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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-26138
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2005/2613/


Roles of Fibroblast Growth Factors During Induction and Morphogenesis of the Inner Ear of the Mouse (mus musculus, Linnaeus, 1758) and Chicken (Gallus gallus, Linnaeus, 1758)

Die Rolle der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren während der Induktion und der Morphogenese des Innenohrs der Maus (mus musculus, Linnaeus, 1758) und der Huhns (Gallus gallus, Linnaeus, 1758)

Zelarayán, Laura

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Basisklassifikation: 42.23
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hoffmeister-Ullerich, Sabine (PD Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.07.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 12.10.2005
Kurzfassung auf Englisch: SUMMARY

The vertebrate inner ear consists of two parts: the vestibular system responsible to sense balance and the auditory system that processes sound. Thus, alterations in the formation of this organ lead to problems in both audition and balance. The inner ear develops adjacent to the developing hindbrain from the placodal ectoderm, which invaginates to form the otic vesicle to subsequently undergo morphogenesis to reach the mature inner ear. Members of the Fibroblast Growth Factor (FGF) gene family have been shown to be widely implicated in otic formation in different species, but the molecular pathways acting to execute this developmental program are not completely understood. Several members of the FGF family, including FGF2, FGF3, FGF8, FGF10 and FGF15/19 are implicated during different stages of inner ear formation.

The aim of this study was to adressed the role of members of the FGF family such as FGF3, FGF2, FGF8 and FGF10 during otic development of mice and chicken. For this purpose, histological analysis, white paint injection into the inner ears, immunohistochemistry assays, RNA in situ hybridization, apoptosis studies and in ovo electroporation were carried out during this work.

Based on the conserved expression of Fgf3 in vertebrates in the hindbrain close to the developing otocyst, it has been proposed as an otic inducer. The function of this factor for inner ear induction has not been fully explored in mice. Therefore, Fgf3 null mutants in which all coding exons for Fgf3 had been deleted were analyzed in the present study. The vast majority of these mutants showed normal inner ear development. In contrast, Fgf3 null mutants in which the Fgf3-coding region was replaced by a neor cassette were often found to display a severe otic phenotype consisting in malformed semicircular canals, and defective cochlea and vestibule. The latter result suggests that the inner ear phenotype in Fgf3neo/neo mutants is possibly partially due to the presence of the neor gene rather than to the absence of the Fgf3-coding region.

Since Fgf10 expression coincides partially with Fgf3 expression in the hindbrain and developing otocyst, double homozygous and homoheterozygous mutants for Fgf3 and Fgf10 were analyzed. The severe lack of otic tissue observed in Fgf3-/-Fgf10-/- mice demonstrated that both FGF10 and FGF3 play essential roles in a redundant manner to reinforce and to maintain otic induction, as well as to pattern the otocyst. Moreover, the analysis of Fgf3-/-Fgf10+/- mutants showed the importance of both FGFs for the correct formation of the otocyst.

Fgf8 has been shown to be expressed in mesoderm and endoderm close to the future otic vesicle and within the developing otocyst. Since Fgf8 null mutant mice die prior to otic development due to severe gastrulation defects, animals with a specific inactivation of Fgf8 in the otic placode and vesicle were analyzed in the present research project. The analysis of the mutants did not show major defects in the developing otocyst but only a slight reduction of inner ear innervation. However, Fgf3+8 double mutants showed several defects in otic morphogenesis from day 11 of gestation (E11) onwards. Expression of Fgf8 in wild-type mice was detected at E12.5 in the vestibular system which coincided partially with the expression of Fgf3. Therefore, this study proposes that FGF3 and FGF8 work redundantly to direct proper otic morphogenesis.

Additionally, loss- and gain-of-function approaches were carried out in chicken embryos in order to define the role of FGFs in otic induction and morphogenesis in this species. In ovo electroporation was performed to transiently overexpress Fgf3, Fgf8 and Fgf10 during early stages of otic induction. The overexpression of Fgf3 and Fgf10 in the neural tube resulted in ectopic otic structures. Their otic nature was confirmed by RNA in situ hybridization with otic markers and histological analysis. The otic vesicles obtained by Fgf8 electroporation were smaller suggesting that FGF8 has a negative influence on otic vesicle formation. Furthermore, functional knockdown of FGF3 by electroporation of morpholino oligonucleotides directed against Fgf3 and Fgf3siRNA lead to a failure to form the otic vesicle from the otic placode thus indicating the participation of FGF3 during crucial step of otic morphogenesis in chicken.

This study demonstrates the importance of FGF signalling during inner ear development and the mechanisms through which they can compensate for each other to finally ensure the success of inner ear organogenesis in birds and mammals.
Kurzfassung auf Deutsch: Zusammenfassung

Das Innenohr der Vertebraten besteht aus zwei Teilen: dem vestibulären System, verantwortlich für das Gleichgewicht und dem auditorischen System, welches die Schallwellen in neuronale Information umwandelt. Das Innenohr entwickelt sich in räumlicher Nähe zum embryonalen Hinterhirn aus der Ektodermplakode, die sich, um das Ohrbläschen zu formen, einstülpt. Aus diesem bildet sich nach durchlaufener Morphogenese das reife Innenohr. Es wurde gezeigt, das Mitglieder der Fibroblasten Wachstumsfaktoren Genfamilie (FGF),wie FGF2, FGF3, FGF8, FGF10, FGF15/19 im Zusammenhang mit der Innenohrbildung in unterschiedlichen Spezies stehen, jedoch sind die molekularen Signalwege, die in dem Entwicklungsprogramm des Innenohr relevant sind, nicht vollständig verstanden.

Das Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Rolle der FGF-Familienmitglieder FGF2, FGF3, FGF8 und FGF10 während der Innenohrentwicklung in Maus und Huhn. Für die nähere Untersuchung wurden histologische Analysen, Farbinjektionen in das Innenohr, immunhistochemische Analysen, RNA- in situ Hybridisierung, apoptotische Untersuchungen, so wie in ovo Elektroporation durchgeführt.

Es wurde bereits Fgf3 -basierend auf der konservierten Expression im Hinterhirn der Vertebraten in räumlicher Nähe zum otischen Vesikel- als otischer Induktor vorgeschlagen. Die Funktion dieses Faktors für die Innenohrinduktion in Mäusen ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt worden. Aufgrund dessen wurden Fgf3 Mutanten mit Komplettdeletion der codierenden Exons analysiert.
Der überwiegende Teil dieser Mutanten zeigte eine normale Innenohrentwicklung. Im Gegensatz dazu, wiesen Mutanten, in denen die Fgf3 codierende Region durch eine neor Kassette ausgetauscht wurde, oft ein schweren otischen Phänotyp, bestehend aus missgebildeten semizirkulären Kanälen, defekter Cochlea sowie fehlerhaftem Vestibulum, auf. Der erhaltene Fgf3 Phänotyp ist eher auf die Anwesenheit der neor Genes als auf die Abwesenheit der Fgf3 codierenden Region zurückzuführen.

Aufgrund der sich teilweise überschneidenden Expressionen von Fgf10 und Fgf3 während der Entwicklung des Hinterhirns und des Innenohrs wurden Mäuse, die sowohl für Fgf3 als auch für Fgf10 defizient waren analysiert. Das Fehlen von otischem Gewebe in diesen Mutanten zeigt eine essentielle und redundante Rolle von FGF10 und FGF3 für die otische Induktion und die Struktur des Innenohrs. Darüber hinaus zeigt die korrekte Formation des Innenohrvesikels bei Fgf3-/-Fgf10+/- - Mäusen die Bedeutung beider Faktoren.

Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Fgf8 im Mesoderm und im Endoderm in räumlicher Nähe zum sich bildenden otischen Vesikels, wie auch im otischen Vesikel exprimiert wird. Fgf8 defizienten Mäuse sterben aufgrund eines Gastrulationsdefektes vor der Bildung des otischen Vesikels. Aus diesem Grund wurden Tiere mit einer spezifischen Inaktivierung des Fgf8 Genes in der otischen Plakode und Vesikels analysiert. Die Analyse der Mutanten zeigten keine offensichtlichen Defekte im sich entwickelden otischen Vesikel, jedoch eine leichte Reduktion der Innervation des Innenohrs. Anschließende Untersuchungen von Fgf3 und Fgf8 defizienten Mutanten zeigten jedoch mehrer Entwicklungsdefekte im der Morphogenese des Innenohrs ab 11Tage alten Embryonen.
Expressionsanalysen in Wildtyp-Mäusen zeigten eine teilweise Überlappung von Fgf8 und Fgf3 Expression im vestibulären System in 12.5Tage alten Embryonen. Diese Studien legen die redundante Funktion von Fgf8 und Fgf3 in der otischen Morphogenese nahe.

Zusätzliche „loss- and gain-of-function“ Untersuchungen in Hühnerembryonen wurden durchgeführt, um die Rolle der FGFs für die Induktion und Morphogenese des Innenohrs in diesen Spezies aufzuklären. Hierzu wurden In ovo Elektroporation zur transienten Überexpression von Fgf3, Fgf8 und Fgf10 während früher Entwicklungstadien der Innenohrinduktion durchgeführt. Die Überexpression von Fgf3 und Fgf10 im Neuralrohr resultieren in ektopischen ostischen Strukturen. Die otische Natur dieser Strukturen wurde durch RNA in situ Hybridisierung mit otischen Marker-Proteinen und histologischen Analysen bestätigt. Die otischen Vesikel, die sich durch die Elektroporation von Fgf8 cDNA bildeten waren kleiner, was darauf zurückführen ist, dass FGF8 einen negativen Einfluss auf die Bildung dieser hat. Funktionelle „knockdown“ Experimente durch Elektroporation von Morpholino-Oligonukleotide, gerichtet gegen Fgf3 und Fgf3siRNA, unterbanden die Umwandlung der otischen Plakode in das otische Vesikel, was darauf hinweist, dass FGF3 essentiell für die Morphogenese des Innenohrs im Huhn ist.

Diese Studie demonstriert die Bedeutung des FGF-Signalweges während der Innenohrentwicklung und der kompensatorische Mechanismus der FGFs der schließlich zur Innenohr Organogenese in Vögel und Säugetieren führt.

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