In Situ-Hybridisierung der Geschlechtschromosomen an Probanden mit Keimzelltumoren und dysgenetischen Gonaden

Abstract

Das Thema dieser Arbeit war die Etablierung der Interphasen-Zytogenetik an Paraffinschnitten von männlichen und weiblichen Gonaden zur Darstellung der Geschlechtschromosomen. Es wurden Patienten mit Pseudohermaphroditismus, mit echtem Hermaphroditismus und Fälle mit UTS sowie mit gem. Gonadendysgenesie untersucht. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, mittels der In Situ-Hybridisierung, nummerische Aberrationen am Gonadenmaterial sichtbar zu machen. Als Untersuchungsmaterial standen in Paraffin eingebette Präparate dysgenetischer Gonaden zur Verfügung. Dabei sollte untersucht werden, ob anhand des Verteilungsmusters der Chromosomen Unterschiede zwischen den verschiedenen Syndromen erkennbar sind. Da gerade die Entwicklung und die Funktion der Gonaden einen wesentlichen Einfluss auf den Phänotyp haben, scheint der gonadale Karyotyp hier von besonderer Bedeutung zu sein. Die vorliegende Arbeit soll somit klären,ob die ISH ein zusätzliches Instrument zu Untersuchung dieser Syndrome darstellt. Weiterhin wurde das Chromosomenmaterial in männlichen und weiblichen Keimdrüsen gesunder Individuen sowie in gonadalen und extragonadalen Keimzelltumoren dargestellt. Da die Keimzelltumoren eine breite Differenzierungskapazität besitzten stellt sich die Frage, ob den unterschiedlichen Komponenten verschiedene genetische Muster zuzuordnen sind.

Das Probandenkollektiv umfasste 12 Patienten mit Gonadendysgenesie und 21 Patienten mit einem Keimzelltumor.Hybridisiert wurde mit den spezifischen DNA-Sonden gegen das X- und das Y-Chromosom. Bei der Durchführung erfolgte zunächst die proteolytische Vorbehandlung der Schnitte mit Zitronensäure-Puffer, Thiozyanat und Pepsin. In der Regel war es erforderlich, die Andauzeiten für jeden einzelnen Fall individuell zu bestimmen. Die Detektion der Sonden erforderte ein Antikörpersystem und DAB-Färbung.

Es zeigte sich, dass mit der Methode die Geschlechtsbestimmung des untersuchten Individuums möglich war. In der Kontrollgruppe entsprachen die dargestellten Chromosomen jeweils dem Geschlecht des untersuchten Probanden. Im Gegensatz zu den sonst zur Anwendung kommenden Verfahren, war es möglich, die Veränderungen in definierten Gewebestukturen nachzuweisen. Unterschiede im Genotyp sowie Mosaiksituationen einzelner Zellpopulationen konnten direkt am Gewebeschnitt aufgedeckt werden. In den Fällen mit Gonadendysgenesie wurden die uns als zytogenetische Analyse bekannten Karyotypen mit der hier angewendeten Methode bestätigt. Obwohl histologisch eindeutig weiblich differenzierte Anteile in den Gonaden vorlagen, waren auch in diesen Strukturen Y-Chromosomen nachzuweisen. Besonders hervorzuheben ist die Anwesenheit des Y-Chromosoms in Keimzellen weiblicher Probanden. Es konnte somit festgestellt werden, dass (1) die humangenetischen Befunde mit unseren Ergebnissen übereinstimmen, (2) die jeweiligen Chromosomen sowohl in den männlichen, wie auch in den weiblichen Gewebekomponenten vorkommen und (3) das vorhandene Mosaik in allen untersuchten Geweben nachzuweisen war. Bezüglich der Verteilung wurden Unterschiede zwischen den verschiedenen Syndromen festgestellt: Bei der gemischten Gonadendysgenesie bzw. beim Ullrich-Turner-Syndrom zeigte sich eine einheitliche Verteilung wähernd in der Gruppe mit Hermaphroditismus dagegen weniger Y-Chromosomen im Ovar als in den testikulären Strukturen zu finden waren.

Bei der Untersuchung der Tumore zeigte sich dass der dargestellte Chromosomensatz in allen untersuchten Fällen dem Geschlecht des Trägers entspricht, wobei an reifen Teratomen keine Veränderungen festzustellen waren. Dagegen wiesen die malignen Tumoranteile deutliche Aneuploidien auf. Bei den gemischten Tumoren waren die reifen Anteile ebenso wie die unreifen Gewebeanteile betroffen.

Die Untersuchung der Gonadendysgenesien zeigt, dass für die genaue Definition eines Mosaikzustandes die Kombination verschiedener Untersuchungsmethoden notwendig ist. Dabei waren Unterschiede zwischen den verschiedenen Syndromen zu erkennen. Dennoch ist eine allgemein gültige Aussage anhand des kleinen Kollektivs nicht möglich. Ob hier stets ein Unterschied in der Verteilung der Chromosomen vorliegt, kann nur bei der Untersuchung eines weitaus größeren Fallzahl beurteilt werden. Aus dem Vergleich der Ergebnisse zwischen dem Hermaphroditismus und der gemischten Gonadendysgenesie folgt jedoch, dass die Diagnose in Fällen mit „Übergängen“ zwischen diesen Krankheitsbildern durch die In Situ-Hybridisierung erweitert werden könnte. Dennoch lassen die mit der In Situ-Hybridisierung gewonnen Ergebnisse Rückschlüsse zu: (1) Der Anteil an Sertolizellen, die (bei einer Mosaiksitiuation) ein Y-Chromosom tragen, kann bei histologisch sonst unauffällig Hoden etwas über dessen Funktion aussagen. (2) Durch eine Probebiopsie bei unklarem Chromosomenbefund kann die Y-Zellinie direkt in der Gonade nachgewiesen, und somit die Indikation zur Gonadektomie gestellt werden. (3) Eine Beurteilung der Phänotyp-Karyotyp-Korrelation bei Patienten mit Gonosomenmosiken ist aufgrund der großen klinischen Variabilität schwierig. Nach vorausgegangener Gonadektomie kann die In Situ- Hybridisierung Auskunft über die Verteilung der Chromosomen in der Gonade geben. So kann deren Funktion und deren Einfluss auf die Geschlechtsentwicklung näher beurteilt werden