdacht auf eine NAITP. Nach Einsendung des Materials könnte am gleichen Tag mit einer adäquaten Therapie begonnen werden.

Eine Titration des Serums der Mutter gegen Thrombozyten des Vaters konnte eine Reaktion bis zu einer Verdünnung von 1:512 nachweisen (siehe Tab. E-2).

Zur abschließenden Diagnosesicherung wurden die Thrombozyten der Mutter und des Vater im MAIPA typisiert.

Die Spezifität der Antikörper ist in einigen Fällen mit bestimmten Subklassen verbunden. So sind die meisten Proteinantikörper IgG1 und IgG3. Beide haben die Fähigkeit der Opsonierung und sind am potentesten [63]. Poretti et al. wiesen einen Erhöhung der IgG1, IgG2 und IgG3 Subklassen im Serum einer Patientin mit anti-HPA-1a Alloimmunthrombozytopenie nach, ohne jedoch den thrombozytenspezifischen Antikörper näher zu klassifizieren [76].

Die Reaktivität der Antikörper sollte durch eine IgG Subklassen Bestimmung erklärt werden. Die vorhandenen Antikörper konnten der IgG1 Subklasse zugeordnet werden. Nur der anti-IgG1-FITC-Antikörper reagierte im indirekten Test (siehe Abb. E-2), die anderen eingesetzten Antikörper konnten keine signifikant stärkere Fluoreszenz erzeugen (siehe Tab. I-18).

Tijhuis et al. [100] untersuchten in einem Radioimmunoassay IgG Subklassen von Patienten mit Immunthrombozytopenien. Die Subklassen IgG1 und IgG3 waren in ihren Untersuchungen am häufigsten vertreten (IgG1 = 21,7 %, IgG3 = 8,7 %, IgG1 und IgG3 = 47,8 %). Parinaud et al. [73] wiesen unter den Subklassen eine größere hämolysierende Wirkung des IgG1 Antikörpers bei Patienten mit anti-D Rhesus-Erythroblastose nach. Sie vermuten einen Einfluß der Antikörpersubklasse auf die Prognose.

Die Verwendung des Serums der Mutter als Testserum zur HPA-5b Typisierung ist ungeeignet. Der Nachweis thrombozytenspezifischer Antikörper, bei Patienten deren Seren HLA-Antikörper aufweisen, ist nur unter aufwendigen Bedingungen möglich [88]. Der Versuch den thrombozytenspezifischen Antikörper durch Elution oder Adsorption zu isolieren, schlug fehl. Blutspender, deren Antigeneigenschaften geeignet sind eine Aufbereitung auszuführen, sind schwer zu finden. Der HLA-A2 Antikörper wies zudem eine starke Kreuzreaktivität auf und erschwerte die Suche nach geeigneten Zellen.

Zum Schutz des Kindes bei Risikoschwangerschaften sollte eine pränatale Genotypisierung [12] diskutiert werden. Eine frühestmögliche Diagnosestellung ist jedoch in Verdachtsfällen unbedingt zu fordern.

Vom Glykoproteinkomplex Ib/IX werden 20-30.000 Kopien auf einem Thrombozyten exprimiert [47]. Die mittlere Moleküldichte für den IIb/IIIa Komplex liegt etwa bei 97.000/Thrombozyt [102]. Das Glykoprotein Ia, auf dem das HPA-5b Antigen liegt, wird nur in 2.000 Kopien [41, 47] auf der Oberfläche exprimiert. Eine Markierung des HPA-5b Antigens muß eine geringere Fluoreszenz erzeugen als die Markierung der Antigene des Komplexes IIb/IIIa oder Ib/IX, da die Fluoreszenzintensität von der Anzahl der gebundenen Fluorochrome abhängt [10, 103]. Tschöpe et al. [102] konnten die Moleküldichte über die Fluoreszenzintensität in einem durchflußzytometrischen Assay bestimmen. Auch Dunstan und Simpson [17] wiesen im Durchflußzytometer eine heterogene Verteilung thrombozytärer Antigene nach.

Der Nachweis eines niedrigtitrigen Antikörpers, der gegen ein wenig exprimiertes Antigen gerichtet ist, kann im Immunfluoreszenzverfahren nur gelingen, wenn der Fluoreszenzbackground gering ist. HLA-Antikörper der gleichen Spezifität wie der thrombozytenspezifische Antikörper erzeugen jedoch einen hohen Background.

Eine Verstärkung der spezifischen Fluoreszenz könnte durch Verwendung eines dritten Antikörpers geschehen. Der humane anti-HPA-5b Antikörper würde als erster an den Thrombozyten binden. Ein zweiter anti-human-IgG Antikörper der Maus bindet an den humanen Antikörper. Ein dritter FITC konjugierter anti-Maus-IgG Antikörper bildet den Abschluß. So ergibt sich eine Vervielfachung der Antikörperbindungsstellen.

Zwei Möglichkeiten den Einfluß der unspezifischen Fluoreszenz und der Autofluoreszenz zu minimieren, beschreiben Gross et al. [24]. Sie markieren Zellen, die nicht von Interesse sind mit einer "Ausschlußfarbe" und Zellen von Interesse mit zwei Farben. So erhalten sie zwei zusätzliche Kriterien falsch positive Zellen zu erkennen.

Zusätzlich reinigten sie die Probenleitung, die Filter und die Meßröhre ad extenso, um angelagerte Zelltrümmer aus vorhergehenden Versuchen zu eliminieren.

Eine weitere Methode unspezifische Impulse auszuschließen, basiert auf der Fähigkeit zwei verschiedene Fluorochrome auf einer Zelle zu unterscheiden. Unter der Annahme, daß die zu untersuchenden Thrombozyten alle Glykoproteine exprimieren, würde man den Glykoproteinkomplex IIb/IIIa mit einem Phycoerythrin konjugierten monoklonalen Antikörper, das HPA-5b Antigen im indirekten Test mit einem FITC konjugiertem Antikörper markieren. Als unspezifisch würden alle Impulse gewertet, die keine Orange-Fluoreszenz zeigen, also kein Glykoproteinkomplex IIb/IIIa exprimieren. Thrombozyten, die beide Fluorochrome binden würden, hätten die Eigenschaft HPA-5b. Zellen, die nur den monoklonalen Antikörper binden, würden nur eine Orange-Fluoreszenz zeigen und wären HPA-5b negativ. Bode [7] untersucht nach dem beschriebenen Prinzip sogar Thrombozyten aus Vollblut und plättchenreichem Plasma, darf aber nur thrombozytenspezifische monoklonale Antikörper zur Differenzierung einsetzten.

Eine Methode die Spezifität des durchflußzytometrischen Verfahrens zu erhöhen beschrieb Rothe [81]. Diese Methode basiert auf einem Resonanz-Energietransfer (FRET) von zwei eng benachbarten Fluorochromen. Ein Fluorochrom ist an das Glykoprotein, ein anderes Fluorochrom auf ein antigenes Epitop des gleichen oder eng benachbarten Glykoproteins gebunden. Wird selektiv das erste Fluorochrommolekül angeregt, kann es die aufgenommene Energie auf das zweite Fluorochrommolekül übertragen. Gemessen wird die Fluoreszenz des zweiten Fluorochromfarbstoffes. Koksch et al. [44] beschreiben einen durchflußzytometrischen Test, basierend auf Resonanz-Energietransfer. Ihr Test erlaubt eine Diskriminierung von unspezifisch, an Fc-gamma Rezeptor, zu spezifisch, an Glykoproteine oder an HLA Class I Strukturen, gebundenen Antikörpern. Eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens könnte das durchflußzytometrische Äquivalent zum MAIPA sein.

G Zusammenfassung

Die vorliegende Dissertation wurde im Zentralinstitut für Transfusionsmedizin, Hamburg-Eilbek, in der Zeit von März 1992 bis August 1996 angefertigt. Ziel der Dissertation war es, mit dem Durchflußzytometer CYTORON ® eine Methode zu entwickeln, mit der thrombozytäre Antikörper nachgewiesen werden können.

Die entwickelte Methode beruht auf einer Thrombozytenseparation und anschließender Färbung mit dem Fluorochromfarbstoff Fluoreszeinisothiocyanat. Farbstoff-konjugierte Antikörper wurden im direkten oder indirekten Antiglobulinverfahren auf die Zelloberfläche gebunden. Durch den Einsatz von monoklonalen Antikörpern konnten die klassischen Blutgruppeneigenschaften und die thrombozytären Glykoproteine untersucht werden. Mit Patienten-Seren wurden das HPA-1a und das HPA-5b Antigen im indirekten Immunfluoreszenztest nachgewiesen.

Durch die Untersuchung von Thrombozyten gesunder Blutspender konnte ein Normbereich erarbeitet werden. Eine Analyse von Seren und Thrombozyten hämato-onkologischer Patienten des Allgemeinen Krankenhauses St.-Georg konnte Abweichungen von dem erarbeiteten Normbereich aufzeigen. Die Diagnosen der Patienten mit abweichenden Meßergebnissen decken sich mit denen, der in der Literatur beschriebenen Krankheiten.

Ein großes Problem stellte die Auswertung der Meßergebnisse dar. Eine Diskriminierung des Fluoreszenzimpulses einer Zelle in einen Positiv- oder Negativbereich ist nicht ausreichend. Die Reduktion der Information auf die Unterteilung in zwei Bereiche konnte durch Entwicklung eines eigenen Programmes umgangen werden. Mit diesen Basisinformationen entwickelten wir ein Auswertungsprogramm. So wurde es möglich, Messungen statistisch zu vergleichen. Zusätzlich konnten wir eine individuelle grafische Darstellungen der Ergebnisse entwickeln. Durch Komprimierung der Informationen einer Messung von circa 250 KByte auf 1 KByte ist es uns möglich geworden, alle durchgeführten Messungen in einer Datenbank zu speichern und sie jederzeit aufrufen zu können.

Die Leistungsfähigkeit des entwickelten Auswertungsprogramms konnte in weiteren Messungen gezeigt werden. Es wurden nochmals Thrombozyten gesunder Blutspender untersucht. Durch die erhöhte Sensitivität wurden tägliche Schwankungen der Fluoreszenzstärke deutlich, woraus sich die Forderung nach einer Qualitätskontrolle ergab.

Die statistische Diskriminierung der Fluoreszenzintensitäten bewährte sich bei Typisierung von Spenderthrombozyten. Trotz unspezifischer Fluoreszenzen durch HLA-Antikörper konnte das HPA-1a Antigen eindeutig bestimmt werden. Auch eine selektive Analyse von einzelnen Fluoreszenzpeaks, wie sie bei Zellmischungen auftreten, konnte durchgeführt werden.

Abschließend wurde ein Fall einer neonatalen Alloimmunthrombozytopenie untersucht. Mit der entwickelten Methode wurden Antikörper im Serum der Mutter gegen Antigene des Vaters nachgewiesen und als IgG1 Subklasse identifiziert.

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  108. von dem Borne AEGKr, Helmerhorst FM, van Leeuwen EF et al. Autoimmune thrombocytopenia: Detection of platelet autoantibodies with the suspension immunofluorescence test. Br J Haematol. 1980; 45: 319 – 27
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  114. Worfolk LA, MacPherson BR. The detection of platelet alloantibodies by flow cytometry. Transfusion. 1991; 31: 340 – 44
I Anhang

I.1 Turbo-Pascal Programm

Program auswertung;

Uses Crt, Graph, Dos, Printer;

Var

f1: File;

f2: Text;

gkanal: Array[0..255] Of Word;

summegkanal: Array[0..255] Of Word;

prozent: Array[0..256] Of Real ;

zeichen, dateiname, verzeichnis, fehlermeldung, zahl: String;

offen, ok: Boolean;

ex, ey, ey2, ex2, exy, r, bxy, axy, sxy, qxy, qx, qy, sxpunkty, ux, funfzig: Real;

i, zwanzig, achzig, n: Byte;

x1, x2, y1, y2, h, k: Integer;

nummer: Word;

graphiktreiber, graphikmodus, fehlercode: Integer;

buf: Array[0..32767] of Byte;

gelesen, ko: Word;

aol, asl, bol, bsl: Word;

Procedure datensichern; (*Sichert Inhalt der einzelnen Kanäle in dem Verzeichnis C:\GRE-DATE*)

Var

d: DirStr;

n: NameStr;

e: ExtStr;

Begin

FSplit (dateiname, d, n, e);

verzeichnis:= 'c:\GRE-DATE\'+N+'.txt';

Assign (f2, verzeichnis); {$I-} Rewrite (f2); {$I+}

If IOResult = 0 Then

Begin

WriteLn (f2, dateiname);

For i:= 0 To 255 Do WriteLn (f2, gkanal[i]);

WriteLn (f2, achzig);

WriteLn (f2, zwanzig);

WriteLn (f2, r:8:6);

WriteLn (f2, bxy:8:6);

WriteLn (f2, axy:8:6);

WriteLn (f2, funfzig:8:6);

WriteLn (f2, sxy:8:6);

WriteLn (f2, sxpunkty:8:6);

Close (f2);

End Else

Begin

WriteLn ('Datei konnte zum Schreiben nicht geöffnet werden!');

ReadLn (zeichen);

End;

End;

Procedure bildschirm (Var offen: Boolean); (*Installiert Grafiktreiber*)

Const suchweg = 'C:\bp\bgi';

Begin

graphiktreiber:= 0;

InitGraph (graphiktreiber, graphikmodus, suchweg);

fehlercode:= GraphResult;

If fehlercode = 0 Then

Begin

RestoreCrtMode;

WriteLn ('Autor: Chr. Niesytto');

WriteLn ('Installation des Graphiktreibers o.k.');

offen:= True;

End Else

Begin

WriteLn ('Installation des Graphiktreibers nicht o.k.');

fehlermeldung:= GraphErrorMsg (fehlercode);

WriteLn ('Fehler: ', fehlermeldung);

offen:= False;

WriteLn ('RETURN drücken');

ReadLn (zeichen);

End;

End;

Procedure koordinatensystem; (*Zeichnet Koordinatensystem*)

Var

h: Integer;

wort: String;

Const

pal = 3;

Begin;

ClearDevice;

SetPalette (2, black);

SetColor (2);

SetBkColor (15);

SetWriteMode (0);

SetLineStyle (0, 1, 1);

Line (63, 401, 576, 401);

Line (63, 0, 63, 401);

For i:= 0 To 15 Do

Begin

h:= i x 32 + 64;

Str (i x 16, wort);

OutTextXY (h, 410, wort);

Line (h, 401, h, 405);

End;

OutTextXY (580, 410, 'Kanal');

For i:= 0 To 9 Do

Begin

h:= 400 - (i x 40);

Str (i x 10, wort);

wort:= wort + '%';

OutTextXY (38, h-8, wort);

Line (63, h, 58, h);

End;

End;

Procedure drucken (gkanal, summegkanal: Array of Word; prozent: Array Of Real);

(*Druckt Inhalt der Kanäle auf Bildschirm oder Drucker*)

Var

von, bis, helfa, helfb: Byte;

Begin;

ClrScr;

WriteLn ('Kanäle ausdrucken? (j/n)');

zeichen:= ReadKey;

If (zeichen = 'J') Or (zeichen = 'j') Then

Begin

WriteLn ('Ausgabe auf dem Bildschirm oder Drucker ? (b/d)');

zeichen:= ReadKey;

If (zeichen = 'B') Or (zeichen = 'b') Then

Begin

WriteLn ('Ab Kanal Nummer:');

ReadLn (von);

WriteLn ('Bis Kanal Nummer:');

ReadLn (bis);

ClrScr;

helfa:= 0;

For i:= von To bis Do

Begin

WriteLn ('Kanal ', i: 3, ' = ', gkanal[i]: 5, ', summiert = ', summegkanal[i]: 5, 'entspricht ',

prozent[i] x 100: 3: 2, '%');

Inc (helfa);

If helfa = 20 Then

Begin

ReadLn (zeichen);

helfa:= 0;

ClrScr;

End;

End;

ReadLn (zeichen);

End;

If (zeichen = 'D') Or (zeichen = 'd') Then

Begin

WriteLn ('Ab Kanal Nummer:');

ReadLn (von);

WriteLn ('Bis Kanal Nummer:');

ReadLn (bis);

ClrScr;

WriteLn (Lst);

For i:= von To bis Do

Begin

WriteLn (Lst, 'K ', i: 3, ' = ', gkanal[i]: 5, ', sum = ', summegkanal[i]: 5, 'entspricht ',

prozent[i] x 100: 3: 2, ' %');

WriteLn;

End;

End;

End;

End;

End;

Procedure einlesen; Assembler;

Asm
 
Push ds Mov bx, aol Mov si, bx Add si,4 Mov cx, asl Mov bx, bol Mov di, bx Mov dx,bsl
               
@1: Mov ds, cx Mov ax, [si] Shr ax, 1 Shr ax, 1 Shr ax, 1 Shr ax, 1 Shl ax, 1
  Mov ds, dx Add di, ax Mov bx, [di] Inc bx Mov [di], bx Sub di, ax Add si, 8
  Mov bx, ko Sub bx, 8 Mov ko, bx Jnz @1      
               
Pop ds              

End;

Procedure fcsoffnen (Var dateiname: String; Var ok: Boolean; Var gkanal: Array of Word; Var nummer: Word);

(*Öffnet die Quelldatei*)

Begin

For i:= 0 To 255 Do gkanal[i]:= 0;

nummer:= 0;

ok:= False;

aol:= ofs (buf[0]);

bol:= ofs (gkanal[0]);

asl:= seg (buf[0]);

bsl:= seg (gkanal[0]);

Assign (f1, dateiname);{$I-} Reset (f1, 1); {$I+}

If (IOResult <> 0) Then

Begin

WriteLn ('Falsche Eingabe oder Fehler beim Öffnen der Datei');

ReadLn;

End Else

Begin

ok:= True;

Seek (f1, 365);

Repeat

BlockRead (f1, buf, Sizeof (buf), gelesen);

ko:= gelesen;

einlesen;

Until Eof (f1)= True;

Close (f1);

End;

For i:= 0 To 255 Do nummer:= nummer + gkanal[i];

End;

Procedure regression; (*Schätzung der Regressionsgeraden nach L. Sachs*)

(*Angewandte Statistik, 5. Auflage *)

Begin (*Seite 316 ff, Kapitel 542*)

n:= 0; (*nach Modell II, Seite 316 'x aus y'*)

exy:= 0;

ex:= 0;

ey:= 0;

ey2:= 0;

ex2:= 0;

qxy:= 0;

sxy:= 0;

summegkanal[255]:= gkanal[255];

prozent[255]:= 0;

prozent[256]:= 0;

For i:= 254 Downto 0 Do

Begin;

summegkanal[i]:= gkanal[i] + summegkanal[i+1];

prozent[i]:= summegkanal[i] / nummer;

If prozent[i] < 0.2 Then zwanzig:= i - 1;

If prozent[i] < 0.8 Then achzig:= i;

End;

n:= zwanzig - achzig + 1;

For i:= achzig To zwanzig Do

Begin

exy:= exy + (i x prozent[i]); (*exy heißt Summe von i= 80% bis 20% über x*y *)

ex:= ex + i; (*ex heißt Summe von i= 80% bis 20% über x*)

ey:= ey + prozent[i]; (*ey heißt Summe von i= 80% bis 20% über y*)

ey2:= ey2 + Sqr (prozent[i]); (*Ey2 heißt Summe von i= 80% bis 20% über Sqr x*)

ex2:= ex2 + Sqr (i); (*ey2 heißt Summe von i= 80% bis 20% über Sqr y*)

End;

bxy:= ((n x exy) - (ex x ey)) / ((n x ey2) - Sqr (ey)); (* nach (5.21), Seite 316*)

axy:= (ex - (bxy x ey)) / n; (* nach (5.22), Seite 316*)

r:= (exy - (ex x ey / n)) / Sqrt ((ex2 - (Sqr (ex) / n)) x (ey2 - (Sqr (ey) / n)));

(* nach (5.18), Seite 315 *)

qxy:= exy - (ex x ey / n); (* nach (5.25), Seite 320*)

qy:= ey2 - (Sqr (ey) / n); (* nach Seite 319 unten*)

qx:= ex2 - (Sqr (ex) / n); (* nach Seite 319 unten*)

sxy:= qxy / (n - 1); (* nach (5.24), Seite 320*)

sxpunkty:= Sqrt ((qx - (Sqr (qxy) / qy)) / (n - 2)); (* nach (5.29a), Tausch von Ex und Ey Seite 321*)

funfzig:= 0.5 x bxy + axy;

If offen= True Then

Begin

SetGraphMode (Graphikmodus);

koordinatensystem;

For i:= 0 To 255 Do

Begin

h:= i x 2;

For k:= 0 To Round (400 x prozent[i]) Do PutPixel (64+h, 400-k, 10);

For k:= 0 To Round (400 x (prozent[i] + prozent[i + 1]) / 2) Do PutPixel (65+h, 400 - k, 10);

End;

x1:= Round (prozent[achzig] x bxy + axy) x 2 + 65;

x2:= Round (prozent[zwanzig] x bxy + axy) x 2 + 65;

y1:= Round (400 - (Prozent[achzig] x 400));

y2:= Round (400 - (Prozent[zwanzig] x 400));

SetLineStyle (0, 0, 1);

Line (x1, y1, x2, y2);

OutTextXY (1, 440, 'Korrelationskoeffizient =');

Str (r: 8: 6, zahl);

OutTextXY (193, 440, zahl);

OutTextXY (1, 430, 'Lineare Regression x =');

Str (bxy: 8: 6, zahl);

OutTextXY (175, 430, zahl);

OutTextXY (260, 430, ' x y + ');

Str (axy: 8: 6, zahl);

OutTextXY (285, 430, zahl);

OutTextXY (450, 90, 'x (y)');

OutTextXY (410, 90, 'y');

For i:= 0 To 12 Do

Begin

Str (20 + i x 5, zahl);

zahl:= zahl + ' %';

OutTextXY (400, 100 + i x 10, zahl);

ux:= (0.2 + i x 0.05) x bxy + axy;

Str (ux: 8: 6, zahl);

OutTextXY (440, 100 + i x 10, zahl);

End;

OutTextXY (300, 450, 'Kovarianz =');

Str (sxy: 8: 6, zahl);

OutTextXY (380, 450, zahl);

OutTextXY (1, 450, 'Standardabweichung =');

Str (sxpunkty: 8: 6, zahl);

OutTextXY (155, 450, zahl);

OutTextXY (300, 10, dateiname);

OutTextXY (400, 430, '20 % - 80 % Intervall:');

Str (achzig, zahl);

OutTextXY (550, 430, zahl);

OutTextXY (570, 430, ' - ');

Str (zwanzig, zahl);

OutTextXY (585, 430, zahl);

OutTextXY (1, 465, 'Return drücken');

ReadLn (zeichen);

RestoreCrtMode;

End;

End;

(*------------------Hauptprogramm-------------------------------------------*)

Begin;

TextBackground (0);

TextColor (15);

bildschirm (offen);

Repeat

WriteLn ('Bitte Dateinamen eingeben');

ReadLn (dateiname);

fcsoffnen (dateiname, ok, gkanal, nummer);

If ok = True Then

Begin

ClrScr;

regression;

drucken (gkanal, summegkanal, prozent);

datensichern;

End;

WriteLn ('Programm beenden? (j / n)');

zeichen:= ReadKey;

ClrScr;

Until (zeichen = 'J') Or (zeichen = 'j') ;

TextColor (15);

End.

I.2 Tabellarischer Anhang

Tab. I-1 Fluoreszenz nach Inkubation mit AB-Serum in indirekten Immunfluoreszenztest
Spendennummer 3017306 3017324 3017303 3017299
Fluoreszenz im Positivbereich in % 1,5 2,3 3,8 0,2
Gated/Total in % 92,7 93,8 91,5 93,8
Tab. I-2 Fluoreszenz nach Inkubation mit anti-HPA-1a-Serum im indirekten Immunfluoreszenztest
Spenden- Messung der  Ansatz und Verdünnung des anti-HPA-1a-Serums
nummer   AB-Serum 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
301816 Fluoreszenz nach 1. Waschen in % 8,1 74,0 84,0 71,7 75,4 56,0 32,7
  mittlerer Kanal des Positivbereichs   100,5 78,3 68,9 45,7 35,3 28,2
  Gated/Total in % 87,8 90,3 85,3 87,5 86,7 88,4 88,1
                 
  Fluoreszenz nach 2. Waschen in % 6,2 63,0 75,0 65,3 70,7 50,5 28,3
  mittlere Kanal des Positivbereichs   101,2 77,0 68,0 44,7 34,3 28,3
  Gated/Total in % 85,7 85,7 85,0 84,8 86,4 85,5 84,2
                 
3018152 Fluoreszenz nach 1. Waschen in % 7,7 74,3 66,6 62,8 63,2 75,8 49,1
  mittlerer Kanal des Positivbereichs   103,1 91,6 80,6 65,6 13,3 34,7
  Gated/Total in % 88,4 89,8 87,0 86,4 86,4 86,1 87,6
Tab. I-3 Fluoreszenz nach Inkubation mit humanem anti-A und anti-B im indirekten Immunfluoreszenztest
Thrombozyt der Ansatz und Fluoreszenz im Positivbereich in %
Blutgruppe AB-Serum anti-HPA-1a anti-A anti-B
A1 5,4 89,0 16,9 17,9
A1 10,8 85,1 29,8 18,5
A1 4,9 90,4 14,1 15,4
A1 8,0 87,6 * 16,2
A1 4,0 90,8 * 14,0
B 17,3 80,1 35,0 35,1
B 12,5 84,3 24,9 32,0
B 11,0 87,6 30,1 7,4
B 0,1 85,0 29,2 34,1
B 14,0 84,6 27,3 30,1
Tab. I-4 Grün-Fluoreszenz nach Inkubation mit AB-Serum und anti-HPA-1a-Serum im indirekten, sowie nach Inkubation mit anti-IgG-FITC im direkten Immunfluoreszenztest
Spenden- Blutgruppe Ansatz und Fluoreszenz im Positivbereich in %
nummer anti-IgG-FITC AB-Serum anti-HPA-1a
3025122 A1- 0,1 0,2 23,0
3025123 0+ 0,1 0,7 22,2
3025124 0+ 0,1 0,5 24,2
3025125 0- 0,1 0,4 3,7
3025131 A1- 0,1 0,7 28,4
3025132 0+ 0,1 0,5 27,2
3025133 A1- 0,2 0,5 24,2
3025134 A2- 0,1 0,3 25,3
3025135 A1+ 0,1 0,3 18,1
3025136 A2- 0,1 0,2 10,4
3025137 A1B 0,1 0,2 10,9
3025138 0+ 0,2 0,5 33,0
3025139 0- 0,1 0,7 26,1
3025140 0+ 0,3 0,5 26,8
3025141 A1- 0,3 0,6 33,8
3025142 0- 0,1 0,3 20,0
3025143 0+ 0,1 0,5 27,3
3025144 A1- 0,1 0,2 24,3
3025145 0+ 0,1 0,4 23,4
3025146 0+ 0,1 0,3 15,7
3025148 B+ 0,8 2,7 26,8
3025149 0+ 0,0 0,3 19,1
3025150 A1+ 0,1 0,7 26,6
3025151 0- 0,1 1,1 19,8
Tab. I-5 Grün-Fluoreszenz nach Inkubation mit monoklonalem anti-GP IIb/IIIa, anti-A, anti-B und anti-D und AB-Serum im indikekten Immunfluoreszenztest
Spenden- Blutgruppe Ansatz und Fluoreszenz im Positivbereich in %
nummer AB-Serum anti-GP IIb/IIIa anti-A anti-B anti-D
3025122 A1- 0,5 83,9 8,3 0,4 0,6
3025123 0+ 0,3 83,8 0,7 0,4 0,7
3025124 0+ 0,8 86,5 0,9 1,0 0,6
3025125 0- 0,5 91,1 1,2 0,9 1,3
3025131 A1- 0,6 91,1 8,1 2,1 1,2
3025132 0+ 0,5 81,1 0,9 0,9 0,7
3025133 A1- 0,4 89,4 4,2 1,2 0,8
3025134 A2- 0,5 86,8 1,0 1,0 0,9
3025135 A1+ 0,6 82,1 6,8 1,8 1,1
3025136 A2- 0,6 84,4 1,2 0,6 0,5
3025137 A1B 0,6 89,6 4,6 0,6 0,5
3025138 0+ 0,5 87,4 2,9 0,9 1,0
3025139 0- 0,2 83,6 1,3 1,6 1,2
3025140 0+ 0,8 88,2 1,7 1,3 1,7
3025141 A1- 0,5 79,5 3,7 2,3 1,7
3025142 0- 0,5 86,2 0,6 0,5 1,0
3025143 0+ 0,4 81,9 0,8 1,3 1,1
3025144 A1- 0,3 84,2 16,9 1,2 0,8
3025145 0+ 0,3 88,6 0,9 1,2 1,3
3025146 0+ 0,5 93,1 1,0 1,3 2,0
3025148 B+ 0,4 86,9 6,4 5,5 5,4
3025149 0+ 0,5 85,6 1,3 0,7 0,8
3025150 A1+ 0,4 87,9 5,7 1,7 0,8
3025151 0- 0,6 82,1 2,1 1,5 1,1
Tab. I-6 Fluoreszenz nach Titration von anti-HPA-1a-Eluat
Verdünnung 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048
Fluoreszenz im Positivbereich in % 86,4 89,5 83,4 77,4 57,5 28,1 11,1 4,4 2,4
mittl. Kanal des Positivbereichs 84,4 68,7 52,9 41,6 32,9 28,1 25,6 25,7 25,9
Tab. I-7 Fluoreszenz nach Inkubation mit AB-Serum und anti-HPA-1a-Eluat im indirektem Immunfluoreszenztest
Spenden- Blutgruppe  Ansatz und Fluoreszenz im Positivbereich in %
nummer anti-IgG AB-Serum anti-HPA-1a-Eluat
3026424 0- 0,3 0,9 24,3
3026454 0- 0,3 0,5 46,9
3026822 0- 0,4 1,8 41,0
3027823 A2B 0,1 1,1 34,7
3027341 0- 0,3 0,9 37,6
3027343 B+ 0,6 1,1 44,5
3027344 0+ 0,2 0,8 43,1
3027345 0- 0,5 1,7 37,0
3027347 A1+ 0,3 0,8 45,8
3027348 A1+ 0,5 0,8 45,6
3027349 0+ 0,3 1,5 46,2
3027352 B+ 0,3 0,9 33,7
3027362 0+ 0,2 1,7 46,3
3027363 A2- 0,2 0,9 42,8
3027364 A2+ 0,2 0,8 50,2
3027873 0- 0,1 0,9 71,3
3027874 A1- 0,1 1,5 72,6
3027888 A1+ 0,1 0,8 76,6
3027895 0 0,1 1,8 76,5
3027897 0 0,1 1,9 70,0
3027612 A1+ 0,1 0,6 71,6
3027913 B+ 0,1 0,9 69,4
3027914 A2+ 0,1 1,6 72,1
3027915 0+ 0,1 0,6 59,8
3027916 A1+ 0,0 0,7 78,6
3027917 A2+ 0,1 1,2 73,4
3027918 0- 0,1 0,5 79,0
Tab. I-8 Fluoreszenz nach Inkubation mit AB-Serum, anti-HPA-1a-Eluat und Polyglobin im indirekten, nach Inkubation mit anti-IgG-FITC im direkten Immunfluoreszenztest, sowie Messung der Autofluoreszenz
Spenden- Blutgruppe Ansatz und Fluoreszenz im Positivbereich in %
nummer   anti-IgG-FITC AB-Serum anti-HPA-1a 2 %iges 
Polyglobin
Autofluoreszenz
3033717 A2+ 0,2 0,5 87,7   0,0
3033718 A1+ 0,1 0,9 87,7   0,0
3033719 0+ 0,2 0,5 85,7 1,0 0,0
3033720 0+ 0,1 0,8 79,8 2,4 0,0
3033721 0+ 0,1 0,7 88,0 0,6 0,0
3033722 A1+ 0,1 0,9 81,0 1,4 0,0
3033723 A1B+ 0,1 0,7 89,6 2,4 0,0
3033727 0+ 0,6 0,8 88,2 1,6 0,0
3033728 A1+ 0,1 0,7 87,4 1,4 0,0
3033729 A2- 0,2 0,8 80,7 2,0 0,0
3033730 A1+ 0,1 0,5 83,7 1,5 0,0
3033731 0+ 0,1 1,0 87,1 1,9 0,0
3033732 0+ 0,1 0,6 87,7 0,9 0,0
3033733 0+ 0,1 0,8 82,3 0,8 0,0
3033734 0+ 0,1 0,8 83,3 1,4 0,0
3033735 0+ 0,1 0,2 89,4 1,3 0,0
3033736 0+ 0,1 1,1 90,1 1,8 0,0
3033737 0+ 0,1 0,5 89,1 1,2 0,0
3033738 A2+ 0,2 0,5 87,8 1,6 0,0
3033739 0+ 0,1 0,9 90,2 1,5 0,0
3033740 B+ 0,1 0,6 86,5 2,5 0,0
3033741 A1B- 0,1 0,5 84,9 1,2 0,0
3033743 A1B+ 0,1 1,2 83,5 1,6 0,0
3033744 A1- 0,1 0,8 80,2 1,6 0,0
3033745 A1+ 0,1 0,7 91,3 1,3 0,0
3033746 0+ 0,1 0,8 87,2 1,0 0,0
3033747 0- 0,1 1,0 87,9 1,3 0,0
3033748 A1+ 0,1 0,8 88,4 1,3 0,0
3033749 0+ 0,1 0,6 87,0 1,5 0,0
3033751 A1+ 0,1 0,5 87,8 1,8 0,0
3033752 A1+ 0,2 1,2 82,2 1,4 0,0
3033753 B- 0,1 0,6 82,4 2,0 0,0
3033754 0+ 0,1 0,6 83,7 2,1 0,0
3033755 0+ 0,1 0,4 87,5 1,6 0,0
3033757 0+ 0,1 0,6 89,5 1,3 0,0
3033758 0+ 0,1 0,7 91,1 1,4 0,0
Tab. I-9 Fluoreszenz nach Inkubation mit monoklonalem anti-A und anti-B im indiketen Immunfluoreszenztest
Spendennummer Blutgruppe Ansatz und
Fluoreszenz
im Positivbereich in %
Spendennummer Blutgruppe Ansatz und
Fluoreszenz
im Positivbereich in %
anti-A anti-B anti-A anti-B
3033731 0+ 0,3 0,3 3033730 A1+ 43,9 0,8
3033732 0+ 0,4 0,2 3033745 A1+ 39,7 0,4
3033733 0+ 0,2 0,2 3033748 A1+ 60,8 0,3
3033734 0+ 0,4 0,4 3033723 A1B+ 44,6 1,5
3033735 0+ 1,0 0,5 3033743 A1B+ 47,2 1,2
3033736 0+ 0,4 0,3 3033741 A1B- 35,4 1,2
3033737 0+ 0,6 0,3 3033738 A2+ 1,7 0,3
3033718 A1+ 36,6 0,4 3033729 A2- 0,8 0,6
3033722 A1+ 33,8 0,4 3033740 B+ 0,8 7,0
3033728 A1+ 35,9 0,4 3033753 B- 0,4 5,8
Tab. I-10 Diagnosen der auffälligen Fluoreszenzen nach Inkubation mit anti-IgG-FITC im direkten Immunfluoreszenztest
Fluoreszenz im Positivbereich in % Diagnose Thrombozytenzahl 
103/m l
Fluoreszenz im Positivbereich in % Diagnose Thrombozytenzahl 
103/m l
1,1 HL 170 2,4 ITP 5
1,1 HL 237 2,9 aplastisches Syndrom 82
1,3 AML 19 3 AML 28
1,3 NHL, Cb 270 3,2 L. erythematodes 35
1,4 CLL 129 6,4 ITP 0,2
1,4 Myelodysplastisches Syndrom 59 6,6

7,3

CLL

ITP

50
1,5 ALL 72 9,2 AML 3
1,6 AML 8 9,5 aplastisches Syndrom 33
1,7 Immunocytom 320 10 AML 24
2 HL 231 10,3 L. erythematodes 35
2,1 Haarzellenleukämie 179 12,7 Lebercirrhose 53
2,3 Hämolyse 299 14,7 aplastisches Syndrom 106
2,3 NHL, Cb 137 15 HIV, Dysmyelopoese 77
2,3 aplastisches Syndrom 28 21 CLL 149
2,4 aplastische Anämie 21 33 Lymphom 278
Tab. I-11 Diagnosen der auffälligen Fluoreszenzen nach Inkubation mit anti-IgG-FITC im direkten Immunfluoreszenztest
mittl. Kanal im
Negativbereich
Diagnose mittl. Kanal im
Negativbereich
Diagnose
9,1 aplastisches Syndrom 10,5 aplastisches Syndrom
9,6 L. erythematodes 11,1 Lymphom
9,7 CLL 11,1 CLL
9,8 L. erythematodes 11,4 AML
9,8 ITP 11,5 Lebercirrhose
10 HIV, Dysmyelopoese 11,8 ITP
10,1 HL 13,4 aplastisches Syndrom
10,3 AML
Tab. I-12 Diagnosen der auffälligen Fluoreszenzen nach Inkubation von Pool-Thrombozyten mit Patientenserum im indirekten Immunfluoreszenztest
Fluoreszenz
im Positivbereich
Diagnose Thrombozytenzahl 
103/m l
Fluoreszenz
im Positivbereich
Diagnose Thrombozytenzahl 
103/m l
1,9 NHL, Cb-Cc 202 2,3 NHL 82
2

2,1

HL

HL

303

normal

2,4 aplastisches

Syndrom

33
2,1 aplastisches
Syndrom
82 2,5 Polycythämie vera 199
2,1 Lymphom 201 3,1 Hämolyse 299
2,3 HL 231 3,2 ALL 32
2,3 Immunocytom 320 3,5 Haarzellenleukämie 179
2,3 NHL 142 4,9 ALL 283
2,3 Myeloproliferatives Syndrom 362 5,6 M. Behcet 348
Tab. I-13 Fluoreszenzen nach Titration der Zelle *250 mit monoklonalem anti-GP Ib-FITC, Darstellung der regressionsanalytischen Daten
Auswertung von Ansatz Gated/Total
in %
Regressionsintervall 
von Kanal bis Kanal
Regressionskoeffizient 50%-Kanal Standardabweichung
Gated Cells Nativ 90,13 1 7 -0,97 3,38 0,55
1:4096 90,81 1 7 -0,97 3,56 0,54
1:2048 89,8 2 8 -1,00 3,86 0,20
1:1024 89,82 2 9 -1,00 5,17 0,28
1:512 90,4 3 13 -1,00 8,55 0,34
1:256 90,1 9 22 -1,00 15,5 0,18
1:128 90,95 16 34 -1,00 24,9 0,24
1:64 91,37 27 49 -1,00 38,1 0,26
1:32 90,37 42 68 -1,00 55,4 0,33
1:16 89,46 53 83 -1,00 68,2 0,35
1:8 82,39 61 95 -1,00 78,2 0,33
1:4 79,45 67 101 -1,00 84,5 0,32
Total Cells Nativ 1 7 -9,72 3,47 0,56
1:4096 1 7 -9,74 3,63 0,54
1:2048 2 8 -1,00 3,99 0,21
1:1024 2 9 -9,94 5,34 0,28
1:512 3 13 -1,00 8,67 0,33
1:256 9 22 -1,00 15,5 0,18
1:128 16 34 -1,00 24,8 0,25
1:64 26 50 -1,00 38,0 0,31
1:32 42 69 -1,00 55,4 0,34
1:16 53 85 -1,00 69,0 0,40
1:8 61 103 -1,00 81,4 0,53
1:4 67 112 -1,00 89,0 0,59
Tab. I-14 Fluoreszenzen nach Titration der Zelle *253 mit monoklonalem anti-GP Ib-FITC, Darstellung der regressionsanalytischen Daten
Auswertung von Ansatz Gated/Total
in %
Regressionsintervall
von Kanal bis Kanal
Regressions-koeffizient 50%-Kanal Standard-abweichung
Gated Cells Nativ 92,77 1 7 -0,97 3,37 0,53
1:4096 92,72 2 7 -1,00 3,61 0,19
1:2048 92,9 2 8 -1,00 4,78 0,25
1:1024 91,34 2 9 -0,99 5,77 0,30
1:512 92,51 5 14 -1,00 9,92 0,20
1:256 92,45 11 23 -1,00 16,9 0,16
1:128 92,86 19 36 -1,00 27,9 0,22
1:64 92,69 32 53 -1,00 42,9 0,27
1:32 92,14 46 71 -1,00 58,7 0,32
1:16 92,18 59 85 -1,00 71,8 0,31
1:8 86,76 64 97 -1,00 80,5 0,42
1:4 81,49 67 105 -1,00 86,9 0,67
Total Cells Nativ 1 7 -1,00 3,44 0,52
1:4096 2 7 -1,00 3,71 0,19
1:2048 2 8 -0,99 4,89 0,25
1:1024 2 9 -0,99 5,85 0,30
1:512 5 15 -1,00 10,0 0,19
1:256 11 24 -1,00 16,9 0,23
1:128 19 37 -1,00 27,8 0,24
1:64 31 53 -1,00 42,7 0,31
1:32 46 71 -1,00 58,6 0,31
1:16 58 86 -1,00 72,1 0,36
1:8 63 102 -1,00 82,3 0,59
1:4 63 113 -1,00 89,2 1,08
Tab. I-15 Vergleich der Quotienten "Gated/Total Cells" vor und nach Säurebehandlung
Spendennummer *176 *372 *864 *264 *581 *830 Mittelwert
"Gated/Total" ohne Säurebehandlung in % 93,14 86,72 93,01 88,3 92,07 88,88 90,35 ±2,73
"Gated/Total" nach Säurebehandlung in % 91,19 90,95 88,56 88,88 92,83 91,81 90,70 ±1,67
Tab. I-16 Fluoreszenz nach Inkubation mit anti-HPA-1a-Eluat im indirekten Immunfluoreszenztest, Vergleich mit der Fluoreszenz nach Inkubation mit anti-IgG-FITC und der Autofluoreszenz
Spenden-nummer Ansatz Regressions-
koeffizient
50%-Kanal Standardabweichung 50%-Kanal
-3 x S +3 x S
Differenz
nach Formel Nr. 1
Ergebnis
MAIPA
*176 nativ -1,00 4,80 0,22 4,12 5,47 2,37
+ anti-IgG -1,00 8,48 0,21 7,84 9,12 33,45
+ anti-HPA-1a + anti-IgG -0,96 60,44 5,95 42,57 78,30 HPA-1a pos.
*372 nativ -1,00 4,46 0,19 3,89 5,04 3,39
+ anti-IgG -1,00 8,99 0,19 8,43 9,55 -0,24
+ anti-HPA-1a + anti-IgG -0,98 13,05 1,25 9,31 16,79 HPA-1a neg..
*864 nativ -1,00 4,87 0,21 4,22 5,51 2,15
+ anti-IgG -1,00 8,64 0,33 7,66 9,62 36,94
+ anti-HPA-1a + anti-IgG -0,98 60,93 4,79 46,56 75,31 HPA-1a pos.
*264 nativ -1,00 4,60 0,20 3,98 5,21 1,34
+ anti-IgG -1,00 7,46 0,30 6,55 8,37 34,51
+ anti-HPA-1a + anti-IgG -0,99 51,42 2,84 42,88 59,95 HPA-1a pos.
*581 nativ -1,00 3,87 0,17 3,35 4,39 2,08
+ anti-IgG -1,00 7,44 0,32 6,47 8,42 -0,83
+ anti-HPA-1a + anti-IgG -0,98 10,41 0,94 7,58 13,23 HPA-1a neg..
*830 nativ -1,00 4,68 0,22 4,03 5,34 2,12
+ anti-IgG -1,00 8,11 0,22 7,46 8,77 -0,77
+ anti-HPA-1a + anti-IgG -0,97 13,57 1,86 8,00 19,13 HPA-1a neg..
Tab. I-17 Fluoreszenz der Thrombozyten der Mutter
Ansatz Regressionsintervall
von Kanal bis Kanal
Regressions-koeffizient 50%-Kanal Standard-abweichung Differenz nach Formel 1
nativ 1 7 -0,98 3,46 0,49
anti-IgG-FITC 2 8 -0,99 4,66 0,23 -0,96
Serum der Mutter (1:4)

+ anti-IgG-FITC

2 10 -1,00 5,44 0,23 -0,60
Tab. I-18 Fluoreszenz nach IgG Subklassen Bestimmung
Ansatz Regressionsintervall von bis Reressions-koeffizient 50%-Kanal Standard-abweichung Differenz nach Formel 1
native Thr. 1 7 -0,98 3,68 0,49
+ anti-IgG1-FITC 2 8 -1,00 4,18 0,17
+ Serum der Mutter 

+ anti-IgG1-FITC

19 42 -1,00 29,92 0,28 24,40
+ anti-IgG2-FITC 2 7 -1,00 3,76 0,18
+ Serum der Mutter 

+ anti-IgG2-FITC

1 8 -0,97 3,92 0,67 -2,39
+ anti-IgG3-FITC 2 8 -1,00 4,16 0,17
+ Serum der Mutter 

+ anti-IgG3-FITC

2 9 -1,00 4,26 0,21 -1,04
+ anti-IgG4-FITC 4 10 -1,00 7,21 0,13
+ Serum der Mutter 

+ anti-IgG4-FITC

2 14 -1,00 7,64 0,27 -0,75

K Lebenslauf
 
Name, Vorname Niesytto, Christian
   
Geburtsort, -Datum Hamburg, 25.11.1967
   
Eltern Dieter Niesytto, Bankkaufmann
  Christa Niesytto, geb. Kruse, Zahntechnikerin
   
Grundschule 1974 - 1978: Grundschule Goosacker, Hamburg
Gymnasium 1978 - 1987: Gymnasium Knabeweg, Hamburg
   
Zivildienst 1988 - 1989: Deutsches Rotes Kreuz, Itzehoe
   
Ausbildung 1984 - 1988: Ausbildung zum Chemisch-technischen Assistententen in der Berufsfachschule für chemisch-technische Assistenz in Hamburg
  Rettungssanitäter, ausgebildet im Zivildienst
   
Hochschule Medizin-Studium an der Universität Hamburg seit WS 89/90
  Physikum am 18.09.91
  1. Staatsexamen am 23.03.93
  2. Staatsexamen am 14.09.95
  3. Staatsexamen am 27.11.96
  Approbation als Arzt am 05.08.98
   
  Full registration as a medical practitioner with the 

General Medical Council, London, GB, am 05.08.98

   
Anstellung Senior House Officer in Paediatrics, 

Scunthorpe General Hospital, 

Scunthorpe DN15 7BH, GB

   

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich Herrn Professor Dr. Alois Poschmann dafür danken, daß er mir das Thema dieser Arbeit zur weitgehend selbständigen Bearbeitung überlassen hat und mir beratend zur Seite stand.

Herrn Professor Dr. Konrad Fischer möchte ich für die zahlreichen Diskussionen und für die Beratung bei der statistischen Auswertung des entwickelten Computerprogramms herzlich danken.

Herrn Privat Dozent Dr. V. Kiefel, Institut für klinische Immunologie und Transfusionsmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen, möchte ich für die Hospitation in seinem Thrombozyten-Labor danken.

Weiterhin danke ich Simone Western und Martin Kluxen für die stets gute Laune im "Wiener- und Landsteiner-Labor".

Besonderer Dank gilt den Reinigungskräften und den zahlreichen MTAs des Institut für Transfusionsmedizin. Ohne ihre gutmütige Unterstützung wäre diese Arbeit nicht zustande gekommen.

Schließlich danke ich meinen Eltern, allen Freunden und -innen für ihre Unterstützung.