Prozessierung des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors LKLF im Verlauf der Aktivierung von T-Zellen

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, den aktivierungsinduzierten Abbauweg des Transkriptionsfaktors LKLF in lebenden Zellen näher zu charakterisieren, sowie mittels einer modernen Immunisierungsmethode Antikörper gegen humanes LKLF-Protein herzustellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen starke Hinweise dafür, dass LKLF in lebenden Zellen einem proteasomenabhängigen Abbau unterliegt. Proteinmodifikationen wie Ubiquitinylierung und Phosphorylierung scheinen hierbei den Umsatz des Proteins zu modifizieren. Eine Hemmung des Proteasoms von Zellkulturzellen resultiert, ebenso wie eine Hemmung von intrazellulären Phosphatasen, in einer verlängerten Halbwertszeit des Abbaus eines LKLF-eGFP-Fusionsproteins. Des Weiteren konnte sowohl eine Ubiquitinylierung als auch eine Tyrosinphosphorylierung von LKLF-eGFP-Fusionsproteinen nachgewiesen werden. Durch die Methode der ballistischen DNA-Immunisierung mittels einer „Gene Gun“ konnten erfolgreich Antiseren gegen humanes LKLF hergestellt werden. Die Antiseren waren in der Lage unterschiedliche LKLF-Expressionskonstrukte sowohl in Primär- als auch in Tertiärstruktur zu detektieren.

The objective of this work was on the one hand to further characterize the activation induced degradation pathway of LKLF protein in living cells. On the other hand antibodies against human LKLF protein should be generated by a modern immunization method. The results of this work show strong evidence for a proteasome dependent degradation of LKLF in living cells. Protein modifications as ubiquitination and phosphorylation seem to modify the turnover of the protein. Inhibition of the proteasome as well as inhibition of intracellular phophatases resulted in a prolongated half life time of the destruction of LKLF-eGFP fusion proteins. Further on ubiquitination and tyrosine phosphorylation of LKLF-eGFP fusion proteins were shown by the use of specific antibodies wich are able to detect phophotyrosin and ubiquitin respectively. Antisera against human LKLF were successfully generated by the method of ballistic DNA-immunization using a “gene gun”. The antisera were able to detect different LKLF expression constructs in primary as well as in tertiary protein structure.