Untersuchungen zum Einfluss der Proteine NFI-A und LIS1 auf Expression und Funktion des Zellerkennungsmoleküls L1

Abstract

NFI-A gehört zur Familie der sequenzspezifischen Nuclear Factor I-Transkriptionsfaktoren und wird in der GFAP/L1-Maus, die das Zelladhäsionsmolekül L1 ektopisch auf Astrozyten exprimiert, verstärkt exprimiert. Mißbildungen der NFI-A knock-out-Maus, die sich vornehmlich im Gehirn ausprägen, weisen auf eine Regulation neuraler Gene durch NFI-A während der Entwicklung des Gehirns hin. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass im ersten Intron des murinen L1-Gens eine perfekte Erkennungssequenz für NFI-Proteine vorhanden ist. Die Bindung von zwei NFI-A-Isoformen an diese Sequenz konnte in vitro mit Hilfe einer Gelretentionsanalyse (EMSA) bestätigt werden. Weiterhin wurden die Spezifität der Bindung in einer Supershift–Analyse und eine hohe Bindungsaffinität von NFI-A an seine Erkennungssequenz im L1-Promotor durch Kompetitionsanalyse nachgewiesen. Mit Hilfe der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) konnte die Bindung des NFI-A-Proteins an den L1-Promotor in vivo bestätigt werden. Um Aussagen über die Effekte von NFI-A auf die L1-Genexpression treffen zu können, wurden Reportergenassays in N2A-Zellen durchgeführt. Hier konnte nach Transfektion mutierter NFI-A-Isoformen ein Anstieg der L1-Genexpression beobachtet werden. Im Gegensatz dazu hatte die Expression der nativen NFI-A-Isoformen keinen Einfluss auf die L1-Genexpression. Wahrscheinlich üben also beide NFI-A-Isoformen einen reprimierenden Effekt auf die Transkription von L1 aus. Neben der perfekten Erkennungssequenz der NFI-Proteine wurden in der regulatorischen Region des L1-Gens mehrere Bindungsstellen für einen weiteren spezifischen Transkriptionsfaktor, den Glucocorticoidrezeptor-Komplex (GR), gefunden. Da in einigen Arbeiten eine Wechselwirkung zwischen NFI-Proteinen und dem Glucocorticoidrezeptor-Komplex bei der Steuerung der Genexpression gezeigt werden konnte, wurden die Effekte von NFI-A auf die L1-Genexpression in Anwesenheit des Glucocorticoidrezeptor-Komplexes untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass NFI-A Proteine in der Lage sind, die durch den Glucocorticoidrezeptor-Komplex induzierte Aktivierung der L1-Genexpression zu unterdrücken.

Sowohl LIS1 als auch L1 sind im Rahmen der Gehirnentwicklung an der neuronalen Migration beteiligt. Da LIS1, wie auch NFI-A, in der GFAP/L1-Maus vermehrt exprimiert wird, wurde nach einem funktionalen Zusammenhang zwischen LIS1 und L1 bei der L1-vermittelten Migration gesucht. LIS1 kann seine migrationsfördernde Eigenschaft einerseits als Bestandteil eines Enzyms (PAFAH) und andererseits als Mirkrotubuli-assoziiertes Protein ausüben. Mit Hilfe des LIS1-Inhibitors mc-PAF, der die Funktion von LIS1 als Enzymbestandteil hemmt, wurde das Migrationsverhalten wildtypischer Kleinhirnneuronen auf einem L1-Substrat untersucht. Allerdings konnte in diesem Versuchsansatz kein Effekt des LIS1-Inhibitors auf die L1-stimulierte Migration beobachtet werden. Weitere Prozesse, in deren Verlauf LIS1 und L1 direkt oder indirekt interagieren können, sind das L1-vermittelte Neuritenwachstum sowie die L1-vermittelte Neuritogenese. Beide Prozesse beinhalten, wie auch die Migration, unter anderem Veränderungen des Zytoskeletts. Die Umordung der Zytoskelettelemente wird vermutlich durch extrazelluläre Stimuli ausgelöst und durch Membranrezeptoren in die Zelle weitergeleitet. Eine mögliche Wechselwirkung zwischen dem membranständigen Zellerkennungsmolekül L1 und dem mikrotubuli-assoziierten LIS1 bei solchen Prozessen wurde daher mit dominant negativen LIS1-Konstrukten, welche die Mikrotubuli-Assoziation von LIS1 unterbinden, untersucht. In Transfektionsexperimenten an hippocampalen Neuronen zeigte sich ein Einfluss der dominant negativen LIS1-Konstrukte auf die L1-vermittelte Neuritogenese, da nach Transfektion beider mutierter LIS1-Konstrukte in hippocampale Neuronen die Enstehung von Neuriten auf einem L1-Substrat signifikant verringert war. LIS1 ist also offenbar als intrazellulärer „Vermittler“ an der Stimulation der Neuritenentstehung durch L1 beteiligt.

NFI-A belongs to the nuclear factor I family of site-specific transcription factors and was upregulated in GFAP/L1-mice, which express L1 ectopically on astrocytes. Brain malformations arising from depletion of NFI-A implicate a regulation of neural genes by NFI-A during development. A perfect NFI binding sequence was found in the first intron of the mouse L1 gene. In electrophoretic motility shift assays (EMSA), binding of two NFI-A Isoforms to this perfect site could be shown in vitro. Furtermore, specificity of this binding reaction could be confirmed by supershift analysis, and a high binding affinity of NFI-A to its recognition site in the L1 promoter could be observed in a competition experiment. NFI-A binding to the L1 promoter in vivo was confirmed using chromatin immunoprecipitation analysis (ChIP). In order to investigate effects of NFI-A proteins on L1 expression, reporter gene assays were performed in N2A cells. An induction of L1 transcription could be observed after transfection of mutated NFI-A effector constructs. In contrast to that, overexpression of native NFI-A isoforms did not have an effect on L1 expression. In conclusion, this implicates a repressive effect of NFI-A on L1 transcription. Additionally, several binding sites for another site-specific transcription factor, the glucocorticoid receptor complex, could be found in the regulatory region of the L1 gene. As NFI-proteins and the glucocorticoid receptor complex are known to interact in the course of gene regulation, effects of NFI-A on L1 expression in the presence of the glucocorticoid receptor complex were investigated. It could be shown, that NFI-A proteins are able to suppress glucocorticoid-induced activation of L1 expression.

LIS1 and L1 are involved in neuronal migration during brain development. As LIS1, as well as NFI-A, was upregulated in GFAP/L1-mice, which ectopically express L1 on astrocytes, we investigated a functional interaction of LIS1 and L1 in the process of L1-induced migration. LIS1 is able to promote neuronal migration in two distinct manners: on the one hand, LIS1 is a microtubule-associated protein, on the other hand, LIS1 is a part of the trimeric enzyme comples PAF-AH. By using the LIS1-inhibitor mc-PAF, which is able to repress the enzymatic function of LIS1, migration of wild-type cerebellar neurons on an L1 substrate was investigated. An effect of the LIS1 inhibitor on L1-dependent migration could not be observed. Other processes, which could implicate a direct or indirect LIS1-L1 interaction, are neuritogenesis and axon growth, both of which can be mediated by L1. Like migration, these processes include modulations of the cytoskeleton. These changes in cytoskeletal architecture are probably triggered by extracellular cues and transduced into the cell by membrane receptors. A possible interaction of the membrane receptor L1 and the microtubule-associated LIS1 in the course of such processes was investigated by the use of two dominant negative LIS1 constructs, impairing the microtubule association of LIS1. In transfection experiments with hippocampal neurons, an influence of both mutated LIS1 constructs on L1-dependent neuritogenesis could be detected, as a significant loss of neurites could be observed after expression of mutated LIS1-constructs in hippocampal neurons cultivated on an L1 substrate. We thus conclude that LIS1 participates in L1-triggered neuritogenesis as an intracellular mediator.