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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-23064
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2306/


Isolierung und Charakterisierung von Genkopien der mikrosomalen Oleatdesaturase FAD2 aus Brassica napus L. sowie Entwicklung transgener Rapspflanzen mit erhöhtem Ölsäuregehalt im Samen

Spiekermann, Patricia

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SWD-Schlagwörter: Rapsöl , Desaturasen , Fettsäuren
Freie Schlagwörter (Deutsch): PTGS
Basisklassifikation: 42.41 , 42.13 , 42.20
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Pflanzen (Botanik)
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heinz, Ernst (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.12.2004
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 10.01.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Rapsöl mit hohen MUFA(monounsaturated fatty acid)- und geringen PUFA(polyunsaturated fatty acid)-Anteilen wäre ein wertvolles Produkt für die Nahrungsmittel-Industrie und die Oleochemie. In der vorliegenden Arbeit sollte mittels gentechnischer Methoden der Ölsäuregehalt in reifenden Rapsamen erhöht und gleichzeitig der Gehalt an mehrfach-ungesättigten C18-Fettsäuren erniedrigt werden. Für die Hemmung der beteiligten Desaturasen wurde die Hairpin-Technik eingesetzt, die auf PTGS (posttranscriptional gene silencing) beruht. Bei diesem Ansatz musste berücksichtigt werden, dass die Oleatdesaturasen sowohl in der Speicherlipid- als auch in der Membranlipid-Biosynthese involviert sind. Daher war die Gewährleistung einer ausschließlich samenspezifischen Hemmung der Enzyme erforderlich.
Das wichtigste Ziel-Enzym für eine Steigerung des Ölsäuregehalts ist die mikrosomale Oleatdesaturase FAD2, die den größten Anteil an 18:1-Substraten während der Samenreifung desaturiert. Für dieses Enzym liegen im Genom des allotetraploiden B. napus vier Genkopien vor, von denen nicht bekannt war, welche funktional sind und wann und in welchem Gewebe sie exprimiert werden. So wurden in dieser Arbeit zunächst funktionale FAD2-Kopien isoliert und charakterisiert. Dabei wurde überprüft, ob es sich um samenspezifisch exprimierte Kopien handelt, da das Vorhandensein einer solchen Kopie eine Suppression ohne agronomische Nachteile erlauben könnte. Aus einer cDNA-Bank aus reifenden Schoten von B. napus var. Ascari konnten zwei Genkopien FAD2-I und FAD2-II isoliert werden. Sie sind zu 97 % identisch und lassen sich durch Sequenzvergleiche dem A-Genom bzw. dem C-Genom zuordnen, sie stammen somit offenbar von den Vorfahren B. rapa bzw. B. oleracea ab. Durch heterologe Expression der Genkopien in S. cerevisiae wurde die Fähigkeit der entsprechenden Desaturasen zur delta-12-Desaturierung nachgewiesen. RT-PCR-Analysen von RNA aus Blattgewebe zeigten, dass die Genkopien auch in vegetativem Gewebe exprimiert werden. In B. napus liegen also nicht unterschiedliche samenspezifische bzw. konstitutiv exprimierte FAD2-Gene vor, wie es für G. max, H. annuus und G. hirsutum gezeigt wurde. Für die gentechnologische Suppression bedeutet dies, dass durch Einsatz geeigneter Promotoren eine samenspezifische Hemmung erreicht werden muss.
Zur Steigerung des Ölsäuregehalts in reifenden Rapssamen wurden Hairpin-Konstrukte mit Fragmenten der FAD2-Genkopien hergestellt und durch A. tumefaciens-vermittelte Transformation in Raps transferiert. Von den eingesetzten, verschiedenen samenspezifischen Promotoren erwiesen sich der Napin-, USP- und LeB4-Promotor als geeignet, FAD2-Silencing in Rapssamen auszulösen. Konstrukte mit dem Dc3-Promotor bewirkten dagegen keine Erhöhung des Ölsäuregehalts. Die Hairpin-Variante mit einem Intron produzierte mehr Hoch-Ölsäure(HO)-Phänotypen als Hairpin-Kassetten mit einem Spacer. In der Ausprägung des HO-Phänotyps zeigten Konstrukte mit dem Napin-Promotor höhere Anteile von Phänotypen mit maximalem Silencing-Grad als Konstrukte mit dem USP-Promotor. Für die verschiedenen Konstrukt-Varianten wurden demnach zwar Unterschiede bezüglich der Effizienz und der Ausprägung des HO-Phänotyps festgestellt, dennoch erzielen sie ähnliche Höchstwerte für den Ölsäuregehalt. Dieser konnte durch Hemmung der FAD2 in Einzelsamen von ca. 70 % auf bis zu 89 % gesteigert werden. Jedoch wurde die Oleatdesaturierung nicht vollständig unterbunden, da die 18:2- und 18:3-Gehalte in der Summe nicht unter 5 % gesenkt werden konnten. Diese Restgehalte werden der Aktivität der plastidären Oleatdesaturase FAD6 sowie einem Lipid-Austausch zwischen den Kompartimenten Plastid, Cytosol und ER zugeschrieben. Daher sollte der Ölsäuregehalt in einem zweiten Ansatz durch simultane Hemmung der mikrosomalen und der plastidären Oleatdesaturasen (FAD2 und FAD6) optimiert werden. Hierzu wurden Doppel-Konstrukte mit Hairpin-Kassetten und den o.g. Promotoren hergestellt. Die Ergebnisse der bisher analysierten transgenen Pflanzen sprechen nicht für eine weitere Erniedrigung des Desaturierungsgrads. Eine sichere Beurteilung kann allerdings erst nach Vorlage der noch ausstehenden Daten erfolgen.
Durch samenspezifische Suppression von zwei Genkopien der mikrosomalen Oleatdesaturase FAD2 mit Hilfe von Hairpin-Konstrukten konnten somit erfolgreich transgene Rapspflanzen mit HO-Phänotyp hergestellt werden. Die angewendete Hairpin-Technik erwies sich als geeignete Methode zur effizienten Produktion von Primärtransformanten mit dem gewünschten Phänotyp. Eine Beeinträchtigung der Membranlipid-Biosynthese im vegetativen Gewebe wurde nicht festgestellt. Desweiteren konnte das HO-Merkmal stabil auf die nächste Generation vererbt werden.

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