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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-28555
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/2855/


Expression und Charakterisierung der humanen Fucosyltransferase V

Expression and characterization of the human fucosyltransferase V

Münster, Jan

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SWD-Schlagwörter: Fucose , Glycosyltransferasen
Basisklassifikation: 30.99 , 35.74 , 35.79 , 35.71
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bredehorst, Reinhard (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.06.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 24.05.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Arbeit sollten Studien zur rekombinanten Expression der humanen Fucosyltransferase V durchgeführt werden. Die Fucosyltransferase V katalysiert den Transfer von L-Fucopyranose von GDP-Fucose zum Akzeptor- Substrat N-Acetyllactosamin und ist somit an der Bildung von Lex Trisacchariden beteiligt. Da es sich bei dem Protein um ein Typ II Transmembranprotein handelt, wurde der Zytoplasmatische und der transmembrane Bereich sowie
ein Teil der Stemregion deletiert. In E. coli wurde die Fucosyltransferase V als „His-Tag“-Fusionsprotein exprimiert und aus dem Zellysat isoliert. Die Expression in Prokaryoten führte zur Bildung unlöslicher Proteinaggregate, die sich nur in sehr geringem Maße in vitro rückfalten ließen. Die N-terminale Fusion mit dem E. coli-MB-Protein führte zur Bildung von löslichem Protein. Alle in E. coli dargestellten Fucosyltransferase-Konstrukte zeigten keine
enzymatische Aktivität. In eukaryotischen Zellen konnte die Fucosyltransferase V fusioniert mit der Signalsequenz des Trace-Proteins sekretorisch exprimiert werden. Die mammalen Zellinien CHO und HEK 293 ergaben Ausbeuten von 0,2–1mg/l. Die Insektenzellinie BTI-TN-5B1-4 aus Trichoplusia ni lieferten unter Verwendung des Baculovirus Expressionssystems 1–2mg rekombinante Fucosyltransferase
V. Die Verwendung stabil transfizierter Trichoplusia ni-Zellen führte sogar zu Ausbeuten von 10–12 mg/l.
Fucosyltransferase V, die in eukaryotischen Zellinien hergestellt wurde, erwies sich als enzymatisch aktiv und lag zu einem großen Anteil als Dimer vor. Die dimere Form wurde durch Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken gebildet und ließ sich unter Erhalt der enzymatischen Aktivität mit einer Konzentration von 1mM DTT in eine monomere Form reduzieren. Mutationsstudien an zwei unterschiedlichen Cystein-Resten konnten zeigen, daß das Cys64 verantwortlich für die Bildung der Dimere ist. Das an der GDP-Fucose-Bindung beteiligte Cys156 konnte ohne Verlust der enzymatischen Aktivität gegen Serin ausgetauscht werden.
Die in eukaryotischen Zellen exprimierte Fucosyltransferase V ist glycosyliert und weist ein hohes Maß an Heterogenität auf. Deglycosylierung mit NGlycosidaseF führte zu einer Verringerung des apparenten Molekulargewichtes und zu einer Fokussierung der Banden im SDS-PAGE. Analysen mit spezifisch bindenden Lektinen zeigten bei der in Insektenzellen exprimierten Fucosyltransferase V eine dominierende Präsenz von „high-Mannose“ N-Glycanen. Zur Entwicklung spezifischer Inhibitoren gegen die Fucosyltransferase V wurden auf Phagen präsentierte Heptapeptid-Bibliotheken gegen das rekombinante Protein selektiert. Die Verwendung einer Bibliothek cirkularisierter Peptide führte zur Selektion eines spezifischen Liganden der rekombinanten Fucosyltransferase V, welcher keine inhibitorische Wirkung auf das Enzym
aufwies.
Kurzfassung auf Englisch: Summary
The aim of this study was to establish different methods for recombinant expression of the human fucosyltransferase V in eukaryotic and prokaryotic cell lines. The fucosyltransferase V catalyses the transfer of fucose from
the nucleotide donor sugar GDP-fucose to the acceptor-substrate N-acetyllactoseamine and takes part in the biosynthesis of Lex and sLex structures. The enzyme is a type II transmembrane protein. To produce a soluble form of the protein, a truncated form lacking the cytoplasmic-, the transmembraneand a part of the stem-region was cloned and expressed in different expression systems. In E. coli-cells the fucosyltransferase was expressed as a “his-tag”- fusion-protein and isolated from the cell lysate. The recombinant protein was insoluble and could only be refolded in very small amounts. The expression of a MBP-FucT V fusion-protein resulted in a formation of soluble enzyme. None of the different FucT V constructs expressed in E. coli showed enzymatic activity. To produce the fucosyltransferase in eucaryotic cell lines the protein was fused to the signal-sequence of the human trace protein. The mamalien cell lines CHO and HEK 293 expressed the protein with an amount of 0.2–1mg/l. The insect cell line BTI-TN-5B1-4 from Trichoplusia ni produced 1 mg/l fucosyltransferase
V using recombinant baculoviruses. Stable transected BTITN-
5B1-4-cells expressed the protein with an amount of 10–12 mg/l. fucosyltransferase V produced in eukaryotic cells was active and a great proportion was expressed in a dimeric form. The intermolecular disulfide-bridges forming the dimers could be reduced to a monomeric form with DTT in a concentration of 1mM retaining full enzymatic activity. Site directed mutagenesis changing different cysteine-residues to serin showed that Cys64 is responsible for forming intermolecular bridges. Cys156 —an amino-acid involved in GDPfuc-binding— could be changed to Ser without loss of activity. fucosyltransferase V produced in eukaryotic cells was glycosylated and exhibits a high measure of heterogenicity. Deglycosylation with N-glycosidase F led to a lower molecular weight and the signal appearing in SDS-PAGE was focused to a distinct band. Analyses with specific lectins showed a dominating level of high-mannose N-glycans on fucosyltransferase V expressed in insect cells. Hepta-peptide libraries were selected against recombinant fucosyltransferase V to develop specific inhibitors using the phage display technology. The use of a library of circular peptides led to specific ligands of the fucosyltransferase which showed no significant inhibitoric effect.

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