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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-23992
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2399/


Insulin-mimetische Picolinatovanadium-Verbindungen

Insulin-mimetic Picolinato-Vanadium Compounds

Gätjens, Jessica

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SWD-Schlagwörter: Vanadiumkomplexe , Bioanorganische Chemie , Diabetes mellitus
Freie Schlagwörter (Deutsch): Picolinate , Insulin-mimetik
Freie Schlagwörter (Englisch): insulin-mimetics , picolinates , vanadium , bioinorganic chemistry
Basisklassifikation: 35.43 , 35.42 , 35.45
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Rehder, Dieter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.02.2005
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 29.03.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel der vorliegenden Arbeit war die Synthese von Insulin-mimetischen Vanadium(IV/V)komplexen mit Derivaten der Pyridin-2-carbonsäure (Picolinsäure) als Liganden.
Dieses Ligandensystem wurde ausgewählt, da die zugehörigen Vanadiumverbindungen besonders gut verträgliche und sehr wirksame Insulin-mimetika sind. Um die Transporteigenschaften und die Aufnahme zu verbessern sowie die Toxizität zu verringern, wurde ein Derivat der Picolinsäure eingesetzt, das Möglichkeiten zur Modifikation bietet.
Ausgehend von Pyridin-2,5-dicarbonsäure konnten einfache Alkylesterliganden entwickelt werden, die sich durch eine ausgewogene Lipophilie und Hydrophilie auszeichnen, und so den passiven Transport der Komplexe durch die hydrophoben Membranen unterstützen sollten. Um eventuell auch einen aktiven Transport in die Zielzellen zu gewährleisten, wurden Liganden synthetisiert, die an der 5-Position des aromatischen Rings Erkennungsmerkmale für Zellmembranrezeptoren tragen.
Nach der Umsetzung der Liganden mit Ausgangsverbindungen des Vanadiums konnten die erhaltenen Komplexe vollständig charakterisiert werden. Anschließend wurden die Verbindungen auf ihre Zelltoxizität und auf die Insulin-mimetischen Eigenschaften sowohl in Hinblick auf die Glucoseaufnahme und -oxidation als auch auf die Inhibierung der Lipolyse untersucht.

Zunächst wurden 5-Carboalkoxypyridin-2-carbonsäuren (5ROpicH) synthetisiert und in einigen Fällen auch strukturell abgesichert.
Durch die Reaktion von Vanadylsulfat mit den Liganden in wässriger, mit Natriumacetat gepufferter Lösung, konnten Vanadium(IV)komplexe der gewünschten Zusammensetzung [VO(5ROpic)2] als grüne Feststoffe isoliert werden. Diese wurden sowohl durch die spektroskopischen Daten (IR, EPR) als auch durch die Molekülstrukturen abgesichert.

Insulin-mimetische Tests in Hinblick auf Glucoseaufnahme und -oxidation in lebenden Zellen (SV 3T3 Fibroblasten) wurden mit Hilfe des MTT-reduction essays durchgeführt. Bei dieser Methode werden Reduktionsäquivalente, die in der Zelle durch Abbau der Glucose entstehen, zur Reduktion eines gelben Farbstoffes (MTT) zu Formazanblau verwendet. Dessen Absorption wurde photometrisch bestimmt. Die Absorption ist somit ein Maß für die Befähigung der Vanadiumverbindung, die Glucoseaufnahme zu stimulieren. Es zeigt sich, dass die Verbindungen mit 5ROpicH als Ligand bei nicht-toxischen Konzentrationen (unterhalb von 100 µM) effektiv sind. Sehr deutliche Effekte werden bei höheren Konzentrationen durch den Komplex [VO(5MeOpic)2] hervorgerufen. Dessen Aktivität ist vergleichbar der des Insulins.

Mit einem weiteren Testsystem wurde die Fähigkeit der Vanadiumverbindungen untersucht, in vitro die Lipolyse zu inhibieren und somit einen weiteren Effekt des Insulins nachzuahmen. Für diesen Test wurden Adipocyten mit Adrenalin behandelt, mit einer Lösung der Vanadiumverbindung [VO(5MeOpic)2] inkubiert und anschließend der Gehalt an freien Fettsäuren innerhalb der Zellen bestimmt. Als Vergleichssubstanzen wurden VOSO4 und Bis(picolinato)oxovanadium(IV), [VO(pic)2], verwendet. Zusätzlich wurde auch die Insulin-mimetische Aktivität des freien Liganden 5MeOpicH überprüft.
Es zeigte sich, dass [VO(5MeOpic)2] hier eine höhere Aktivität aufweist als VOSO4. Die Effektivität liegt im Bereich der von [VO(pic)2]. Der Ligand allein zeigt keinen Effekt. Die Verbindungen sind bei hohen externen Konzentrationen von 1 mM wirksam. Die Effizienz ist vermutlich auf eine besonders gute Aufnahme der Verbindungen in die Zellen zurückzuführen.

Im weiteren Verlauf wurden organische Reste mit biologischer Relevanz an der 5-Position des aromatischen Rings eingeführt. Es handelte sich hierbei um Aminosäurederivate , Galactose und Inositol sowie Cholin und das verwandte Dimethylaminoethanol. Die Vanadiumkomplexe wurden, ausgehend von Vanadylsulfat, ebenfalls als grüne Feststoffe der allgemeinen Zusammensetzung [VO(L)2] (L = Ligand) erhalten.
Die Vanadiumkomplexe mit den Aminosäurederivaten, sowie dem Galactosederivat wurden auf ihre Insulin-mimetischen Aktivität bezüglich Glucoseaufnahme und oxidation getestet.
Der stärkste Effekt wird für die Verbindung mit einem Galactose-Derivat als Ligand ([VO(5Galpic)2]) gefunden, unabhängig von der Konzentration. Ähnlich verhält sich der Vanadium(IV)komplex mit einem L-Alaninethylester-Derivat. Beide Verbindungen zeigen Aktivitäten, die vergleichbar zu Insulin selbst sind. Bei sehr geringen Konzentrationen (c < 10 µM) sind weiterhin Insulin-mimetische Effekte zu beobachten. Diese liegen allerdings unterhalb der Wirkung, die durch den Zusatz von Insulin erreicht wird.

Mit dem Liganden Pyridin-2,5-dicarbonsäure (2,5dipic) konnte neben einfachen binären Vanadiumverbindungen mit dem Metall in der Oxidationsstufe +IV/V auch ein Monoperoxo- sowie ein Bisperoxokomplex ausgehend von V2O5 erhalten werden. Die Verbindungen wurden sowohl durch die spektroskopischen Daten (IR, NMR) als auch durch Röntgenstrukturanalyse abgesichert.
Kurzfassung auf Englisch: Objective of this thesis was the synthesis of insulin-mimetic picolinato-vanadium(IV/V) complexes with derivatives of pyridine-2-carboxylic acid (picolinic acid) as ligands.
This ligand system was chosen, because the related vanadium compounds are very potent anti-diabetic agents. In order to improve transport and absorption as well as to lower the toxicity of the compounds, a derivative of picolinic acid was applied which has an additional site for modification.
Starting from pyridine-2,5-dicarboxylic acid, simple alkylester ligands were developed, that exhibit a balanced lipophilicity and hydrophilicity, in order to provide an efficient absorption of the complexes by passive transport across hydrophobic membranes. For a second set of ligands, the alkyl residues were replaced by organic molecules which should be recognised by cell membrane receptors, thus initiating or supporting an active transport into the cell.
After the synthesis and characterisation of the related vanadium complexes, these were submitted to biochemical analyses in order to assess their cell toxicity and their insulin-mimetic potential with regard to glucose uptake and oxidation, and the inhibition of lipolysis.

In the first part of this work 5-carboalkoxypyridine-2-carboxylic acids (5ROpicH) were synthesised and, in several cases, structurally characterised.
The reaction of these ligands with vanadyl sulfate in aqueous solution buffered with sodium acetate yielded the desired complexes [VO(5ROpic)2] as green solids. This was verified by spectroscopic evidence (IR, EPR) and crystal structure determinations.

Insulin-mimetic tests with respect to in vivo glucose uptake and oxidation were performed with living cells (SV 3T3 fibroblasts) by the MTT reduction essay. Yellow MTT is reduced to formazane blue in the terminal part of the mitochondrial electron transfer chain. The amount of formazane blue is determined photometrically and is proportional to the amount of glucose taken into and degraded within the cells. All compounds are effective at non-toxic concentrations (below 100 µM). The compound [VO(5MeOpic)2] also exhibits very high insulin-mimetic activity at higher concentrations. It is compareable to insulin itself.

An additional test system was employed, which allows to test vanadium compounds for their ability to inhibit lipolysis, and thus to mimic yet another effect of insulin. Adipocytes were treated with adrenalin and incubated with a solution of the vanadium compound [VO(5MeOpic)2]. Then the concentration of free fatty acids inside the cells was determined. As reference were chosen VOSO4 and Bis(picolinato)oxovanadium, [VO(pic)2]. In addition, the insulin-mimetic activity of the ligand itself was tested.
[VO(5MeOpic)2] exhibits a higher insulin-mimetic activity than VOSO4 at high concentrations and is comparable to [VO(pic)2]. The ligand itself shows no activity. The compound is able to lower elevated levels of free fatty acids. The high activity both in the inhibition of lipolysis and the stimulation of glucose transport and oxidation may be related to effective cellular uptake of the compound caused by a well balanced lipophilicity and hydrophilicity.

In a second part of the synthetic work, organic molecules of biological relevance were introduced into the ligand sphere, providing a potential site for bio-recognition. As functional groups, amino acids, galactose, inositol, cholin and the related dimethylamino ethanol were used. Starting from vanadyl sulfate the vanadium compounds [VO(L)2] (with L = ligand) were obtained as green solids.
The vanadium complexes with the amino acids as ligands, as well as the galactose derviative were tested with regard to their ability to stimulate the uptake and oxidation of glucose by the MTT reduction essay.
The most prominent effect is found for compound with a galactose derivative as ligand, ([VO(5Galpic)2]) independent of the concentration. The effect is comparable to the vanadium(IV) compound with an L-alanine ethyl ester derivative as ligand and to insulin itself. Even at very low concentration (c < 10 µM), there is an observable activity below the effect, however, found for insulin.

With pyridine-2,5-dicarboxylic acid (2,5dipic) as ligand, simple vanadium complexes with the metal in the oxidation state +IV/V as well as mono- and bisperoxo complexes were synthesised. This was verified by spectroscopic evidence (IR, NMR) and crystal structure determination of the monoperoxo complex.

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