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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-25281
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2528/


Synthese neuartiger Uridinphospho-N-acetylglycosaminyl-Derivate als Strukturanaloga biogener Transferase-Donoren

Lazarevich, Daniel

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Basisklassifikation: 35.51
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Thiem, Joachim (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.07.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 29.06.2005
Kurzfassung auf Deutsch: N-Acetylgalactosaminyl-Transferasen sind unter Verwendung ihres biogenen Leloir-Glykosylierungs-Donors UDP-N-Acetamidogalactose (UDP-GalNAc) am sequentiellen Aufbau von Glykokonjugaten, darunter Sphingolipiden und Gangliosiden beteiligt. Letztere regulieren den essentiellen Lipidstoffwechsel menschlicher Nervenzellen und zahlreiche lysosomale Glykosphingolipid-Speicherkrankheiten, die sich auf eine Defizienz beim Abbau vereinzelter Ganglioside zurückführen lassen, sind bekannt, sowie die daran beteiligten Hydrolasen, die mittlerweise gut charakterisiert sind. Demgegenüber sind die am Gangliosid-Aufbau beteiligten membrangebundenen GalNAc-Transferasen strukturell weniger gut untersucht da sie sich bewährten Methoden wie der Röntgenkristallographie bislang entziehen und alternative Untersuchungsmethoden auf der Grundlage von Enzym-Substrat-Wechselwirkungs-Studien und Affinitätsmarkierungen erfordern. Die Darstellung neuer, zu diesem Zweck verwendbarer Struktur-Analoga des UDP-GalNAc sind in dieser Arbeit beschrieben.

Im ersten Teil wurden ausgehend von Benzylether-geschützten Glycalen die beiden -Phosphate des Glucosamin- und des Galactosamins unter Einführung der verkappten Aminogruppe in Form des Azids und nach Anwendung des Phosphoramidit-Verfahrens synthetisiert. Diese erwiesen sich als hervorragend funktionalisierbare Bausteine und erlaubten im ungeschütztem Zustand durch Reaktion mit entsprechenden Estern des N-Hydroxysuccinimids die Herstellung von N-Acylamidohexopyranosylphosphaten. Unter Anwendung dieser selektiven Acylierungs-Methodik gelang in Ausbeuten um 80 bis 90 % die Herstellung der entsprechenden N-Propionylamido-, N-Butyramido und N-Isobutyramido-hexopyranosylphosphate sowohl in der gluco- als auch in der galacto-Reihe sowie zusätzlich die des N-Acetamido- und N-Bromacetamidohexopyranosylphosphate in der galacto-Reihe. Diese Methode wurde auf andere Ester mittlerer Reaktivität übertragen und führte so neben N-Formamidoglykopyranosylphosphaten beider Konfigurationen ferner zu den N-(2-Azidoacet)amido- und N-Trifluoracetamido-galactopyranosylphosphaten unter Zuhilfenahme von halogeniertem Phenylformiat, 2-Bromacetylbromid und Ethyltrifluoracetat als hochselektive N-Acylierungs-reagenzien, wobei in in letzterem Falle ein effizienter Syntheseweg über Oxazoline als stereochemisch kontrollierbare Phosphorylierungs-donoren erarbeitet wurde.

Der in dieser Arbeit erstmals an Aminoglykopyranosylphosphaten ausgeführte Diazotransfer zu Azidophosphaten in über 60 % Ausbeute erwies sich an beiden Schlüssel-Bausteinen als gangbar und eröffnet neben der Synthese zweier Diazirin-modifizierter Struktur-Analoga des N-Acetylgalactosamin den Zugang zu Enzymsubstrat-Analoga für Photoaffinitätsmarkierungsexperimente.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden sämtliche höher funktionalisierten Glykopyranosylphosphate unter Anwendung des Phosphomorpholidat-Kupplungs-verfahrens zu den entsprechenden UDP-GlcNAc- und UDP-GalNAc -Strukturanaloga in Ausbeuten zwischen 25 % und 35 % umgesetzt. Die allen synthetisierten Phosphaten zugrundeliegenden Aminophosphat-Bausteine hingegen erwiesen sich gegenüber der Morpholidat-Kupplungsmethode als inkompatibel.
Versuche zur Herstellung des nach der Morpholidat-Methode nicht synthetisierbaren UDP-Galactosamins erlaubten schließlich die Optimierung des Transferase-enzymatischen Synthesewegs, womit allerdings nur 12 % Ausbeute erzielt werden konnten. Darüberhinaus konnte die Verbindung sowohl aus einem Azido-UDP-Galactose-Derivat als auch über das N-trifluoracetylierte UDP-Galactosamin in guten bis sehr guten Ausbeuten erhalten werden. UDP-Galactosamin erwies sich jedoch als nicht vergleichbar funktionalisierbar wie die Aminophosphat-Bausteine, die ihrer Rolle als Schlüssel-Intermediate zu höher funktionalisierten Hexopyranosyl-phosphaten und weiterführend zu den entsprechenden UDP-Hexosen gerecht wurden.

Im dritten und letzten Teil dieser Arbeit wurde in der Reihe der Photoaffinitäts-Enzymsubstrat-Analoga neben den zuckerseitig Azid- und Diazirin-modifizierten UDP-Hexosaminen ein enzymatisch oder zu Kupplungszwecken verwendbares photosensitives 5’-Azido-UTP-Derivat erreicht. Ausgehend von UMP wurde in einem 11-stufigem Syntheseweg durch Nitrierung, Diazotierung und anschließender Substitution das Azid hergestellt.
Kurzfassung auf Englisch: By use of their naturally occuring Leloir glycosylation donor substrate UDP-N-acetamido galactose (UDP-GalNAc) N-acetylgalactosamine transferases take part in the stepwise glycosylation towards glycoconjugates. Among these are sphingolipids and gangliosides, which regulate the essential lipid metabolism in human nervous system cells. Many glycosphingolipid storage diseases, based on the deficient degradation of specific gangliosides are known, including the many well characterized hydrolases taking part in this process. Their counter parts, the ganglioside generating membrane bound transferases are so far less well investigated since they are rarely applicable to common methods like x-ray crystallography and therefore require alternative investigative techniques based on enzyme-substrate interaction studies and affinity labelling. New structure analogues of UDP-GalNAc which can be employed for this purpose are described within this work.

In the first part of this work the syntheses of the -Phosphates of glucosamine and galactosamine (18 and 23) starting from benzyl protected glycals are described. By introduction of the amino group via an azide and subsequent use of the phosphoramidite method those phosphates were obtained. They proved to be versatile building blocks for further derivatisation in their their unprotected state and could be reacted to N-acylamidohexosyl phosphates with apropriate ester compounds derived from N-hydroxysuccinimide. By use of this selective acylating method the preparation of the corresponding N-propionylamido-, N-butyramido und N-isobutyramido-hexosylphosphates in both the gluco and galacto series and additionally N-acetamido- und N-bromoacetamido-hexosylphosphates in the galacto series were achieved in yields ranging from 80 to 90 %. This method was applied to other esters with moderate reactivity and led next to N-formamidoglycosyl phosphates for both configuration to the formation of N-(2-azidoacet)amido- and N-trifluoro-acetamidogalactosyl phosphates via the halogenated phenylformiate, 2-bromoacetylbromide and ethyl trifluoroacetate as highly selective acylating reagents.
In the latter case an efficient synthetic pathway via oxazolines as stereochemically controlable phosphorylating donors was additionally established.

With both amino phosphate key intermediates an azido transfer reaction was succesfully applied for the first time within this work in yields exceeding 60 %. Further the synthesis of two structural analogues of N-acetylgalactosamine displaying a diazirine moiety was established. Thus, a the pathway towards enzyme substrate analogues for photoaffinity labelling studies was opened.

In the second part of this work all of the derivatized glycosyl phosphates were converted to the corresponding UDP-GlcNAc and UDP-GalNAc structural analogues in yields ranging from 25 % to 35 % utilizing the phosphomorpholidate coupling procedure. Both the amino phosphate building blocks from which all other synthesized phosphates were derived proved to be incompatible towards the morpholidate coupling method.
Attempts to synthesize UDP-galactosamine which failed to react under morpholidate coupling conditions finally led to an improved enzymatic pathway with 12 % yield employing a transferase. Further the desired compound could be obtained in good to excellent yield either via an azido-UDP-galactose derivative or via a
N-trifluoroacetylated UDP-galactosamine upon deprotection. UDP-galactosamine, on the other hand, proved not to be a versatile component for various conversions in contrast to the amino phosphate building blocks. This justifies their role as key intermediates enroute to higher functionalized hexosyl phosphates and further towards their corresponding UDP-hexoses.

In the third and final part of this work in the series of enzyme substrate analogues for photoaffinity labelling in addition to the UDP-hexosamines displaying a sugarside azido or diazirine moiety a photosensitive 5’-azido-UTP compound was synthesized starting from UMP by ways of nitration, diazotation and subsequent azide substitution. This compound could be further potentially processed enzymatically or by a coupling method.

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