Untersuchungen zur Interaktion zwischen dem Zelladhäsionsmolekül L1 und dem Zytoskelettprotein Cortactin

Abstract

GFAP-L1-Mäuse exprimieren das neurale Zellerkennungsmolekül L1 ektopisch in Astrozyten. Eine semiquantitative Analyse der Genexpression in Hippocampi dieser transgenen Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Tieren hatte gezeigt, dass diese deutlich geringere Mengen des Proteins Cortactin exprimieren. Cortactin ist mit Actinfilamenten assoziiert und an Prozessen beteiligt, die eine Reorganisation des Actinzytoskeletts erfordern. Um den physiologischen Zusammenhang zwischen L1 und Cortactin zu untersuchen, wurde die Lokalisation beider Proteine in Primärkulturen von Hippocampusneuronen untersucht und in Gewebeschnitten 5 Tage alter und adulter Hippocampi der Maus verglichen. In Primärkulturen von Hippocampusneuronen sind Cortactin und L1 entlang der Neuriten kolokalisiert, und Cortactin ist in den Wachstumskegeln angereichert. Betrachtet man die Expression von Cortactin im Hippocampus, so zeigen sich entwicklungsabhängige Veränderungen: im adulten Tier wurde neben der Lokalisation in dendritischen Bereichen auch eine Lokalisation im stratum lucidum der CA3-Region, einer axonreichen Schicht, gezeigt. In dieser Schicht wurde im 5 Tage alten Hippocampus kein Cortactin exprimiert. Möglicherweise übt Cortactin in den Axonen oder Dendriten des Hippocampus verschiedene Funktionen aus, die von L1 reguliert werden. Frühere Studien zeigen, dass extrazelluläre Stimuli eine Umverteilung von Cortactin an die Zellperipherie auslösen können. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht, ob auch die Antikörperstimulation von L1 eine solche Umverteilung verursacht. Zwar führte die Stimulation, wie erwartet, zur Endozytose von L1. Eine Umverteilung von Cortactin in den Zellcortex oder eine Kolokalisation von Cortactin mit endozytiertem L1 konnte jedoch nicht beobachtet werden. Ferner schien aufgrund der beobachteten Kolokalisation von L1 und Cortactin in hippocampalen Neuronen eine direkte Interaktion beider Proteine möglich. Um dies zu überprüfen, wurden L1-Immunpräzipitationen aus den detergenslöslichen Membranfraktionen aus dem Gehirnhomogenat einer 6 Tage alten Maus durchgeführt. Eine Kopräzipitation von Cortactin war jedoch nicht zu beobachten. In einer früheren Untersuchung wurde gezeigt, dass die Interaktion von Cortactin mit dem Adhäsionsmolekül ICAM erst durch ICAM-Stimulation ausgelöst wird. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob es in L1-stimulierten N2A-Zellen zu einer Interaktion von L1 und Cortactin kommt. Aus den entsprechenden Zell-Lysaten ließen sich L1 und Cortactin jedoch nicht kopräzipitieren. Eine Beteiligung von Cortactin an L1-vermittelten Vorgängen setzt nicht unbedingt eine direkte Interaktion der beiden Proteine voraus. Auch eine Interaktion von Cortactin mit Komponenten des L1-stimulierten intrazellulären Signalwegs ist möglich. Die Förderung von Neuritenwachstum und Neuritogenese zählt zu den am besten etablierten biologischen Funktionen von L1. Daher wurde, um die Beteiligung von Cortactin an L1-abhängigen biologischen Prozessen zu klären, das Neuritenwachstum sowie die Neuritogenese hippocampaler Neuronen bei Überexpression wildtypischen und mutierten Cortactins untersucht. Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten deuten auf eine Beeinflussung des L1-vermittelten Neuritenwachstums durch Cortactin hin. Auch das Neuritenwachstum und die Neuritogenese von NCAM werden möglicherweise durch Cortactin beeinflusst. Diese Arbeit liefert keinen Hinweis auf eine direkte Interaktion zwischen L1 und Cortactin. Dagegen deuten die Ergebnisse der funktionalen Experimente darauf hin, dass Cortactin am L1- und NCAM-abhängigen Neuritenwachstum sowie der Neuritogenese beteiligt sein könnte. Sowohl die Entstehung als auch das Wachstum von Neuriten erfordern eine Reorganisation des Actinzytoskeletts, so dass die Beteiligung von Cortactin an diesen Prozessen plausibel erscheint.

GFAP-L1 mice express the neural cell adhesion molecule L1 ectopically in astrocytes. A semiquantitative analysis of gene expression in the hippocampus of these transgenic mice revealed a significantly lower expression of the protein cortactin when compared to wild type mice. Cortactin is associated with actin filaments and involved in processes which require reorganization of the actin cytoskeleton. To investigate the potential physiologic interactions between L1 and cortactin, the localization of these proteins was analyzed in primary cultures of hippocampal neurons and tissue sections of the hippocampus of 5-day-old and adult mice. In primary cultures of hippocampal neurons, cortactin and L1 colocalize along neurites, and cortactin is enriched in growth cones. When looking at cortactin expression in hippocampus, developmental changes could be observed: in adult animals, apart from the localization in dendrites, localization could be shown in the stratum lucidum of the CA3 field, an axon-rich layer, while no expression of cortactin was seen in the respective layer of 5 day old mice. Possibly, cortactin mediates different functions in axons and dendrites of the hippocampus, which might be regulated by L1. Previous studies had shown that extracellular stimuli can trigger a redistribution of cortactin to the cell periphery. For this reason, within the scope of this thesis, it was investigated whether stimulation by L1 antibodies leads to a similar redistribution. As expected, antibody triggering caused L1 endocytosis. However, neither a redistribution of cortactin to the cell cortex nor a colocalization of cortactin with endocytosed L1 could be observed. Moreover, due to the colocalization of L1 and cortactin in hippocampal neurons, a direct interaction of the two proteins was hypothesized. In order to investigate this point, L1 was immunoprecipitated from detergent-soluble membrane fractions of brain homogenate of 6-day-old mice. No coprecipitation of cortactin could be observed under these conditions. In a previous study, it had been demonstrated that the interaction of cortactin with the adhesion molecule ICAM required ICAM stimulation. Therefore, in this thesis, N2A cells were stimulated with L1 antibodies, and cell lysates were submitted to L1 immunoprecipitation. Even in this case, cortactin could not be detected in the precipitate. A participation of cortactin in L1-mediated processes does not require a direct interaction of the two proteins. Cortactin might also interact with components of the L1-stimulated intracellular signalling cascade. Promotion of both neurite outgrowth and neuritogenesis are among the best-established biological functions of L1. Thus, in order to elucidate the function of cortactin in L1-mediated biological processes, neurite outgrowth and neuritogenesis were analyzed in hippocampal neurons overexpressing wild-type and mutated cortactin. The data acquired in this thesis point at an influence of cortactin on L1-mediated neurite outgrowth. Furthermore, the effects of NCAM on neurite outgrowth and neuritogenesis might be influenced by cortactin. This thesis does not provide an indication of a direct interaction between L1 and cortactin. However, based on the results of the functional experiments, a participation of cortactin in L1-mediated and NCAM-mediated neurite outgrowth and neuritogenesis seems possible. Both neurite formation and neurite growth require a reorganization of the actin cytoskeleton: thus, an involvement of cortactin in these processes would be in line with its established biological functions.