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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-25572
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2557/


Identifizierung und Charakterisierung unbekannter Bindeproteine des GABAA-Rezeptors von Rattus norvegicus (Berkenhout, 1769)

Identification and characterization of unknown binding proteins of the GABAA-receptor of rattus norvegicus (Berkenhout, 1769)

Löbrich, Sven

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SWD-Schlagwörter: GABAA-Rezeptor , Synapse , Zellskelett , Guanosintriphosphatasen
Freie Schlagwörter (Deutsch): ERM , Radixin , Muskelin , Clustering , extrasynaptisch
Freie Schlagwörter (Englisch): Clustering , Muskelin , Radixin , ERM proteins , extrasynaptic
Basisklassifikation: 42.15 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Pongs, Olaf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.07.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 25.07.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten bislang unbekannte Interaktionspartner des GABAA-Rezeptors identifiziert werden. Die gefundenen Interaktionen sollten molekularbiologisch charakterisiert und soweit möglich funktionell analysiert werden.

Im Gehirn der Säugetiere wird die schnelle synaptische Inhibition durch den Neurotransmitter GABA vermittelt. In der postsynaptischen Membran sind ligandengesteuerte Ionenkanäle lokalisiert, die GABA binden und die Permeabilität der Membran für Chloridionen erhöhen. Diese GABAA-Rezeptoren sind pentamere Assemblierungen aus zwei alpha-, zwei beta- und einer gamma-Untereinheit. Durch die Existenz von verschiedenen Isoformen ergibt sich eine Vielzahl an Kombinationsmöglichkeiten für das Pentamer, von denen ein überschaubarer Teil beschrieben wurde. Es hat sich gezeigt, dass eine unterschiedliche Zusammensetzung zu unterschiedlichen pharmakologischen Eigenschaften des Rezeptors führen kann. Außerdem zeichnet sich ab, dass einigen speziellen Untereinheiten bestimmte Aufgaben in der Lokalisation und Funktion des Rezeptors zukommen.

Das Gerüstprotein Gephyrin ist ein wesentlicher Bestandteil inhibitorischer Synapsen. Es wird sowohl im Rückenmark an glyzinergen, als auch im Gehirn an GABAergen Synapsen gefunden. Gephyrin verbrückt den Glyzin-Rezeptor mit dem Zytoskelett und bildet durch seine Fähigkeit, an sich selbst zu binden, ein hexagonales Gitter aus, um den Rezeptor zu ballen. Die Inaktivierung von Gephyrin führt zum kompletten Verlust der Glyzin-Rezeptor-„Cluster”.
GABAA-Rezeptoren sind in ihrem Ballungsverhalten beim Verlust von Gephyrin in Abhängigkeit von ihrer Zusammensetzung beeinträchtigt. Während die punktförmige Immunreaktivität für Rezeptoren, die die gamma2-Untereinheit tragen, fast vollständig verschwindet, zeigen alpha1- und alpha5-enthaltende Rezeptoren ein vollkommen unbeeinträchtigtes Ballungsverhalten.
In dieser Arbeit wurde mit Hilfe der Hefe-2-Hybrid-Technik systematisch nach Interaktionspartnern für die großen intrazellulären Schleifen der alpha1- und alpha5-Untereinheit gesucht.

Das „Screening“-Verfahren identifizierte das Protein Muskelin als Interaktionspartner für die alpha1-Untereinheit. Es konnte gezeigt werden, dass Muskelin in vitro an die zytoplasmatische Schleife des Rezeptors bindet. Die Bindestelle wurde auf wenige Aminosäuren eingegrenzt. Ferner wurde beobachtet, dass Muskelin teilweise an Synapsen lokalisiert und mit GABAAR-alpha1 in Neuronen kolokalisiert.

Die Suche nach Interaktoren für die alpha5-Untereinheit identifizierte Radixin als Bindeprotein. Auch hier wurde die Bindestelle auf der Rezeptorschleife eingegrenzt. Die physiologische Relevanz der Interaktion wurde durch Koimmunpräzipitation von Radixin mit GABAAR-alpha5 aus Rattengehirn bestätigt. Verschiedene Ansätze zur Störung der gefundenen Wechselwirkung identifizierten Radixin als den ersten direkt bindenden Ballungsfaktor für GABAA-Rezeptoren. Durch Mutationsstudien konnte gezeigt werden, dass die Bindung an den Rezeptor reguliert ist und dass die synaptische Lokalisation des Radixins von dem Zustand seiner Aktivierung abhängt. Schließlich wurde gezeigt, dass Manipulation der Radixin-Aktivierung durch die Expression konstitutiv-aktiver, beziehungsweise dominant-negativer Vertreter der Rho-Familie GTPasen zu einer Verschiebung sowohl des Radixins, als auch des alpha5-enthaltenden Rezeptors an die Synapse führt.

Die Ergebnisse dieser Arbeit führen zu einer Erweiterung des Verständnisses von synaptischer Plastizität und deuten auf ein Modell hin, in dem der hier erstmals gefundende „Clustering“-Faktor Radixin eine zentrale Rolle spielt.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this study was to identify new interaction partners of the GABAA-receptor. The identified interactions should be characterized and analyzed functionally.

The fast synaptic inhibition in the mammalian brain is mediated mainly through the neurotransmitter GABA. Neurotransmitter receptors localize in the postsynaptic membrane to bind GABA and as a consequence increase the membrane permeability for chloride ions. GABAA receptors are pentameric protein complexes that assemble from different subunits many of which are expressed very heterogeneously in space and time in the brain.

The soluble scaffold protein gephyrin is an essential component of inhibitory postsynaptic compartments. It localizes to glycinergic synapses in the spinal cord and many GABAergic synapses in the brain. By self-association gephyrin can form a hexagonal lattice and it also binds to the glycine receptor with high affinity, thereby clustering and concentrating the receptor at inhibitory synapses. Gephyrin inactivation leads to a complete loss of glycine receptor clusters.

GABAA receptors appear to be influenced in their clustering by gephyrin in dependence of their subunit composition. While the punctate immunofluorescence of receptors carrying a gamma 2 subunit is completely lost, those harboring an alpha1 or alpha5 subunit display unaltered clustering.

In this study I searched for interaction partners of the large intracellular loops of the alpha1 and alpha5 subunits employing the yeast-2-hybrid system.

The screening procedure identified the protein muskelin as an interaction partner for the alpha 1 subunit. It was demonstrated that muskelin binds to the alpha 1 loop in vitro. The binding site was narrowed down to a few amino acids on the loop. Furthermore, synaptic localization of muskelin and colocalization with alpha1 containing GABAA receptors in neurons was observed.

The screening for interaction partners of the alpha5 subunit identified radixin as a binding protein. Radixin belongs to the ERM family of proteins, whose association with the actin cytoskeleton and the plasma membrane is regulated by phosphorylation. The binding site for radixin was narrowed down on the receptor loop. A physiological relevance of the interaction could be confirmed by co-immunoprecipitation of radixin together with the alpha5 subunit from rat brain lysate. Different experiments to disturb the interaction showed that radixin represents the first directly binding clustering factor for GABAA receptors.

Through mutational analysis I could demonstrate that receptor binding is regulated in radixin and that its cellular and synaptic distribution depends on its activation state. Finally, it was demonstrated that the manipulation of radixin activation by expression of dominant-negative or constitutively active RhoGTPase mutants leads to a shift of both radixin and the alpha5 containing GABAA receptors into the synapse.

The results of this study extend our present understanding of synaptic plasticity and point to a model in which the newly identified clustering factor radixin plays an important role.

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