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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-24239
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2423/


Molekulare und funktionelle Analyse von humanen neuronalen Zelloberflächen-Molekülen

Molecular and functional analysis of human neuronal cell-surface molecules

Hartwig, Christine

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SWD-Schlagwörter: Neurales Zell-Adhäsionsmolekül , Axon , Nervenzelle , Semaphorine
Freie Schlagwörter (Deutsch): Plexin , L1 , Neuropilin , L1-Spektrumerkrankung , Missense Mutation
Freie Schlagwörter (Englisch): Plexin, L1 , Neuropilin , L1-spectrum disorder , missense mutation
Basisklassifikation: 42.20 , 44.48 , 42.15 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Gal, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.02.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 02.05.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Zellkultur-Modell zur Analyse des Einflusses neuronaler Zelloberflächen-Moleküle auf das Neuritenwachstum muriner zerebellärer Neurone etabliert (Neuriten-Wachstums-Assay). Mit diesem Modell konnte der Effekt pathogener Mutationen in für das Nervensystem entwicklungsrelevanten Genen quantitativ erfasst werden. Das Modell wurde zunächst an dem bereits gut charakterisierten Zelloberflächen-Molekül L1, in dessen Gen (L1CAM) human-pathogene Mutationen bekannt sind, getestet. Mutationen in L1CAM verursachen ein breites Spektrum neurologischer Auffälligkeiten (L1-Spektrum Erkrankungen). Wie diese Mutationen neuronale Entwicklungsstörungen bewirken und ob die Effekte der Mutationen in vitro simuliert werden können, ist bisher nicht ausreichend untersucht. Aus diesem Grund wurden die humanpathogenen Missense Mutationen Y194C, I179S, R184W und C264Y, welche in der extrazellulären Domäne von L1 Aminosäureaustausche verursachen, in die cDNA von L1CAM eingeführt. An stabil die mutierten Proteine exprimierenden Zelllinien wurde die L1-Proteinexpression, Glykosylierung und subzelluläre Lokalisation untersucht und im Folgenden wurden die Zelllinien als Substratzellen im Neuritenwachstums-Assay eingesetzt. Nur die mutierten Proteine L1-Y194C und L1-I179S zeigten eine mit Wildtyp-L1 vergleichbare Prozessierung und Zelloberflächenlokalisation. Die Prozessierung der mutierten Proteine L1-C264Y und L1-R184W war gestört und ihre Oberflächenlokalisation stark reduziert. Alle vier mutierten Proteine waren mit einer reduzierten Stimulation des Neuritenwachstums assoziiert. Mit Hilfe des Modells waren sowohl das L1-abhängige Neuritenwachstum, als auch dessen mutationsbedingte Reduktion demonstrierbar.
Weiter wurde das Modell für die Untersuchung eines bislang wenig charakterisierten Kandidatengens für neurologische Enticklungsstörungen, Plexin B3 (PLXNB3), eingesetzt. Plexine sind als Semaphorin-Rezeptoren im Nervensystem an der Semaphorin-vermittelten repulsiven Axonwegfindung beteiligt. Über die Funktion von Plexin B3 war zu Beginn dieser Arbeit wenig bekannt. Es hatte im Neuritenwachstums-Assay einen sehr stark stimulierenden Effekt auf das Neuritenwachstum. Im Rahmen der Analyse möglicher molekularer Mechanismen für die beobachtete Stimulierung konnte eine heterophile Interaktion von Plexin-B3 mit Neuropilin 1, L1 und Semaphorin 5A und eine homophile Interaktion B3-B3 nachgewiesen werden, welche mittels verschiedener Deletionskonstrukte auf die Sema-Domäne von B3 zurückzuführen war. Weiter konnte gezeigt werden, dass diese homophile Interaktion in trans stattfindet und Ca2+/Mg2+-abhängig ist. Mit Hilfe eines modifizierten Hefe-Zwei-Hybridsystem wurde eine Interaktion von B3 mit der neuronspezifischen Ras-GTPase Rin identifiziert und durch Koimmunpräzipitations- und Kolokalisations-Experimente verifiziert. Da bekannt war, dass eine Rin-Überexpression in PC12-Zellen Neuritenwachstum induziert, erscheint auch denkbar, dass Rin an der B3-abhängigen Stimulierung des Neuritenwachstums beteiligt ist.
Zusammenfassend deuten die verschiedenen für Plexin B3 identifizierten extrazellulären und intrazellulären Interaktionen auf eine multifunktionale Rolle von B3 bei der neuronalen Zelladhäsion, Attraktion und Repulsion hin. Plexin B3 könnte daher eine wichtige Bedeutung bei der Entwicklung des Nervensystems spielen.
Kurzfassung auf Englisch: In this study a cell culture model was developed, to analyse the influence of neuronal cell-surface molecules on neurite outgrowth of murine cerebellar neurons. First the model was tested with the well characterized transmembrane neuronal cell-adhesion molecule L1. Mutations in L1CAM, the gene encoding L1, are associated with neurodevelopmental disorders (L1-spectrum disorders). It is largely unknown, however, how these mutations result in neurodevelopmental disturbances and whether the effects of mutations on neurodevelopment can be modeled in vitro. We stably expressed full-length human wild type L1 and the known pathogenic missense mutations I179S, R184W, Y194C, and C264Y (causing amino acid substitutions in different extracellular domains of L1) in NIH-3T3 cells. L1 protein synthesis, glycosylation pattern, and subcellular localization were analyzed. Neurite outgrowth of primary murine cerebellar neurons was measured after 24hrs of co-cultivation using transfected NIH-3T3 cells as substrate. Like wild type L1, L1 protein with I179S or Y194C mutations was localized on the surface of the transfected substrate cells, but this was not the case with R184W or C264Y mutations. All four mutations were associated with reduced stimulation of neurite outgrowth. Measurement of neurite outgrowth on transfected substrate cells may be a suitable model for studying neurodevelopmental disturbances associated with mutations affecting extracellular domains.
In addition, we used the cell culture model to analyse a poorly characterized candidate-gene for neurological disorders, plexin B3 (B3). Plexins, known to date as receptors of semaphorins, are implicated in semaphorin-mediated axon repulsion and growth cone collapse. However, subtype-specific functions of the majority of the nine members of the mammalian plexin family are largely unknown. In order to investigate functional properties of B3, the expression of human and murine B3 protein and expressed full-length human B3 in NIH-3T3 cells was analysed. Unexpectedly, B3 strongly stimulates neurite outgrowth of murine cerebellar neurons. B3 mediates Ca2+/Mg2+-dependent cell aggregation due to homophilic trans-interaction. Using different deletion constructs it was demonstrated that the sema domain of B3 is essential for homophilic interaction. Furthermore, using immunoprecipitation-experiments, a heterophilic interaction of B3 with neuropilin-1, L1 and semaphorin 5A was shown. Using yeast two-hybrid analysis, the neuron-specific and calmodulin-binding Ras-related GTPase Rin was identified as an interaction partner of the intracellular part of B3, but not of B2. Rin, also known for its neurite outgrowth-inducing characteristics, co-localizes and co-immunoprecipitates with B3 in co-transfected COS-7 cells. The different identified extracellular and intracellular interactions of plexin B3 suggest a multifunctional role in neuronal cell adhesion, attraction and repulsion, and a possible function for B3 during the development of the nervous system.

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