FAQ
© 2015 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-27954
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/2795/


Funktionelle Analyse des Polyaminstoffwechsels in Plasmodium falciparum (Welch, 1897)

Müller, Ingrid Burglinde

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (4.136 KB) 


SWD-Schlagwörter: Plasmodium falciparum , Arginase , Polyamine , Polyaminstoffwechsel , Malaria tropica , Ornithindecarboxylase
Basisklassifikation: 42.13 , 35.79 , 42.36
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Walter, Rolf D. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.12.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 13.02.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Malaria tropica ist mit weit über einer Million Toten pro Jahr die bedeutendste parasitäre Tropenkrankheit. Aufgrund sich schnell ausbreitender Resistenzen des Erregers Plasmodium falciparum gegenüber den gängigen Antimalariamedikamenten ist es bisher nicht gelungen, die Krankheit erfolgreich zu bekämpfen. So ist es dringend notwendig, im Metabolismus des Parasiten neue Angriffspunkte für die Entwicklung von wirksamen Chemotherapeutika zu identifizieren. Das erythrozytäre Stadium von P. falciparum ist allein verantwortlich für die Symptomatik der Malaria tropica. In dieser Phase weist der Parasit eine hohe Proliferationsrate auf, die der sich schnell teilender Krebszellen gleicht. Polyamine sind essentiell für Proliferation und Differenzierung in jedem Organismus. In der Bekämpfung von Tumorzellen, phytopathogenen Pilzen und dem Protozoon Trypanosoma gambiense bietet die Blockierung des Polyaminstoffwechsels einen viel versprechenden Ansatz. In P. falciparum sind die Schlüsselenzyme der Polyaminsynthese S Adenosylmethionin-Decarboxylase (AdoMetDC) und Ornithin-Decarboxylase (ODC) auf einem bifunktionellen Polypeptid PfAdoMetDC/ODC angeordnet. Anhand der Hemmung mittels ODC-Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass das Wachstum des Parasiten stagniert, sich dieser Effekt jedoch durch Zugabe des Reaktionsprodukts Putrescin wieder aufheben lässt. Dies zeigt, dass der Parasit in der Lage ist, Putrescin aufzunehmen. Ob die Polyaminsynthese für P. falciparum tatsächlich essentiell ist, wurde mittels genetischer Manipulation analysiert. In den Transfektionsvektor pHTK wurden zwei homologe Sequenzen kloniert, worüber ein Doppelcrossover erfolgen sollte und somit das endogene PfAdoMetDC/ODC-Gen gegen das Gen der humanen Dihydrofolat-Reduktase ausgetauscht würde. Episomal konnte das Plasmid in den transgenen Zellen detektiert werden. Eine Deletion der endogenen Sequenz konnte jedoch nicht erzielt werden. Dies ist möglicherweise darin begründet, dass die durch die genomische Modifikation im Polyaminstoffwechsel beeinträchtigten Zellen nicht genügend Putrescin aufnehmen, um sich in der Plasmodienkultur zu behaupten. Es wurde schließlich ein weiteres Transfektionskonstrukt hergestellt, das zur Deletion der PfODC führen sollte, zusätzlich aber eine Kopie der humanen ODC trägt. Durch den Austausch der PfODC gegen das humane Ortholog mittels Single Crossover ist der Parasit in der Lage, selber Putrescin herzustellen und ist somit nicht auf die Aufnahme von Putrescin angewiesen. Nach Transfektion konnten tatsächlich sowohl die Integration des Konstruktes ins plasmodiale Genom als auch die Expression der hODC im Parasiten detektiert werden. Jedoch konnte im Rahmen der Arbeit kein Knockout-Klon isoliert und phänotypisch charakterisiert werden. Zusammengefasst deuten alle Ergebnisse darauf hin, dass die PfODC für das Überleben des Parasiten im Blutstadium essentiell ist.
Auf der Suche nach weiteren Enzymen des Polyaminsynthesewegs, wurden ein offener Leserahmen gefunden, dessen abgeleitete Proteinsequenz Homologie zu der Familie der Arginasen aufweist. Anhand der rekombinanten Expression in Escherichia coli und der anschließenden biochemischen Charakterisierung konnte das plasmodiale Protein eindeutig als Arginase identifiziert werden. Die plasmodiale Arginase (PfARG) stellt aus Arginin Ornithin her und leitet dadurch den ersten Schritt in der Polyaminsynthese des Parasiten ein. Die PfARG besitzt eine molekulare Masse von 48 kDa. In der Gelchromatographie eluiert sie als 150 kDa-großes Homotrimer und entspricht somit dem oligomeren Status beider Säugerarginasen. Die PfARG ist wie die meisten Arginasen manganabhängig. Der Effekt des Metallchelators EDTA wirkt sich insofern auf die PfARG aus, als diese nicht nur wie die Säugerarginase in ihre Untereinheiten zerfällt, sondern auch ihre Aktivität vollständig verliert. Nähere Untersuchungen der manganbindenden Aminosäuren durch mutierte Formen des plasmodialen Enzyms unterstreichen die durch die Inhibierung mit EDTA erzielten Ergebnisse. Demnach ist die Aktivität der PfARG im Gegensatz zu den Säugerarginasen deutlich stärker durch die Quartärstruktur bedingt. Die beiden Arginasetypen im Säuger besitzen unterschiedliche biologische Funktionen. Während der Typ I die Entgiftung von Ammonium in Form von Urea vornimmt, ist die Aufgabe der mitochondrialen Arginase II eher in der Regulation der Arginin-, Ornithin- und Stickoxid-Konzentrationen zu finden. Mittels Immunlokalisierung der PfARG mit spezifischen Antikörpern gegen das plasmodiale Enzym konnte diese cytosolisch im Parasiten in späteren Stadien aber auch im Wirtscytoplasma nachgewiesen werden. Dies könnte auf eine weitere Funktion der PfARG zusätzlich zur Bereitstellung des Ornithins für die Polyaminsynthese hindeuten.
Kurzfassung auf Englisch: The causative agent of Malaria tropica, Plasmodium falciparum, kills over a million people annually. The combat against malaria is significantly reduced due to the spreading of resistance against the few available antimalarials. Therefore, the need for novel drug targets is urgent. Only the blood stage of Plasmodium is responsible for the symptoms of malaria. In this stage the parasite shows a high proliferation, which resembles to that one of fast dividing cancer cells. Polyamines are essential for proliferation and differentiation. Blocking the polyamine synthesis was proven to be a promising strategy against cancer, phytopathogenic fungi and the protozoan parasite Trypanosoma gambiense. In P. falciparum the two key enzymes S adenosylmethionine decarboxylase (AdoMetDC) and ornithine decarboxylase (ODC) are located on a single bifunctional polypeptide PfAdoMetDC/ODC. The inhibition of the ODC shows a stagnation of the parasite proliferation. This effect can be restored by the addition of putrescine, the product of the reaction. Furthermore, it reveals that the parasite is able to take up putrescine.
Transfection experiments were made to elucidate the essential role of the key enzymes via gene knockout. Two homologous sequences surrounding the gene locus were cloned into the transfection vector pHTK in order to provoke a double crossover. This leads to the full replacement of the endogenous PfAdoMetDC/ODC gene by the gene of the human dihydrofolate reductase (hDHFR) as a selection marker. The episome was found within the parasite. However, integration could not be achieved, possibly due to the fact that the transgenic cells cannot take up enough polyamines to overcome the blockade of their polyamine biosynthesis. An additional construct was generated leading to the disruption of the PfODC thereby introducing a copy of the human ODC gene into the gene locus via single crossover. It enables the parasite to produce its own putrescine. This heterologous construct was indeed integrated into the plasmodial genome and its expression within the parasite was detected. However, isolation and subsequent phenotype analysis of a knockout clone could not be realised. Nevertheless, all gained results point out that PfODC is essential for the survival of the parasite at least in the blood stage.
Screening the P. falciparum genome for further enzymes of the polyamine biosynthesis pathway revealed an open reading frame encoding for a protein with high homology to arginases. The recombinant expression in Escherichia coli and the subsequent biochemical characterisation confirmed the plasmodial arginase (PfARG). PfARG produces ornithine from arginine and catalyses thereby the first step in the polyamine synthesis pathway. The molecular mass of PfARG is 48 kDa. Elution by gel chromatography revealed a homotrimer of 150 kDa, corresponding to the oligomeric status of the two types of mammalian arginases. PfARG depends on manganese as cofactor as described for many arginases. The inhibitory effect of the metal chelator EDTA is based on the disruption of the quartery structure and results in the complete loss of activity, which clearly differs from the effect on the mammalian arginases. The indispensability of the manganese ions for structure and activity of PfARG was confirmed by mutation analyses of the manganese binding amino acid residues. Both types of mammalian arginases differ in their biological function. Type I enables the detoxification of ammonia by forming urea, whereas the mitochondrial type II arginase plays an important role in regulating the arginine, ornithine and nitric oxide levels. Immunolocalisation of PfARG using specific antibodies against the plasmodial enzyme revealed a cytosolic distribution within the parasite. However, in the trophozoite stage the arginase can be found also throughout the whole cytoplasm of the erythrocyte. This may suggest an additional function distinct from the production of ornithine for the polyamine synthesis and should be further investigated.


Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende