Charakterisierung von Staufen1-enthaltenden Ribonukleoprotein Partikeln in Säugern

Abstract

In vielen verschiedenen Zelltypen ist der cytoplasmatische RNA-Transport in Verbindung mit lokal regulierter Translation essentiell für die Bildung und Aufrechterhaltung von Zellpolaritäten. Bei der RNA-Lokalisierung spielen trans-agierende RNA-Bindeproteine als Bestandteile von Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexen eine zentrale Rolle. In Drosophila-Oocyten und -Neuroblasten ist das dsRNA-Bindeprotein Staufen als Komponente von RNP-Komplexen sowohl am cytoplasmatischen Transport als auch an der Verankerung und der Translationsregulation verschiedener Transkripte beteiligt. Die zwei Säuger Orthologe Staufen1 (Stau1) und Staufen2 sind Bestandteile unterschiedlicher RNA-enthaltender Komplexe, welche mit Mikrotubuli und Ribosomen assoziieren. Bislang war relativ wenig über die molekulare Zusammensetzung Stau1-enthaltender RNP-Komplexe in Säugerzellen bekannt. In dieser Arbeit wurden mit einer neu entwickelten Methode Stau1-enthaltende Komplexe aus Säugerzellen isoliert und die darin enthaltenen Proteine sowohl massenspektrometrisch als auch immunologisch mit Western Blot Analysen identifiziert. Stau1-Komplexe beinhalten verschiedene nukleocytoplasmatische RNA-Bindeproteine, von denen Nucleolin und FMRP RNA-vermittelt und NFAR und RHA RNA-unabhängig mit den Stau1-RNP-Komplexen assoziieren. Weiterhin liegen die Protein-Phosphatase 1, das Mikrotubuli-abhängige Motorprotein Kinesin, Tubulin und verschiedene Proteine der großen und kleinen ribosomalen Untereinheit RNA-unabhängig in Stau1-Komplexen vor. Bis auf PABP kommt keines der Proteine im Komplex mit dem strukturell nicht verwandten RNA-Bindeprotein hnRNPK vor, was unter anderem die hohe Spezifität der Reinigungsmethode belegt. In Sucrosegradienten kofraktioniert Stau1 mit intakten Ribosomen und Polysomen, jedoch nicht mit den isolierten ribosomalen Untereinheiten. Unterschiedliche biochemische Befunde deuten auf eine direkte Interaktion zwischen Stau1 und dem ribosomalen Protein P0 hin. In vitro Translations-Experimente zeigen, dass Stau1 einen translationsreprimierende Wirkung besitzt. Die Befunde dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Stau1 im Cytoplasma von Säugerzellen durch eine Assoziation mit dem ribosomalen Protein P0 in Ribosomen-enthaltende Komplexe rekrutiert wird, die ebenfalls nukleocytoplasmatische Proteine, PP1 und PABP enthalten und Kinesin-abhängig entlang von Mikrotubuli transportiert werden. Demnach könnte Stau1 als Bestandteil von RNP-Komplexen in Säugerzellen am aktiven RNA-Transport und an der Translationsregulation beteiligt sein.

In many different cell types, a locally regulated protein synthesis in restricted cytoplasmic subregions of the cell appears to contribute to the establishment and maintenance of cell polarity. Both cytoplasmic trafficking and site-specific translation of mRNAs in various cell types seems to be regulated by an ordered interaction of cis-acting RNA sequences with trans-acting proteins. In Drosophila oocytes and neuroblasts, the double-stranded RNA-binding protein Staufen assembles into ribonucleoprotein (RNP) particles, which mediate cytoplasmic mRNA trafficking and translation. Two different mammalian orthologues also appear to reside in distinct RNA-containing particles. To date, relatively little is known about the molecular composition of Staufen-containing ribonucleoprotein complexes. Here, we have used a novel one-step affinity purification protocol to identify components of Staufen 1-containing particles. Whereas the nucleocytoplasmic RNA-binding protein nucleolin is linked to Staufen in an RNA-dependent manner, the association of protein phosphatase 1, the microtubule-dependent motor protein kinesin and several components of the large and small ribosomal subunits with Staufen ribonucleoprotein complexes is RNA-independent. Notably, all these components do not co-purify with a second RNA-binding protein, hnRNPK (heterogeneous ribonucleoprotein K), demonstrating the high specificity of the purification protocol. Furthermore, pull-down and immunoprecipitation experiments suggest a direct interaction between Staufen1 and the ribosomal protein P0 in vitro as well as in cells. In cell fractionation and sucrose gradient assays, Staufen co-fractionates with intact ribosomes and polysomes, but not with the isolated 40 S ribosomal subunit. Furthermore in vitro translation experiments suggest an inhibiting function of Staufen on translation. Taken together, these findings imply that, in the cytoplasm of mammalian cells, an association with the ribosomal P-stalk protein P0 recruits Staufen1 into ribosome-containing ribonucleoprotein particles, which also contain kinesin, protein phosphatase 1 and nucleolin.