Molekulare Klonierung und Charakterisierung neuer ADP-Ribosyltransferasen bei Homo sapiens und Salmonella typhimurium

Abstract

ADP-Ribosylierung ist eine posttranslationale Proteinmodifikation, bei der der ADP-Ribose-Anteil von NAD+ auf spezifische Aminosäurereste von Zielproteinen übertragen wird. ADP-Ribosyltransferasen (ARTs) werden in mono-ARTs und poly-ARTs unterteilt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und molekulare Charakterisierung neuer ART-Genfamilienmitglieder. Mit der Aminosäuresequenz der katalytischen Domäne bekannter ARTs als Input wurden mittels tBLASTn in dbEST 4 humane mono-ART- und 17 poly-ART-kodierende EST-Cluster identifiziert (ART1, 3, 4, 5; pART 1-17). Die höchste Sequenzidentität besteht im Bereich der Sekundärstrukturmotive, die in den aufgeklärten Kristallstrukturen bakterieller ART-Toxine und der Hühner-PARP das katalytische Zentrum bilden. Nur sechs humane poly-ARTs besitzen die für ARTs charakteristische katalytische Glutaminsäure. Mittels PSI-BLAST wurden Homologe der pART-Familie in Wirbeltieren, Insekten, Nematoden, Pflanzen sowie in zwei DNA-Viren nachgewiesen, während in den durchsequenzierten Genomen der Hefe sowie der Archaebakterien keine pART-Homologen detektiert werden konnten. Die durchsequenzierten Genome von Maus und Ratte enthalten Orthologe aller humanen pARTs, mit Ausnahme von pART7. Bei den mono-ARTs wurden dagegen Mitglieder in verschiedenen bakteriellen Genomen, nicht aber in den komplettierten Genomen von Insekten, Nematoden, Pflanzen und Hefe identifiziert. Die eukaryontischen poly- und mono-ARTs zeigen deutliche Unterschiede in ihrer Gen- und Domänenstruktur: Während die katalytischen Domänen der mono-ARTs durch ein einzelnes großes Exon kodiert werden, wird die katalytische Region der meisten pART-Gene durch ein odere mehrere Introns in kleinere Exons aufgesplittert. Die mARTs bestehen lediglich aus einer isolierten katalytischen Domäne. Im Gegensatz dazu sind die katalytischen Domänen der pARTs mit unterschiedlichsten funktionellen, teilweise regulatorischen Domänen verknüpft. Nach dem Grad der Sequenzidenität, konservierten Introneinschüben und assoziierten Proteindomänen wurden die humanen pARTs in fünf Subgruppen unterteilt. Zwei humane pARTs, pART3 und pART4, wurden molekular genauer charakterisiert. Beide pARTs werden ubiquitär exprimiert. Das pART3-Gen besteht aus 11 Exons und kodiert ein Protein von 540 Aminosäuren; das pART4-Gen besteht aus 34 Exons und kodiert ein Protein von 1724 AS. Die katalytischen Domänen der beiden pARTs wurden in E.Coli rekombinant exprimiert. Für pART4 gelang der Nachweis der vorhergesagten ADP-Ribosyl-Transferase-Aktivität. Desweiteren wurde eine neu entdeckte, bakterielle Toxin-ART - das auf dem Virulenzplasmid von Salmonellen kodierte SpvB - molekular charakterisiert. Nach rekombinanter Expression und Aufreinigung der katalytischen Domäne von SpvB gelang der Nachweis der vorhergesagten ART-Aktivität. In humanen Zellen ADP-ribosyliert SpvB ein 40kD Zielprotein, das als Aktin identifiziert wurde. Die hier vorgestellten Ergebnisse bilden die Basis für die künftige Klärung der Funktionen von mono-ARTs und poly-ARTs bei der Wirt-Pathogen-Interaktion (SpvB) sowie bei zellulären Prozessen wie der DNA-Reparatur, dem Zelltod, der Regulation der Telomerlänge, dem zellulären Transport, der Inflammation, der Entwicklung von Tumoren und der antiviralen Abwehr (pARTs). Die Entwicklung von Inhibitoren von mono-ARTs und poly-ARTs könnte neue therapeutische Ansätze eröffnen.