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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-28072
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/2807/


Selektion und Identifikation von Peptid Nukleinsäuren

Selection and identification of Peptide Nucleic Acids

Matzas, Mark

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SWD-Schlagwörter: Aptamer , Peptid-Nucleinsäuren , Kapillarelektrophorese , Nucleinsäuren , RNS-Ligase , Künstliche Auslese
Freie Schlagwörter (Deutsch): in vitro-Evolution , SELEX , Nukleinsäure-analoge Verbindungen , Liganden
Freie Schlagwörter (Englisch): Aptamer , SELEX , Peptide Nucleic Acids , in vitro-evolution
Basisklassifikation: 35.75 , 35.79
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bredehorst, Reinhard (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.02.2006
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 28.02.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Der Bedarf spezifischer und hoch-affiner Liganden für den diagnostischen und therapeutischen Einsatz steigt zunehmend. Neben der Generierung von Antikörpern durch Immunisierung stehen mittlerweile in vitro-Technologien zur Verfügung, die die Herstellung von Liganden für nahezu alle denkbaren Zielmoleküle erlauben. Diese Verfahren basieren auf Molekül-Bibliotheken und bedienen sich evolutionärer Selektionsmethoden (z.B. Phage-Display, Ribosome-Display oder SELEX), um Moleküle mit den benötigten Eigenschaften zu isolieren. Bei den hierbei erhaltenen Molekülen handelt es sich jedoch ausschließlich um Biopolymere, wie Peptide, Proteine oder Nukleinsäuren, da bei Anwendung evolutionärer Selektionsmethoden eine Replikation der Komponenten unerlässlich ist.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Technologien entwickelt, die den Einsatz von Peptid Nukleinsäuren (PNA) in einem Selektionsprozess möglich machen, der an das etablierte SELEX-Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-Aptameren angelehnt ist. Peptid Nukleinsäuren sind eine Nukleinsäure-analoge Verbindung, bei der das Ribose-Phosphodiester-Rückgrat durch einen Peptidstrang bestehend aus N-(2-Aminoethyl)-glycin-Untereinheiten ausgetauscht ist. Dieser trägt die aus DNA bekannten Nukleobasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin und versetzt PNA in die Lage, an DNA und RNA zu hybridisieren. Durch die artifizielle Struktur sind weitere Eigenschaften, wie eine erhöhte chemischen Stabilität und eine inhärente Resistenz gegenüber Nukleasen und Proteasen gegeben, was PNA auch für die Verwendung als spezifische Liganden interessant macht.

In einem Modellsystem konnte eine hoch effiziente Trennung von PNA und PNA/Zielmolekül-Komplexen auf der Basis von kapillarelektrophoretischen Verfahren etabliert werden. Hierbei wurde Sodiumdodecylsulfat (SDS) in Konzentration von <0,6mM als Ladungsvermittler eingesetzt und führte zu einer ausschließlichen Migration des verwendeten Proteins, während PNA aufgrund geringer Wechselwirkungen mit SDS in einem elektrischen Feld keine Wanderung zeigte. In den genutzten Konzentrationsbereichen führte SDS zudem nicht zu einer signifikanten Denaturierung des verwendeten Proteins. Damit steht eine effiziente Trennungsmethode von nicht bindenden PNA-Molekülen und PNA/Zielmolekül-Komplexen zur Verfügung.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin Verfahren für die Sequenzierung kleiner Mengen unbekannter PNA entwickelt und evaluiert. Diese basieren auf dem Transfer der PNA-Sequenzinformation auf DNA, die anschließend mittels PCR amplifiziert und sequenziert werden konnte, um so auf die PNA-Sequenz zurückzuschließen.
Es konnte gezeigt werden, dass die Hybridisierung einer PNA an komplementäre ssDNA aus einer entsprechenden Bibliothek und die anschließende Isolierung der Hybride nicht praktikabel war, da der Hintergrund bestehend aus nicht komplementären Bibliotheks-Komponenten auch durch die Kombination diverser Trennungs- und enzymatischer Abbau-Methoden nicht hinreichend gesenkt werden konnte.
Alternativ wurden daher Methoden für die Synthese PNA-komplementärer DNA entwickelt. Mittels chemischer Methoden konnte eine Verknüpfung hybridisierter DNA-Fragmenten auf einer PNA etabliert werden, jedoch war diese aufgrund zu geringer Effizienz für eine PNA-Sequenzierung nicht einsetzbar.
Durch enzymatische PNA-gerichtete Verknüpfung randomisierter DNA-Fragmente mit einer Länge von drei bis sechs Nukleotiden konnte eine PNA-komplementäre DNA synthetisiert und nachfolgend amplifiziert und sequenziert werden. Damit steht eine neue und effiziente Technologie für den Transfer der PNA-Sequenzinformation auf DNA zur Verfügung. Diese erlaubt eine Ermittlung der PNA-Sequenz bereits aus extrem geringen Mengen.

Dieser Transfer der Sequenz-Information von PNA auf DNA und bereits bekannte Methoden für die Synthese von PNA anhand einer DNA-Vorlage erlauben die Sequenzierung und die Vervielfältigung von PNA. In Kombination mit der entwickelten Trennungsmethode stehen die Basiskomponenten für eine Selektion von PNA-Aptameren mittels evolutionärer Verfahren zur Verfügung.
Kurzfassung auf Englisch: The demand for ligands with high specificity and high affinity for use in diagnostic or therapeutic applications is growing increasingly. Today the generation of antibodies by immunization is complemented by technologies for in vitro-evolution that are capable of generating ligands for nearly every target-molecule. These methods base on combinatorial libraries which are screened by evolutional processes like phage-display, ribosome-display or SELEX to obtain molecules with desired properties. These libraries so far consist exclusively of natural biopolymers, like peptides, proteins or nucleic acids, because evolutional selection-processes require a replication of library-components.

Within this study technolgies have been developed that permit the application of Peptide Nucleic Acids (PNA) in a selection-process similar to the SELEX-process used for generation of nucleic acid aptamers. PNA represent a nucleic acid analog in which the ribose-phosphodiester backbone is replaced by a peptide strand consisting of N-(2-Aminoethyl)glycine-subunits that each carry one of the four nucleobases adenine, cytosine, guanine and thymine. Therefore PNA is able to hybridize to natural nucleic acids. Due to the artificial structure PNA possess additional properties like enhanced chemical stability and an intrinsic resistance against nucleases and proteases which makes this compound highly interesting for the use as ligands.

A high efficient separation method for PNA and PNA/target-molecule complexes could be evaluated in a model system using capillary electrophoresis. Crucial factor in the separation-process is the ionic detergent sodium-dodecylsulfate (SDS) which has been added in concentrations up to 0.6mM to the separation-buffer. The interaction with proteinic compounds causes an exclusive migration of proteins in the electrophoretic system while no significant denaturation of the used protein could be observed at this SDS-concentration. Because of electrical neutrality and obviously no remarkable interaction with SDS, PNA did not show any migration at all.

Additionally different approaches for sequencing an unknown PNA have been developed and evaluated in the present work. These depend basically on the transfer of PNA-sequence information onto DNA that can be amplified and sequenced subsequently.
It could be shown that hybridization of PNA to a complementary ssDNA from a random library and isolation of PNA/DNA-hybrids was not feasible due to the unsufficient reduction of the background consisting of non-complementary library-components using physical separation and/or enzymatic degradation.
Alternative methods for the generation of a PNA-complementary DNA have been tested. Although a template directed synthesis of a PNA-complementary DNA by linkage of hybridized DNA-fragments using chemical methods could be established it was not applicable for PNA-sequencing due to inadequate yields.
A PNA-directed enzymatic synthesis of DNA by ligation of randomized fragments with T4 RNA ligase provided means for a new and efficient technology for the transfer of PNA-sequence information onto a complementary DNA. This technology allows the

The information-transfer from PNA to DNA taken together with published methods for the DNA-directed synthesis of PNA makes sequencing as well as amplification of PNA possible. Combined with a high efficient separation method for PNA and PNA/target-molecule complexes all basic components which are necessary for the selection of PNA-aptamers are now available.

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