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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-25201
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2520/


Veränderung des Glykolipidmusters in Thylakoiden von Pflanzen und Blaualgen durch heterologe Expression bakterieller Glykosyltransferasen

Hölzl, Georg

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SWD-Schlagwörter: Glycosyltransferasen , Galactolipide , Thylakoid , Thylakoidmembran , Photosynthese , Chloroplast , Agrobacterium tumefaciens , Galactosyltransferase
Freie Schlagwörter (Deutsch): Monogalacosyldiacylglycerol , Digalactosyldiacylglycerol , Glucosylgalactosyldiacylglycerol , Monoglucosyldiacylglycerol , Diglucosyldiacylglycerol
Basisklassifikation: 42.41 , 42.13 , 42.43
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heinz, Ernst (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.04.2005
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 29.06.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Galaktolipide sind wichtige Membranbestandteile der Thylakoide von Pflanzen und Blaualgen, bei denen sie bis zu 80 % des Gesamtlipidgehalts dieser Membranen ausmachen. Diese Glykolipide sind Strukturelemente der Lipidmatrix für die Einbettung von Proteinen, sie sind am Proteinimport in die Organelle beteiligt, sie tragen zur Faltung und Stabilisierung von Proteinen bei, und sie spielen durch ihre Assoziation mit mehreren Proteinkomplexen der Thylakoidmembran eine Rolle bei der Photosynthese. Die Lipidzusammensetzung der Thylakoidmembranen ist bei Pflanzen und Blaualgen in hohem Maße konserviert, wobei Glykolipide mit alternativen Kopfgruppen ausgeschlossen sind. Dies deutet darauf hin, dass Galaktolipide spezifische Funktionen erfüllen, die mit der besonderen Konfiguration ihrer Kopfgruppen verbunden sind.
Zur Aufdeckung der Funktionen von Galaktolipiden standen bisher Mutanten von Genen der Galaktolipid-Biosynthese zur Verfügung, die durch eine starke Reduktion des Anteils des jeweiligen Galaktolipids gekennzeichnet sind. Die weitgehende Entfernung einer Lipidklasse lässt aber kaum Rückschlüsse auf die spezifischen Funktionen dieser Lipide zu, da die Deletion einer wichtigen Matrixkomponente Auswirkungen implizieren kann, die spezifische Funktionen nicht mehr erkennen lassen.
Ein alternativer Ansatz zielt auf einen Austausch der nativen Galaktolipide durch Glykolipide, die anomere und/oder epimere Kopfgruppen tragen oder im Falle von Diglykosyldiacylglycerolen durch eine andere Verknüpfung der Zuckerreste gekennzeichnet sind. Die Untersuchungen derartiger Mutanten können dann Rückschlüsse auf mögliche spezifische Funktionen von Galaktolipiden erlauben.
Die Realisierung dieses alternativen Ansatzes war Ziel der vorliegenden Arbeit. Dazu sollten auf genetischem Wege die nativen Enzyme der Galaktolipid-Biosynthese in geeigneten Organismen inaktiviert und durch Expression heterologer Glykosyltransferasen aus anderen Quellen ersetzt werden. Letzteres setzte dabei eine Identifizierung und Charakterisierung möglichst vieler neuer Glykosyltransferasen voraus.
Zu Beginn der Arbeit standen zunächst drei bakterielle Glykosyltransferasen zur Verfügung. Über Datenbanksuchläufe wurden weitere 20 Sequenzen von putativen Glykosyltransferasen aus verschiedenen Glykosyltransferase-Familien (GT4, GT21, GT28) identifiziert. Zusätzlich wurde ein für die Expression in Pflanzen optimiertes, künstliches Gen erzeugt, das durch vollständige Umstellung der Codon-Nutzung aus der bakteriellen ß-Glukosyltransferase von S. aureus erhalten wurde. Durch Expression von 19 ORFs von putativen Glykosyltransferasen und des künstlichen Gens in den Expressionswirten E. coli, P. pastoris und S. cerevisiae konnten 6 neue Glykosyltransferasen über detaillierte Lipidanalysen und Enzymtests beschrieben werden. Diese Annotation der Enzymfunktionen führte zur Charakterisierung folgender neuer Glykosyltransferasen: je eine Gcs aus A. tumefaciens und M. loti, die beide durch eine breite Substrat-Spezifität bezüglich Zucker-Donator und -Akzeptor sowie durch ihre Prozessivität gekennzeichnet sind. Weiterhin wurden zwei Enzyme aus D. radiodurans und T. maritima als aGlcD-Synthasen charakterisiert. Zwei weitere Enzyme aus C. aurantiacus wurden als ßGalD-Synthase und als Diglykosyldiacylglycerol-synthetisierende ß-Glukosyltransferase annotiert.
Die ORFs der auf diese Weise charakterisierten sowie die meisten putativen Glykosyltransferasen wurden für die Transformation von Blaualgen und Pflanzen eingesetzt. Da die Versuche bei P. patens nicht zum gewünschten Erfolg führten, konzentrierten sich die nachfolgenden Arbeiten auf die Synthese neuer Glykolipide in Synechococcus und A. thaliana. Dabei ist es zum ersten Mal gelungen, die Galaktolipide in Blaualgen und Chloroplasten gezielt durch andere Glykolipide zu ersetzen.
In Synechococcus führte die Expression von drei aGlcD-Synthasen aus D. radiodurans, T. maritima und A. laidlawii jeweils zur Bildung von aGlcD und aGalD sowie zur Reduktion von ßGalD. Die cyanobakterielle Expression der ß-Glukosyltransferase aus C. aurantiacus resultierte in der Synthese von ßGlcßGalD bei gleichzeitiger Reduktion des nativen aGalßGalD.
In A. thaliana führte nur die Expression der ß-Glukosyltransferase aus C. aurantiacus in Form eines Fusionsproteins mit einem N-terminalen Chloroplasten-Leaderpeptid zu einem veränderten Glykolipidmuster der Chloroplasten. Die Akkumulation des neuen ßGlcßGalD ging einher mit der Reduktion des nativen aGalßGalD. Außerdem ist es gelungen, den Phänotyp der dgd1-Zwergmutante von A. thaliana durch die Expression dieser ß-Glukosyltransferase weitgehend zu komplementieren und eine Wildtyp-ähnliche Pflanzengröße wiederherzustellen.
Die erfolgreiche Darstellung verschiedener Glykolipid-Mutanten von Synechococcus und A. thaliana ist ein erster Schritt für Untersuchungen zur Erkennung spezifischer Funktionen von Galaktolipiden in Thylakoiden.

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