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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-27748
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/2774/


The interaction between tyrosine protein kinase receptor B (TrkB) and neural cell adhesion molecule NCAM in Mus musculus

Die Interaktion zwischen der Tyrosinrezeptorkinase B (TrkB) und dem neuralen Zelladhäsionsmolekül NCAM in Mus musculus

Friedrich, Claudia

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Freie Schlagwörter (Deutsch): NCAM , TrkB , BDNF , Interaktion , Neuritenwachstum
Freie Schlagwörter (Englisch): NCAM , TrkB , BDNF , interaction , neurite outgrowth
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schachner, Melitta (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.12.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 30.01.2006
Kurzfassung auf Englisch: For quite some time now, it has been hypothesized that the two molecules NCAM and TrkB interact with each other extracellularly via PSA-NCAM and BDNF (Charles et al., 2000; Muller et al., 2000; Vutskits et al., 2001).

In contrast, the hypothesis we set out to prove in this study proposes an intracellular interaction between NCAM and TrkB. First, observations from a phage display analysis provided evidence that TrkB may be considered as a potential binding partner of NCAM180: A peptide in TrkB-ID was identified that bound to a peptide in NCAM180-ID. The major aim of this work was to characterize the potential binding between NCAM180-ID and TrkB-ID including a potential functional relevance. For this purpose, biochemical cross-linking, co-immunoprecipitation assays and binding studies were performed. ELISA experiments revealed that NCAM180-ID bound to TrkB-ID, or to the TrkB peptide discovered in the phage display analysis as containing the putative NCAM180-ID binding site. In the ID of the 180-kDa NCAM isoform, a peptide motif that binds to a peptide sequence in the tyrosine kinase domain of TrkB was identified. This peptide motif in NCAM180 shows sequence similarities with the C terminus of the Kir3.3 isoform, but not with the other three isoforms of this potassium channel. Epitope mapping showed that the binding site within NCAM is located in an overlapping region between the NCAM exon 18 and the C terminus of NCAM180-ID and NCAM140-ID. To show a binding between full-length TrkB and NCAM180-ID via biochemical cross-linking, not only the phosphorylation conditions but also the presence of certain protease inhibitors such as the matrix metalloprotease inhibitor GM 6001 and the gamma-secretase inhibitor DAPT in the lysis buffer was shown to be necessary. Taken together, these results implicate that the interaction requires conditions in which phosphorylation is enhanced (via inhibition of dephosphorylation) without the necessity of having TrkB itself phosphorylated. The cross-linking experiments did not only show a direct interaction between full-length TrkB (TK+ TrkB) and NCAM180-ID but also with an 80-kDa Trk fragment. Beyond that, the truncated isoform (TK– TrkB) was also isolated with NCAM180-ID and TrkB. In addition, co-immunoprecipitation studies under the same lysis conditions have confirmed an interaction between TrkB and full-length NCAM180 in the ‘natural environment’ of the cell membrane within the brain. In addition, proteasome inhibitors have effects on the intracellular proteolytic processing of both NCAM-ID and Trk-ID. NCAM180 has been shown to be ubiquitinated and probably involved in ubiquitin-dependent proteolysis. The matrix metalloprotease inhibitor GM 6001 could be proven to inhibit TrkB ectodomain shedding.
A functional interrelationship between TrkB and NCAM-mediated cell interactions was highlighted in experiments in which BDNF inhibited NCAM-induced and -specific neurite outgrowth of cerebellar microexplant cultures.
In summary, although the exact regulation mechanisms of the NCAM–TrkB binding based on proteolytic processing remain to be elucidated, this study showed for the first time an interaction between NCAM and TrkB. The main focus of this study was based on the hypothesis that a cross-talk exists between TrkB and NCAM with the potential of causing convergence and divergence of downstream signaling cascades in various ways.


Kurzfassung auf Deutsch: Schon vor einiger Zeit wurde die Hypothese aufgestellt, dass die beiden Moleküle NCAM und TrkB über PSA-NCAM und BDNF extrazellulär miteinander interagieren (Charles et al., 2000; Muller et al., 2000; Vutskits et al., 2001).

Im Gegensatz dazu haben wir mit dieser Studie die Hypothese einer intrazellulären Interaktion zwischen NCAM und TrkB verfolgt. Zuerst deuteten Beobachtungen aus einer Phagen-Display-Analyse darauf hin, dass TrkB ein potenzieller Bindungspartner für NCAM180 sein könnte: In der intrazellulären Domäne von TrkB (TrkB-ID) wurde eine Peptidsequenz identifiziert, die an eine Peptidsequenz innerhalb der intrazellulären Domäne von NCAM180 (NCAM180-ID) bindet. Hauptziel dieser Arbeit war, die potenzielle Bindung zwischen NCAM180-ID und TrkB-ID einschließlich ihrer funktionellen Bedeutung zu charakterisieren. Dafür wurden biochemische Crosslinking-Versuche, Koimmunpräzipitationen und Bindungsstudien durchgeführt. ELISA-Experimente zeigten deutlich, dass NCAM180-ID an TrkB-ID bindet, oder an das TrkB-Peptid, das die mögliche NCAM180-ID-Bindungsstelle enthält und im Rahmen der Phagen-Display-Analyse entdeckt wurde. In der intrazellulären Domäne der 180-kDa NCAM-Isoform wurde ein Peptidbindungsmotiv identifiziert, das eine Peptidsequenz in der Tyrosinkinase-Domäne von TrkB bindet. Dieses Peptidbindungsmotiv in NCAM180 zeigt Sequenzähnlichkeiten nur mit dem C-Terminus der Kir3.3-Isoform, nicht aber mit den drei anderen Isoformen dieses Kaliumkanals. Epitop-Mapping machte deutlich, dass sich die Bindungsstelle innerhalb von NCAM in einer überlappenden Region zwischen NCAM-Exon18 und dem C-Terminus von NCAM180-ID und NCAM140-ID befindet. Um nun mittels biochemischer Crosslinking-Versuche eine Bindung zwischen TrkB (in voller Länge) und NCAM180-ID nachzuweisen, war neben bestimmten Phosphorylierungsbedingungen auch die Anwesenheit bestimmter Protease-Inhibitoren wie zum Beispiel dem Matrix-Metalloprotease-Inhibitor GM 6001 und dem Gamma-Sekretase-Inhibitor DAPT im Lysepuffer von entscheidender Bedeutung. Zusammengefasst implizieren diese Ergebnisse, dass die Interaktion Bedingungen erfordert, in denen die Phosphorylierung begünstigt wird (durch Hemmung der Dephosphorylierung), ohne dass TrkB selbst phosphoryliert sein muss. Die Crosslinking-Versuche bewiesen nicht nur eine direkte Interaktion zwischen vollständigem TrkB (TK+ TrkB) und NCAM180-ID, sondern auch zwischen NCAM180-ID und einem 80-kDa Trk-Fragment. Auch die verkürzte Isoform (TK– TrkB) wurde mit NCAM180-ID und TrkB isoliert. Die Bindung zwischen TrkB und vollständigem NCAM180 konnte im Gehirn in der ‘natürlichen Umgebung’ der Zellmembran mittels Koimmunpräzipitation unter den gleichen Lysebedingungen nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Proteasom-Inhibitoren auf die intrazelluläre proteolytische Prozessierung sowohl von NCAM-ID als auch von Trk-ID einwirken. Es wurde nachgewiesen, dass NCAM180 ubiquitiniert wird und möglicherweise in die Ubiquitin-abhängige Proteolyse involviert ist. Für TrkB konnte erstmals der Nachweis für das Ektodomän-Shedding, das sich durch den Matrix-Metalloprotease-Inhibitor GM 6001 inhibieren ließ, erbracht werden.
Eine funktionelle Beziehung zwischen TrkB- und NCAM-abhängigen Zellinteraktionen wurde durch Experimente an Kleinhirnmikroexplantkulturen dargelegt, in denen BDNF spezifisch das durch NCAM ausgelöste Neuritenwachstum hemmte.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass im Rahmen dieser Studie erstmals eine Bindung zwischen NCAM und TrkB mit funktioneller Bedeutung nachgewiesen werden konnte. Der genaue, auf proteolytischer Prozessierung basierende Regulationsmechanismus der NCAM–TrkB-Bindung muss jedoch noch aufgeklärt werden. Die Studie beruhte hauptsächlich auf der Hypothese, dass TrkB und NCAM über ein intensives Kommunikationsnetz miteinander interagieren, über das verschiedene Signaltransduktionskaskaden in vielfältiger Weise zusammengeführt werden und wieder auseinander driften.


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