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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-25720
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2572/


Sequenzanalyse der L-RNA von Lassavirus und Aufbau moderner Nachweissysteme für hochpathogene Arenaviren

Sequence analysis of L RNA of Lassa virus and establishment of conventional and modern PCR assays for detection of pathogenic arenaviruses

Vieth, Simon

Originalveröffentlichung: (2004) Establishment of conventional and fluorescence resonance energy transfer-based real-time PCR assays for detection of pathogenic New World arenaviruses. J Clin Virol. 2005 Mar;32(3):229-35; Sequence analysis of L RNA of Lassa virus. Virology. 2004 Jan 5;318(1):153-68.
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Freie Schlagwörter (Deutsch): Lassa-Fieber , RNS-abhängige-RNS-Polymerasen , Arenaviren , Phylogenie , Sekundärstrukturvorhersage
Freie Schlagwörter (Englisch): Lassa virus , Arenavirus , Phylogeny , Secondary structure prediction , RNA-dependent RNA polymerase
Basisklassifikation: 30.03 , 42.32 , 44.43
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Günther, Stephan (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.06.2005
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 15.08.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Lassavirus ist ein bisegmentiertes RNA-Virus aus der Familie der Arenaviren. Es ist der Erreger eines in Westafrika endemischen, hämorrhagischen Fiebers: des Lassa Fiebers. Das 7000 Nukleotide-lange L-RNA Segment von Lassavirus ist genetisch kaum charakterisiert. Zu Beginn der Arbeit existierte lediglich die L-RNA Sequenz eines einzigen Lassavirusstammes. Auf dem L RNA–Segment liegt das L-Gen. Es kodiert für das L-Protein, welches RNA-abhängige RNA-Polymeraseaktivität besitzt. Erstes Ziel der Arbeit war die Generierung zusätzlicher L-RNA-Sequenzdaten, auf deren Basis konservierte Domänen und Sequenzmotive identifiziert, Strukturmodelle etabliert und phylogenetische Analysen durchgeführt werden sollten. Zweites Ziel des Projektes war die Erhöhung der Nachweissicherheit von humanpathogenen Arenaviren durch Etablierung von schnellen und breit reagierenden PCR-Assays. Arenaviren sind hoch variabel und existierende PCR-Assays können nicht sicher alle Virusstämme nachweisen. Ein Lassavirus PCR-Assay sollte auf der Basis konservierter Sequenzen im L-Gen etabliert werden.
In dieser Arbeit wurde die L-RNA von drei Lassavirusstämmen aus drei unterschiedlichen Regio-nen Westafrikas sequenziert. Vier konservierte Domänen wurden identifiziert, wobei die Gesamt-variabilität hoch war (20% Aminosäuresequenzdifferenz). Mittels Datenbankanalyse konnte die vermutliche RNA-Polymerase in Domäne III identifiziert werden. Die vorhergesagte Sekundärstruktur dieser Domäne entsprach weitgehend der experimentell (Kristallstrukturanalyse) bestimmten Struktur anderer viraler RNA-abhängiger RNA-Polymerasen. Als wesentliche Differenz zu den bekannten Strukturen wurde eine zusätzliche alpha-helikale Subdomäne nahe dem katalytischen Zentrum der RNA-Polymerase vorhergesagt. Die Strukturhomologien erlaubten die Entwicklung eines hypothetischen Modells der dreidimensionalen Faltung der Polymerase-Domäne des Lassavi-rus. Eine phylogenetischen Rekonstruktion auf der Basis der L-RNA-Sequenzen lässt vermuten, dass weder Rekombination verschiedener Virusgene noch Reassortment der zwei RNA-Segmente in der Evolution von Lassavirus stattgefunden haben.
Zur Etablierung einer diagnostischen PCR für Lassavirus wurden hoch konservierte Nukleotidse-quenzen in der Polymerase-Domäne identifiziert. In diesen Bereichen wurden weitere Lassavirus-stämme sowie andere Altwelt-Arenaviren wie Mopeia, Ippy, und lymphozytäres Choriomeningitis Virus (LCMV) sequenziert, um so viel Sequenzinformation wie möglich für das Design der Primer zu erhalten. Auf der Basis dieser Sequenzen wurde eine Einschritt L-Gen RT-PCR mit Agarosegel-Detektion etabliert. Aufgrund des hohen Grades der Sequenzkonservierung an den Primerbindung-sorten ist die PCR in der Lage, neben Lassavirus alle anderen bekannten Altwelt-Arenaviren nach-zuweisen. Lassavirus bzw. LCMV-RNA wurde in den verschiedensten klinischen Materialien wie Serum, Liquor, Urin, Leber, Milz und Lunge nachgewiesen. Nach gründlicher Optimierung lag die 95%-Nachweisgrenze der L-Gen RT-PCR bei 4290 RNA Kopien/ml Serum. Dies entspricht 30 Kopien pro PCR Ansatz.
Kurzfassung auf Englisch: The L RNA of three Lassa virus strains originating from Nigeria, Ghana/Ivory Coast, and Sierra Leone was sequenced and the data subjected to structure predictions and phylogenetic analyses. The L gene products had 2218–2221 residues, diverged by 18% at the amino acid level, and contained several conserved regions. Only one region of 504 residues (positions 1043–1546) could be assigned a function, namely that of an RNA polymerase. Secondary structure predictions suggest that this domain is very similar to RNA-dependent RNA polymerases of known structure encoded by plus-strand RNA viruses, permitting a model to be built. Outside the polymerase region, there is little structural data, except for regions of strong alpha-helical content and probably a coiled-coil domain at the N terminus. No evidence for reassortment or recombination during Lassa virus evolution was found. The secondary structure-assisted alignment of the RNA polymerase region permitted a reliable reconstruction of the phylogeny of all negative-strand RNA viruses, indicating that Arenaviridae are most closely related to Nairoviruses. In conclusion, the data provide a basis for structural and functional characterization of the Lassa virus L protein and reveal new insights into the phylogeny of negative-strand RNA viruses.
This study describes an RT-PCR assay targeting the L RNA segment of arenaviruses. Conserved regions were identified in the polymerase domain of the L gene on the basis
of published sequences for Lassa virus, lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV), Pichinde virus, and Tacaribe virus, as well as 14 novel sequences for Lassa virus, LCMV, Ippy virus, Mobala virus, and Mopeia virus determined in this study. Using these regions as target sites, a PCR assay for detection of all known Old World arenaviruses was developed and optimized. The concentration that yields 95% positive results in a set of replicate tests (95%-detection limit) was determined to be 4290 copies of Lassa virus L RNA per ml serum, corresponding to 30 copies per reaction. The ability of the assay to detect various Old World arenaviruses was demonstrated with in vitro transcribed RNA, material from infected cell cultures, and samples from patients with Lassa fever and monkeys with LCMV-associated callitrichid hepatitis. The L gene PCR assay may be applicable: i) as a complementary diagnostic test for Lassa virus and LCMV; ii) to identify unknown Old World arenaviruses suspected as etiologic agents of disease; and iii) for screening of potential reservoir hosts for unknown Old World arenaviruses.
Five of the known arenaviruses cause viral hemorrhagic fever in humans and are classified as biosafety level 4 pathogens. Four of the viruses, namely Junin, Guanarito, Machupo, and Sabia, belong to clade B of New World arenaviruses that also comprises the nonpathogenic viruses Tacaribe, Cupixi, and Amapari. OBJECTIVES: To establish real-time reverse transcription (RT)-PCR assays for Junin and Guanarito virus based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes, and a universal RT-PCR assay for all known clade B viruses with conventional read-out. RESULTS: Conserved sequences in the nucleoprotein gene were chosen as target sites for primers and FRET probes. A common set of primers was designed for all three assays. The assays were based on one-step RT-PCR reagents and were optimised with respect to analytical sensitivity using synthetic RNA templates. The real-time PCR assays detected about 0.5 and 5TCID(50) of cell culture-derived Junin and Guanarito virus, respectively. The universal clade B PCR amplified cell culture-derived RNA of Junin, Guanarito, Machupo, and Sabia virus (5-500TCID(50) per reaction), as well as RNA of Tacaribe, Cupixi, and Amapari virus. CONCLUSIONS: The PCR assays may be used as complementary diagnostic tests for pathogenic New World arenaviruses. The universal PCR assay could also be suitable for the detection of novel clade B arenaviruses in patients as well as in animal reservoirs.

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