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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-23607
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2360/


Genexpressionsanalyse von humanen Gehirntumoren mittels cDNA Array Analyse

gene expression analysis of human brain brain tumors via cDNA Array analysis

Mueller, Sabine

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SWD-Schlagwörter: Phosphatasen , Tumorimmunologie
Freie Schlagwörter (Deutsch): cDNA Array Analyse, Gehirntumore, Migration
Freie Schlagwörter (Englisch): brain tumor, cDNA array analysis, migration, RPTP
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.02.2005
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 02.03.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung von neuen Oberflächen-molekülen für eine Antikörper-Immuntherapie für Glioblastome (GBM). Um neue Zielgene zu identifizieren wurde die differentielle Expression in GBM im Vergleich zu Normalgehirn mittels cDNA Array Analyse untersucht. Es wurden zunächst subtraktive cDNA Banken hergestellt, um eine spezifische, für Tumortranskripte angereicherte Klonkollektion zu etablieren. Um die Genauigkeit des Arrayanalyse zu optimieren, wurde ein Verfahren angewendet, das auf zwei aufeinanderfolgenden Arrayhybridisierungen beruht. Zunächst wurden die rekombinanten Klone der subtraktiven cDNA Banken auf sogenannten Screening Arrays mit einer Dichte von ca. 25.000 Elementen pro Array gespottet. Diese wurden mit insgesamt 14 Tumorproben und 5 Normalgehirnproben hybridisiert und analysiert. Von diesen Screening Arrays konnten mehr als 1000 Klone als hochreguliert identifiziert werden. Darunter befand sich auch die Receptor Protein Tyrosine Phosphatase z (RPTP z), die bisher noch nicht mit GBM in Verbindung gebracht worden war und einer ihrer Liganden, Pleiotropin (Ptn). RPTP z war mehr als 1.5-fach in vier Tumorproben hochreguliert (1.62-4.08, n=3, p-Wert < 0.5, Student’s T test). Die rekombinanten Inserts der hochregulierten Klone dieses Screens wurden erneut in Triplikaten auf einen zweiten Array, dem sogenannten Bestätigungsarray, gespottet. Dieser Array wurde erneut mit den 14 GBM Proben und 5 Normalgehirnproben aus dem ersten Screen in zwei unabhängigen Experimenten hybridisiert. Die Bestimmung von Triplikaten per Klon in zwei unabhängigen Experimenten erlaubte eine strengere statistische Analyse der Bestätigungsarrays im Vergleich zu den Screening Arrays. 860 Klone konnten in diesem zweiten Arrayexperiment als hochreguliert bestätigt werden. RPTP z war in 6 von 8 GBM Proben hochreguliert (1.53 (p=0.0047) bis 1.76 (p<0.0001). Insgesamt wurden für die Analyse über 3 Millionen Datenpunkte generiert. Unter anderem wurde Brevican, Tenascin, c-met Rezeptor, CD44, Osteopontin und SPARC (secreted protein acidic and cysteine rich), die schon in der Literatur in Assoziation mit GBM beschrieben worden waren, als hochreguliert identifiziert. Die cDNA Array Ergebnisse wurden mittels quantitativer RT-PCR und Northern Blot Analyse bestätigt. Die Hochregulation von RPTP z auf Proteinebene konnte immunhistochemisch ebenfalls bestätigt werden.
Eine funktionelle Charakterisierung erfolgte mittels Anwendung von small RNA interference (siRNA) und einem modifiziertem Boyden Chamber Migrationsassay. Es konnte in dieser Arbeit konnte gezeigt werden, das Ptn das Migrationsverhalten von RPTP z exprimierenden GBM Zellen konzentrationsabhängig stimuliert, wohingegen kein Effekt bei GBM Zellen zu sehen war, die RPTP z nicht exprimieren. Um dieses System näher zu charakterisieren, wurde die Expression von RPTP z in GBM Zellen mittels siRNA herrunter-reguliert. Es konnte nach siRNA Behandlung eine effiziente Suppression der RPTP z Expression nachgewiesen werden. Diese „Knock Down" Experimente ergaben, dass Ptn über RPTP z das Migrationsverhalten von GBM Zellen stimuliert. Die Suppression der Expression von RPTP z führte zu einem verminderten stimulatorischen Effekt von Ptn auf das Migrationsverhalten von GBM Zellen. Einen Einfluss auf das proliferative Verhalten konnte nicht entdeckt werden.
Um die Rolle von RPTP z in GBM Zellen näher zu untersuchen, wurde das vollständige Gen für die lange Transmembranform für anschließende Überexpressionsexperimente kloniert. Während der Klonierung von RPTP z konnten zwei bisher nicht veröffentliche Spleißvarianten von RPTP z identifiziert werden. Eine Form gleicht der in Mäusen beschriebenen kurzen Phosphacanform, die andere enthält ein zusätzliches 118bp Fragment zwischen den beiden Exonen, die im intrazellulären Anteil für die Phosphatasedomänen kodieren. Es konnte mittels RT-PCR keine eindeutige Expressionspräferenz für eine der Spleißvarianten in GBM gefunden werden.

Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass krankheitspezifische cDNA Arraytechnologie erfolgreich für die Identifizierung von potentiellen Immuntherapie-Zielgenen angewendet werden kann. RPTP z wurde als potentieller Kandidat näher charakterisiert und eine funktionelle Rolle im Migrationsverhalten von GBM Zellen etabliert.

Kurzfassung auf Englisch: Summary

Goal of this thesis was to identify and characterize novel therapeutic targets for antibody mediated immunotherapy for brain tumors. To identify new targets, cDNA array expression profiling was performed using primary tissue from human GBM and normal brain. Disease specific screening arrays containing ~25,000 clones were generated by isolating recombinant clone inserts derived from cDNA libraries enriched for brain tumor relevant transcripts through normalization and subtraction. Since array analysis inherently has high intrinsic noise, a two step array approach was developed. First screening arrays were hybridized with 14 individual GBM and 5 normal human brain control probes. In the analysis of these screening arrays, more then 1150 clones were induced > 2-fold in two or more tumor samples including the receptor protein tyrosine phosphatase zeta (RPTP z). RPTP z was induced > 1.5-fold in 4 tumor probes (ranging from 1.62-4.08, n=3, p < .05, Student’s T-test). This was the first study demonstrating RPTP z association with GBMs. Secondly, recombinant inserts of these clones were spotted in triplicate on a newly designed array, the "confirmatory array", and hybridized in two replicate experiments with newly labeled probes derived from the same mRNA used in the initial screen. The triplicate measurement in two independent experiments of the confirmatory array screen produced more consistent data points per clone and therefore a more rigorous statistical analysis compared to the primary screening arrays could be performed. Eight hundred sixty clones were confirmed and the cDNA inserts of these clones were sequenced and subjected to a comprehensive homology analysis. RPTP z was upregulated in 6 tumor samples out of 8 ranging from 1.53 (p=0.0047) to 1.76 (p<0.0001) compared to normal brain controls. In these screens, pleiotropin (Ptn), which is one of RPTP z main ligands, was also found to be upregulated in GBMs. Other genes transcriptionally induced included brevican, tenascin, c-met receptor, CD44, osteopontin and secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC) as previously reported by others. In total more than 3 million data points were generated in this analysis. These results were confirmed by quantitative RT-PCR and Northern blot analysis. RPTP z’s upregulation at the protein level in GBMs was also demonstrated by immuno-histochemistry.
Further, RPTP z’s role in GBM cells was functionally characterized by using small RNA interference (siRNA) technology to knock down the expression of RPTP z. Efficient knock down of gene expression by siRNA in glioblastoma cell lines was demonstrated. This experimental system was used to unravel a previously unknown role for RPTP z in the migration of brain tumor cells. We were able to show that the migration of glioblastoma cells is influenced by a concentration dependent stimulation of the Ptn-RPTP z signaling pathway. In addition, cells with no detectable RPTPz expression did not respond to Ptn stimulation in the migration assay. The suppression of RPTP z’s expression reduced the stimulatory effect of Ptn on cellular migration. These results suggest that the Ptn-RPTP z signaling pathway is involved in the regulation of glioblastoma cell motility. No effect was seen in the proliferation of GMBs.
The full-length gene was cloned in attempt to better understand RPTP z’s role in GBM cell lines. This gene is notably large with multiple splice variants. In fact two novel variants were identified that had not been previously reported. One variant resembles the short Phosphacan form identified in mice and the other contains an additional 118 bp fragment in the intracellular domain, between the two exons coding for the phosphatase domains. No splice variant preferences were seen in 24 GBMs tested.

I summary, custom designed cDNA array technology was successfully employed to identify RPTP z as a possible new target for antibody mediated immuno-therapy in GBMs. A functional role for RPTP z and its ligand Ptn in the migratory behavior in GBM cells was successfully identified.








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