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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-24179
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2417/


Analyse der Bindung von Gangliosid-Derivaten an das Myelin-assoziierte Glycoprotein (MAG)

Analysis of the binding of ganglioside derivatives to the myelin-associated glycoprotein (MAG)

Shin, So-Young

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SWD-Schlagwörter: NMR-Spektroskopie , Rückenmarksverletzung , Myelin , Acetylneuraminsäure <N-> , Kohlenhydrate
Freie Schlagwörter (Deutsch): Myelin assoziiertes Glycoprotein , Saturation Transfer Difference NMR , Gangliosid-Derivate , Dissoziationskonstanten , Bindungsepitope
Freie Schlagwörter (Englisch): myelin-associated glycoprotein, Saturation Transfer Difference NMR , ganglioside derivatives , dissociation constant , binding epitope
Basisklassifikation: 35.71 , 35.25 , 35.63
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.03.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 18.04.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Das Myelin-assoziierte Glycoprotein (MAG) ist ein Protein der Oligodendrozytenmembran und des Myelins im zentralen Nervensystem (ZNS). Es ist verantwortlich für die Inhibition der axonalen Regeneration nach einer Verletzung des Rückenmarks. MAG gehört zu der Familie der Siglecs und ist somit ein Sialinsäure bindendes Lektin. Dabei spielt das Arginin 118, das eine Salzbrücke zum Carboxylat einer Sialinsäure ausbildet, eine zentrale Rolle. Eine Inhibierung des MAGs kann eine Regeneration der zerstörten Neuriten ermöglichen, wie DeBellard et. al. mit sialylierten Kohlenhydraten nachwiesen.
Bei dieser Arbeit wurde die Bindung verschiedener sialylierter Glycokonjugate an eine wasserlösliche MAG Chimäre, das FcMAGd1-3 studiert. Dafür wurde Saturation Transfer Difference NMR (STD NMR) eingesetzt, mit dem sich die Bindung eines kleinen Liganden an ein großes Protein verfolgen lässt. Über STD NMR ließen sich die KD-Werte der Interaktionen und die Bindungsepitope der Liganden bestimmen.
Als Liganden für das MAG dienten Trisaccharide, die einen Ausschnitt aus dem funktionellen Liganden des MAGs, GT1b darstellten, und Tetrasaccharide, die einen Ausschnitt aus dem Gangliosid mit der höchsten Affinität zu MAG, dem GQ1balpha, darstellten. Weiterhin wurde ein Milchsäure-Derivat der Tetrasaccharide und ein aromatisches Sialinsäure-Derivat untersucht. Von allen Liganden wurde der KD-Wert und das Bindungsepitop bestimmt.
Es zeigte sich, dass die KD-Werte der Trisaccharide bei 650, 390 und 820 µM lagen, während die KD-Werte der Tetrasaccharide bei 110 und 180 µM lagen. Die Tetrasaccharide banden also um den Faktor vier besser an das MAG, als die korrespondierenden Trisaccharide. Interessanterweise zeigten hierbei die Liganden mit N-Acetylgruppe an der reduzierenden Galactose, wie sie in der nativen Struktur bei GT1b und GQ1balpha vorkommt, eine um den Faktor zwei schlechtere Bindung, als die Liganden ohne N-Acetylgruppe. Dies traf sowohl für die Trisaccharide als auch für die Tetrasaccharide zu.
Aus den Bindungsepitopen der Saccharide konnte erkannt werden, dass ein Schwerpunkt der Bindung auf der N-Acetylgruppe und der Glycerinseitenkette der 2,3-verknüpften Sialinsäure liegt. Es ist wahrscheinlich, dass diese beiden Gruppen mit einem hydrophoben Patch auf der Oberfläche des Proteins interagieren. Nach einem Homologiemodell des MAGs anhand von Sialoadhesin sollte die N-Acetylgruppe der Sialinsäure mit dem Tryptophan 2 wechselwirken. Im Sialoadhesin binden die Hydroxylgruppen von C8 und C9 der Sialinsäureseitenkette einerseits an das Peptid Backbone von Leucin 107 und andererseits kommt es zu hydrophoben Interaktionen der Glycerinseitenkette mit Tryptophan 106. Möglicherweise liegt beim MAG eine analoge Situation vor. Ein weiterer Schwerpunkt der Bindung lag auf H-3 bis H-5 der mittleren Galactose, während sich die reduzierende Galactose bzw. das Galactosamin und die 2,6-verknüpfte Sialinsäure (bei den Tetrasacchariden) wenig an der Bindung beteiligen.
Insgesamt zeigte sich, dass die Trisaccharide untereinander und die Tetrasaccharide untereinander einen sehr ähnlichen Bindungsmodus zeigten.Bei einem Vergleich der Bindungsepitope der Trisaccharide mit denen der Tetrasaccharide stellte sich heraus, dass die Bindung in den Tetrasacchariden bezüglich der N-Acetylgruppe der 2,3-verknüften Sialinsäure insgesamt erniedrigt ist. Das Muster der Protonen, die an der Bindung beteiligt sind, ist zwar ähnlich, aber die STD Intensität in diesen Bereichen hat bei den Tetrasacchariden abgenommen. Es ist möglich, dass die bessere Interaktion bei den Tetrasacchariden über eine Gruppe stattfindet, die im STD NMR nicht beobachtet werden kann. Zusammengefasst zeigen die Tetrasaccharide einen etwas anderen Bindungsmodus als die Trisaccharide.
Bei der Analyse eines Homologiemodells des MAGs im Arbeitskreis von Prof. Dr. Thomas Peters an der Medizinischen Universität Lübeck wurde festgestellt, dass eine ionische Interaktion der 2,6-verknüpften Sialinsäure der Tetrasaccharide mit dem Lysin 67 möglich ist. Da sich außerdem die 2,6-verknüpfte Sialinsäure wenig an der Bindung beteiligte wurde ein Derivat der Tetrasaccharide mit einer Milchsäure anstelle einer Sialinsäure verwendet. Dieses Derivat zeigte einen ähnlichen KD-Wert (130 µM) und Bindungsepitop wie die untersuchten Tetrasaccharide. Daher ist es möglich, dass die Interaktion des Carboxylates der 2,6-verknüpften Sialinsäure mit dem Protein von Bedeutung ist. Es ist denkbar, dass sich die Hauptbindungsstellen auf die beiden Carboxylate der Tetrasaccharide konzentrieren, so dass das Molekül zwischen diesen beiden Salzbrücken verankert ist.
Kurzfassung auf Englisch: Myelin-associated Glycoprotein (MAG) is a protein of the oligodendrocyte membranes and of myelin in the central nervous system (CNS). It is responsible for the inhibition of axonal regeneration after spinal cord injury (SCI). MAG belongs to the family of the Siglecs and is a sialic acid binding lectin. For this interaction arginine 118 plays a dominant role, because it establishes a salt bridge to the carboxylate of a sialic acid. The inhibition of MAG may allow the regeneration of severed neurites as DeBellard et. al. showed.
Here, the binding of several sialylated glycoconjugates to a water soluble MAG chimera, FcMAGd1-3 was studied. For this, Saturation Transfer Difference NMR (STD NMR) was employed, because it is useful for the observation of small ligands binding to a large protein. STD NMR allows the determination of KD values of the interactions and of binding epitopes of the ligands.
Trisaccharides, who represent a section of the functional ligand of MAG GT1b, and tetrasaccharides, who represent a section of the ganglioside with the highest affiniy to MAG, GQ1balpha, served as ligands. Further a lactic acid derivative of the tetrasaccharides and an aromatic derivative of sialic acid were tested. The KD values and binding epitopes were determined for all ligands.
It was shown, that the KD values of the trisaccharides were at 650, 390 and 820 µM, while the KD values for the tetrasaccharides were at 110 and 180 µM. The tetrasaccharides bound thus four times better to MAG than the corresponding trisaccharides. Interestingly the ligands with the N-acetyl group at the reducing galactose, as is apparent in the native structure of GT1b and GQ1balpha showed a factor two inferior binding, than the ligands without N-acetyl group. This applied to both trisacharides and tetrasaccharides.
When regarding the binding epitopes of the saccharides it is apparent that a focal point of the binding is at the N-acetyl group and at the glycerol side chain of the 2,3 bound sialic acid. It is likely, that these two groups interact with a hydrophobic patch on the surface of the protein. A homology model of MAG on the basis of sialoadhesin predicted the interaction of the N-acetyl group of the sialic acid with tryptophane 2. In sialoadhesin the hydroxyl groups of C8 and C9 of the sialic acid side chain bind to the peptide backbone of leucine 107. Furthermore there are hydrophobic interactions of the glycerol side chain with tryptophane 106. It is possible that there is an analogous situation present with MAG. Another focal point of binding are H-3 to H-5 of the middle galactose, while the reducing galactose or galactosamine and the 2,6 bound sialic acid (tetrasaccharides) do not participate much in binding.
Altogether it could be shown that the trisaccharides and the tetrasaccharides within their groups showed a very similar binding mode. When the binding epitopes of the trisaccharides are compared with those of the tetrasaccharides, it is clear that the binding of the tetrasaccharides with regard to the N-acetyl group of the 2,3 bound sialic acid is lowered. The pattern of the protons that participate in binding is similar but the STD intensity in those regions has decreased for the tetrasaccharides. It is possible that the improved interaction of the tetrasaccharides occurs via a group, that can not be detected with STD NMR. In summary the tetrasaccharides show a slightly different binding mode than the trisaccharides.
The analysis of a homology model of MAG in the research group of Prof. Dr. Thomas Peters at the Medical University of Lübeck yielded a possibility for an ionic interaction of the 2,6 bound sialic acid of the tetrasaccharides with lysine 67. Because the 2,6 bound sialic acid participated little in binding a derivative of the tetrasaccharides with a lactid acid instead of the sialic acid was used. This derivative showed a similar KD value (130 µM) and binding epitope like the analyzed tetrasaccharides. Therefore it is possible that the interaction of the carboxylate of the 2,6 bound sialic acid with the protein is of importance. It is conceivable that the central binding regions in the ligand are the two carboxylates of the tetrasaccharides, so that the molecule is fixed between those two saltbridges.

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