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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-24473
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2447/


Identifikation charakteristischer Bindungsstrukturen zwischen den T-lymphozytären Kaliumkanälen Kv1.1, Kv1.3 und SKCa2 und Kanalliganden anhand von Chimären des prokaryotischen Kaliumkanals KcsA

Identification of characteristic binding structures between the potassium channels Kv1.1, Kv1.3, and SKCa2 on T-lymphocytes and channel ligands using chimeras of the prokaryotic potassium channel KcsA

Albers, Florian

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SWD-Schlagwörter: Kaliumkanal , Skorpiongift , Phagen-Display-Bibliothek , T-Lymphozyt
Freie Schlagwörter (Deutsch): Hongotoxin , Bindungsassay , KcsA , spannungsgesteuert , Kanalchimäre , Bindungsstrukuren
Freie Schlagwörter (Englisch): Hongotoxin , potassium channel , t-lymphocyte , scorpion toxin , bindingassay
Basisklassifikation: 44.30
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Pongs, Olaf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.04.2005
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 04.05.2005
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurde nach charakteristischen Bindungsstrukturen zwischen verschiedenen Kaliumkanälen auf T-Lymphozyten und entsprechenden Liganden gesucht. Teile der Porenregion der eukaryotischen spannungsgesteuerten Kaliumkanäle Kv1.1 und Kv1.3 konnten mit der Porenregion des prokaryotischen KcsA-Kanals ausgetauscht werden, so dass KcsA die Porenregion der humanen Kaliumkanäle imitiert. In dieser Arbeit wurde der Austausch der Porenregion am Beispiel des auf leukämischen Jurkat T-Lymphozyten exprimierten kalziumaktivierten Kaliumkanals SKCa2 erfolgreich vorgenommen. Die Kanalchimären KcsA-Ska und KcsA-Skb konnten in einer E.coli M15-Kultur exprimiert werden.
Des Weiteren wurde in Bindungsassays das Bindungsverhalten zwischen den Kanalchimären KcsA-Kv1.1 sowie KcsA-Kv1.3 und den Kanaltoxinen Hongotoxin 1 (HgTX1) und Kaliotoxin (KTX) untersucht. Im Fall von KcsA-Kv1.1 (Chi XI) wurde eine Substitution L81M in der Subregion III der Kanalpore eingeführt und mit der Bindungscharakteristik ohne Substitution verglichen. Es konnte für HgTX1 ein sogar noch größerer Abfall der Affinität festgestellt werden als für KTX. Das Leucin an Position 81 scheint also für die Bindung beider Toxine wichtig zu sein.
Die KcsA-Kv1.3 Chimäre (Chi IV) wurde mit der einer Doppelmutation L81M/Y82H (Chi VIII) in Subregion III in Bindungsassays verglichen. In die Chimäre VIII wurde zusätzlich eine Substitution G56T in Subregion I eingefügt und in Bindungsassays untersucht. Für das Threonin an Position 56 konnte so ein entscheidender Beitrag in der Bindung zu HgTX1 festgestellt werden, während diese Position für die Bindung mit KTX keine Rolle zu spielen scheint. Die Doppelmutation in der Subregion III (Chi VIII) scheint im Fall von Kv1.3 und der Bindung mit den benutzten Kanaltoxinen eine untergeordnete Rolle zu spielen.
Die Identifikation neuer Bindungsstrukturen in Kaliumkanälen auf T-Lymphozyten sowie die Entwicklung neuer Liganden, die die Ionendurchlässigkeit der Kanäle beeinflussen, kann der Entwicklung hochspezifischer Immunsuppressiva und Autoimmuntherapeutika dienen. Hierbei stellten sich die KcsA-Chimären als hervorragende Mini-Modelle der eukaryotischen Kanalporen für pharmakologische Bindungsstudien heraus.
Kurzfassung auf Englisch: In the present study characteristic binding structures between different potassium channels expressed on T-lymphocytes and appropriate ligands are being surveyed. Parts of the pore region of the eukaryotic voltage-gated potassium channels Kv1.1 and Kv1.3 could be inserted into the pore region of the prokaryotic potassium channel KcsA in a way that the KcsA channel mimics the pore region of the human potassium channels. In this work, the exchange of the pore region was successfully accomplished on the example of the calcium activated potassium channel SKCa2 which is normally expressed on T- lymphocytes of the leukaemic T-cell line Jurkat. The chimeras of the channel Kcsa-Ska and Kcsa-Skb could be expressed in a culture of the E. coli M15 line.
Furthermore, the binding behaviour of the channel toxins Hongotoxin 1 (HgTX1) and Kaliotoxin (KTX) to the chimeras KcsA-Kv1.1 and KcsA-Kv1.3 have been surveyed in binding assays. In the case of KcsA-Kv1.1 (Chi XI), a substitution L81M in the subregion III of the channel pore was being introduced. Its binding characteristics were compared to the characteristics of the channel without the substitution. For HgTX1 even a greater decrease in affinity to the chimera with the introduction of the substitution could be discovered than for KTX. Therefore, The Leucin at Position 81 seems to be important for the binding of both toxins.
The KcsA-Kv1.3 chimera (Chi IV) was compared to a double mutation L81M/Y82H (Chi VIII) in subregion III in binding assays. Additionally, a substitution G56T was introduced into subregion I and surveyed in binding assays. For the Threonine at position 56 a substantial part in the binding to HgTX1 could be discovered while this position seems to be unimportant for the binding to KTX. The double mutation in subregion III (Chi VIII) seems to be less important for the binding to the used channel toxins in the case of Kv1.3.
The identification of new binding structures in potassium channels expressed on T-lymphocytes as well as the development of new ligands that influence the ion permeation through the channel can help to develop highly specific immune suppressors and autoimmune therapeutics. In this connection, the KcsA chimeras turned out to be terrific mini models of the eukaryotic channel pores for pharmacological binding studies.

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