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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-27936
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/2793/


Synthese von Peptiden aus dem N-terminalen Bereich des humanen CCR5 unter Verwendung von Sulfotyrosinen und deren Bindung an das HIV-1 Glycoprotein GP120

Synthesis of peptides of the N-terminal region of the human CCR5 containing sulfotyrosines and their binding to the HIV-1 glycoprotein gp120

Kühnemund, Thomas

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SWD-Schlagwörter: HIV , Epitop
Freie Schlagwörter (Deutsch): gp120 , STD-NMR , SPR , CCR5 , Sulfotyrosine
Basisklassifikation: 35.62 , 35.71 , 35.25
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.01.2006
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 13.02.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Bei der Infektion einer Zelle mit dem HIV-1 bindet das virale Glycoprotein GP120 unter Ausbildung eines trimolekularen Komplexes an die Membranrezeptoren CD4 und CCR5, wobei der mehrere Sulfotyrosine enthaltende CCR5-N-Terminus eine wichtige Rolle spielt.
Im Laufe dieser Arbeit wurden zahlreiche Peptide aus dem Bereich des CCR5 N-Terminus auf dem Wege der Festphasenpeptidsynthese dargestellt und durch RP HPLC aufgereinigt. Die Charakterisierung dieser Peptide gelang durch MALDI-TOF- bzw. ESI-MS sowie durch NMR-Spektroskopie. Durch CD-Spektroskopie zeigte sich, dass diese Peptide eine ähnliche Sekundärstruktur mit einem hohen Anteil an b-Faltblatt aufwiesen.
Im ersten Teil der Arbeit wurden Substitutionen von Aminosäuren und Sequenzverkürzungen bei Peptiden aus dem Bereich des CCR5 N-Terminus im Hinblick auf Löslichkeits-eigenschaften untersucht. Dafür wurde zu Beginn das Peptid A1s (AS-Sequenz: M1 bis R31) synthetisiert. NMR-spektroskopische Untersuchungen zeigten, dass dieses Peptid Aggregate bildete und daher nicht für Bindungsstudien eingesetzt werden konnte.
Mit vorher optimierten Bedingungen für die Festphasenpeptidsynthese wurden weitere 16 Peptide (A1-A16) basierend auf dieser Sequenz mit einer Länge von 31 AS dargestellt, die an unterschiedlichen Positionen substituiert wurden. Die durch SPR ermittelten KD-Werte lagen dabei im Bereich zwischen 3 und 2500 µM.
Weiterhin wurden die Peptide C1-C6 mit unterschiedlichen AS-Sequenzlängen dargestellt. Der daraus abgeleitete für die Löslichkeit optimale AS-Sequenzabschnitt von Y3 bis S20 für weitere Peptidsynthesen beinhaltet alle vier Tyrosine des CCR5 N-Terminus.
Im zweiten Teil der Arbeit gelang es Peptide mit Sulfotyrosinen darzustellen. Dafür wurde zunächst ein Fmoc-geschützter Sulfotyrosin-Baustein synthetisiert und anschließend eine Methode für die Festphasenpeptidsynthese mit diesem Baustein entwickelt.
Die Synthese des Fmoc-geschützten Tyrosins erfolgte ausgehend vom Tyrosin mit Fmoc-Succinimid. Die phenolische Hydroxylgruppe wurde mit einem SO3·DMF-Addukt sulfatiert.
Für die Festphasenpeptidsynthese wurde ein 2-Chlortrityl-Polystyrolharz eingesetzt, von dem die Peptide schonend mit HFIP/DCM abgespalten werden konnten. Als Kupplungsreagenzien für die Sulfotyrosine wurden HOBt und DIPCDI und ansonsten PyBob und NMM verwendet. Die Abspaltung der Schutzgruppen wurde bei 0 °C in 90 % aq. TFA für 5 -7 h durchgeführt. Das capping während der Synthese gelang mit einer Mischung aus Ac2O/Pyridin/DMF (1:1:38). Für die Aufreinigung über RP-HPLC wurden Laufmittelgemische ohne TFA-Zusatz gewählt. Die eindeutige massenspektroskopische Charakterisierung aller sulfatierten Peptide gelang nur durch ESI-MS im negative ion mode.
Die Auswertung der SPR-Experimente der sulfatierten Peptide erwies sich aufgrund der negativen Kurvenverläufe als schwierig. Eindeutige Ergebnisse in Bezug auf den Einfluss der Sulfatierung konnten durch STD-NMR-Studien erhalten werden.
Es wurde das Peptid D1 mit einem Sulfotyrosin und das Peptid D2 ohne Sulfotyrosin hergestellt (AS-Sequenz: N13 bis K22). Das Peptid D2 zeigte in SPR-Bindungsstudien eine Dissoziationskonstante von KD = 14 µM, die ca. um den Faktor zwei kleiner als die des Peptids D1 mit KD = 35 µM war. Das durch STD-NMR ermittelte Bindungsepitop zeigte, dass vor allem die Aromaten von Y14 und Y15 bei beiden Peptiden wesentlich an der Bindung beteiligt sind. Aus den STD-NMR Untersuchungen ergaben sich die stärksten Affinitäten einzelner Protonen von Peptid D2 zu KD = 3 mM und Peptid D1 zu KD = 1 mM. Die Sulfatgruppe an Y14 verbessert damit die Bindungsaffinität zum GP120 um Faktor drei.
Weiterhin konnten die Peptide F1-F4 (AS-Sequenz: Y3 bis S20) dargestellt werden, die bis auf Peptid F1 statt der Tyrosine zwei oder drei Sulfotyrosine enthielten. Für das Peptid F1 konnte eine Dissoziationskonstante von KD = 4 µM ermittelt werden. Die sulfatierten Peptide F2-F4 zeigten am Anfang negative RU-Antworten, bevor ein fast linearer Anstieg der Bindungskurve erfolgte. Es ergaben sich Dissoziationskonstanten für Peptid F2 von KD = 7 µM, für Peptid F3 von KD = 16 µM und für Peptid F4 von KD = 66 µM. Das durch STD-NMR ermittelte Bindungsepitop zeigte, dass auch hier vor allem die Aromaten von Y10, Y14 und Y15 und weitere Protonen in diesen Bereichen wesentlich an der Bindung beteiligt sind. Aus den STD NMR Untersuchungen ergaben sich die stärksten Affinitäten einzelner Protonen von Peptid F2 zu KD = 135 µM und Peptid F4 zu KD = 9 µM. Es konnte damit gezeigt werden, dass die Sulfatgruppe an Y10 die Bindungsaffinität zum GP120 um mehr als eine Größenordnung verbessert.
Es gelang in der vorliegenden Arbeit erstmals, detaillierte Aussagen über die an der Bindung zum GP120 beteiligten Atomgruppen des CCR5 N-Terminus zu machen und damit das Bindungsepitop zu charakterisieren. Dabei zeigte sich, dass die Sulfatgruppen an Y10 und Y14 die Bindungsaffinität der untersuchten Peptide zum GP120 verbessern.
Kurzfassung auf Englisch: Infection of a cell with HIV-1 begins with binding of the viral glycoprotein GP120 to the membranereceptors CD4 and CCR5 forming a trimolecular complex. The N-terminus of the CCR5-receptor, containing several sulfotyrosines, plays an important role in this binding event.
Numerous peptides deriving from the region of the CCR5 N-terminus were synthesized during this thesis using solid phase peptide synthesis and were purified by RP HPLC. Characterization of these peptides was performed by MALDI-TOF- and ESI-MS respectively and NMR-spectroscopy. CD-spectroscopy showed a similar secondary structure with a high portion of b-sheet for all peptides.
In the first part of this thesis amino acid substitutions and sequence truncation of peptides derived from the region of the CCR5 N-terminus were investigated in regard to solubility. First, peptide A1s (amino acid-sequence: M1 to R31) was synthesized. NMR spectroscopy revealed an aggregation of this peptide, so it could not be used for binding studies.
Previously optimized conditions for the solid phase peptide synthesis were the basis for the synthesis of further 16 peptides (A1-A16) containing 31 amino acids according to the N terminus of CCR5. Some of the amino acids in these peptides were substituted. SPR showed binding of all these peptides to GP120 with KD-values from 3 to 2500 µM.
Peptides C1-C6, differing in length, were synthesized to analyze the effect of the sequence truncations on solubility. The optimal amino acid sequence for further peptide synthesis deriving from this results includes Y3 to S20 and contains all four tyrosines.
Peptides containing sulfotyrosines were synthesized in the second part of this thesis. For this purpose an Fmoc-protected sulfotyrosine building block was synthesized and a method for solid phase peptide synthesis using this building block developed.
The synthesis of the Fmoc-protected tyrosine was performed with tyrosine and Fmoc-succinimide. Subsequently the phenolic hydroxylgroup was sulfated using a SO3·DMF-adduct.
Because of the acid lability of the sulfate group the solid phase peptide synthesis of sulfotyrosine containing peptides is more complex. As solid phase a 2-chlorotrityl resin was used. Cleavage was performed with HFIP/DCM. As coupling reagents for the sulfotyrosine building block HOBt and DIPCDI were used, whereas all other amino acids where coupled with PyBob and NMM. The cleavage of the protecting groups was performed at 0 °C in 90 % aq. TFA for 5 -7 h. For the purification by RP HPLC solvents without TFA were used to prevent desulfation. Capping was performed by a mixture of Ac2O/Pyridin/DMF (1:1:38). A masspectrometic characterization was successful only with ESI-MS in negative ion mode.
SPR-experiments with the sulfated peptides, in contrast to non sulfated peptides, showed negative binding curves. The analysis of these exceptional binding curves proved to be difficult. However, clear insights into the influence of the sulfate group were provided by STD-NMR-studies.
The peptides D1 with one sulfotyrosine and D2 without a sulfotyrosine were synthesized (amino acid-sequence: N13 to K22). Peptide D2 showed a KD-value of 14 µM in SPR-studies, which was factor two smaller than that one of peptide D1 (KD = 35 µM). The binding epitope determined by STD-NMR revealed that the aromatic protons of Y14 und Y15 are of particular importance. Affinities were obtained by STD-NMR for peptide D2 with KD = 3 mM and peptide D1 with KD = 1 mM. The sulphate group at Y14 improves the binding affinity about threefold.
Furthermore the peptides F1-F4 (amino acid-sequence: Y3 to S20) were synthesized. Except peptide F1 these peptides contained two or three sulfotyrosines instead of the tyrosines. In SPR-studies a dissociation constant of KD = 4 µM was obtained for peptide F1, that must be regarded critically. At the beginning the sulfated peptides F2-F4 showed negative binding curves followed by a linear rise during the SPR-experiments. Dissociation constants of KD = 7 µM for peptide F2, KD = 16 µM for peptide F3 and KD = 66 µM for peptide F4 where obtained. Thus the dissociation constant increased with an higher number of sulfotyrosines. Maybe this strange observation results from the unusual binding curves. The binding epitope obtained by STD-NMR shows that the aromatic protons of Y10, Y14, Y15 and some other protons in this region are involved particularly. Affinities were obtained by STD-NMR for peptide F2 with KD = 135 µM and Peptide F4 with KD = 9 µM. Thus the sulphate group at Y10 improves the binding affinity to GP120 about one order of magnitude.
In this thesis detailed information about the atom groups of the CCR5 N-terminus involved in the binding to GP120 were obtained, whereby a characterization of the binding epitope of the CCR5 N-terminus was possible. STD-NMR-studies showed that the sulfate groups at Y10 and Y14 increase the binding affinity to GP120.

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