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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-29115
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2006/2911/


Charakterisierung der Omega-Glutathion S-Transferase CeGSTO-1 und des Elongationsfaktors der Translation CeEF-1 gamma bei Caenorhabditis elegans (Maupas, 1900)

Burmeister, Cora

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SWD-Schlagwörter: Glutathion , Glutathiontransferasen , Oxidativer Stress , Caenorhabditis elegans , Elongationsfaktor , Kristallisation , RNS-Interferenz
Freie Schlagwörter (Deutsch): Omega-GST
Freie Schlagwörter (Englisch): glutathione, GST, oxidative stress , stress response
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Liebau, Eva (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.04.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 22.05.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Zum Schutz vor oxidativem Stress und den dadurch verursachten Schäden besitzen aerob lebende Organismen eine Vielzahl von antioxidativen Systemen. Eines der Hauptabwehrsysteme gegen toxische endogene und xenobiotische Substanzen stellen die Glutathion S-Transferasen (GSTs) dar. Sie sind wichtige Phase II Entgiftungsenzyme, die die Biotransformation von lipophilen und schwer ausscheidbaren Substanzen in weniger reaktive, weniger toxische und leichter ausscheidbare Stoffe katalysieren. Diese Reaktion erfolgt durch die Konjugation des elektrophilen Substrats mit dem reduzierten Tripeptid Glutathion (GSH).
Eine der cytosolischen GST-Klassen ist die erst kürzlich entdeckte Omega-Klasse, die wesentliche strukturelle und funktionelle Besonderheiten gegenüber anderen GST-Klassen aufweist und Ähnlichkeiten zu Thioredoxinen besitzt.
In dieser Arbeit wurde die Omega-GST CeGSTO-1 (28,5 kDa) des Modellnematoden Caenorhabditis elegans charakterisiert. Das Enzym besitzt sowohl die für Omega-GSTs typische N-terminale Verlängerung als auch einen Cysteinrest im aktiven Zentrum. Die CeGSTO-1 bindet nicht an Glutathion(GSH)-Agarose, zeigt allerdings eine gute Bindung an S-Hexyl-GSH-Agarose. Enzymtests mit rekombinant exprimierter CeGSTO-1 wiesen als höchste Aktivitäten eine Thioltransferase-Aktivität und Dehydroascorbat-Reduktase-Aktivität auf. Die CeGSTO-1 wurde als Fusionsprotein mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) unter der Kontrolle des cegsto-1-Promotors in C. elegans exprimiert und konnte in allen postembryonalen Stadien exklusiv in den Darmzellen lokalisiert werden. Dieses Ergebnis wurde durch immunhistologische und elektronenmikroskopische Versuche bestätigt. Mittels GFP-Deletionskonstrukten konnte ein Minimalpromotor von ca. 300 bp bestimmt werden. Die Deletionsversuche und die Mutagenese der GATA-Box im 5´-Bereich von cegsto-1 zeigten die direkte Beteiligung dieser Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle an der intestinalen Expression von CeGSTO-1. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass der cegsto-1-Promotor durch oxidativen Stress induzierbar ist.
Die Schutzfunktion der CeGSTO-1 vor oxidativem Stress konnte mit Hilfe eines „Hemmhoftest“ in E. coli nachgewiesen werden. Dabei waren die Bakterien, die CeGSTO-1 enthielten, resistenter gegen verschiedene Stressoren, dabei ist GSH essentiell an diesem Entgiftungsprozess beteiligt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass dem aktiven Cysteinrest in der GSH-Bindungstasche der CeGSTO-1 eine wichtige funktionelle Bedeutung zukommt. Zur Untersuchung der Entgiftungsfunktion der CeGSTO-1 in C. elegans wurden transgene Würmer hergestellt, die die Omega-GST überexprimierten. Unter Einfluss oxidativer Stressoren überlebten dreimal so viele Überexpressionswürmer wie Kontrolltiere, was eindeutig zeigte, dass CeGSTO-1 eine erhöhte Resistenz vor oxidativem Stress vermittelt. Diese Ergebnisse wurden durch Versuche mit RNA-Interferenz (RNAi) gestützt, wobei die RNAi-Würmer im Vergleich zu Kontrollwürmern eine stark erhöhte Sensitivität gegenüber oxidativem Stress aufwiesen.

Der eukaryotische Elongationsfaktor der Translation eEF-1g besitzt im N-Terminus eine hohe Homologie zu der GSH-Bindungsstelle von GSTs. Es wird vermutet, dass der eEF-1g eine interne Entgiftungsfunktion besitzt bzw. an Redoxprozessen beteiligt ist. Während des Elongationsprozesses der Translation assoziiert der eEF-1g mit dem GDP/GTP-Austauschprotein eEF-1b und der Untereinheit eEF-1d, die zusammen Energie in Form von GTP an die Untereinheit eEF-1a liefern. Dadurch katalysiert der eEF-1-Komplex die Übertragung des Aminosäurerestes der tRNA auf die entstehende Proteinkette.
In meiner Diplomarbeit (August 2002) wurde mit der Charakterisierung des CeEF-1g von C. elegans begonnen und im Rahmen der vorliegenden Dissertation fortgeführt.
Zur Untersuchung einer möglichen GST-Aktivität wurde das Gen ceef-1g in C. elegans überexprimiert. Dabei ließ sich feststellen, dass der aus C. elegans aufgereinigte Faktor – ebenso wie der rekombinant in E. coli exprimierte – keine Enzymaktivität aufzeigte. Des Weiteren konnte eine spezifische und konzentrationsabhängige Protein-Protein-Interaktion der beiden rekombinanten Untereinheiten CeEF-1g und CeEF-1b mittels Biacore-Analyse beschrieben werden.
Um zu überprüfen, ob der gesamte CeEF-1-Komplex GST-Aktivität aufweist, wurde er aus C. elegans aufgereinigt. In einem anschließenden Enzymtest war es möglich, eine moderate GST-Aktivität zu bestimmen. Somit geben diese Versuche erste Hinweise darauf, dass dem CeEF-1g im Zusammenhang mit anderen Untereinheiten eine interne Entgiftungsfunktion zukommt.

Im Rahmen dieser Arbeit war eine Kristallisation der CeGSTO-1 nicht möglich, daher wurde stellvertretend für sie die GST1 von Plasmodium falciparum kristallisiert. Hierbei konnte die GST-typische Struktur beschrieben und eine Bindung des Inhibitors S-Hexyl-GSH an der Kristallstruktur gezeigt werden.
Kurzfassung auf Englisch: Oxidative stress provokes various responses and many genes participate in the antioxidant defensive system, including the omega class glutathione S-transferase (GSTs). The GST-1 from C. elegans CeGSTO-1 is a member of the GST superfamily that utilizes glutathione in reactions contributes to the biotransformation and disposition of many compounds, including drugs, carcinogens, and products of the oxidative stress.
Detailed biochemical analysis of the substrate specifity and kinetics of recombinant CeGSTO-1 expressed in E. coli revealed high thiol transferase and dehydroascorbate reductase activity. By "halo assay" I showed that the survival of bacteria, overexpressing CeGSTO-1, significantly increased under several stress conditions. Furthermore, I detected that under oxidative stress conditions mRNA levels of CeGSTO-1 were highly upregulated in C. elegans.
By microinjection of different CeGSTO-1-promoter green fluorescent protein constructs, the protein localized exclusively in the intestine of all post-embryonic stages in C. elegans. Furthermore, mutation analysis demonstrated the involvement of a GATA-box in basic expression. Transgenic C. elegans overexpressing CeGSTO-1 exhibited an increased resistance under paraquat/cumene hydroperoxide-induced oxidative stress and - as expected - the specific silencing of the CeGSTO-1 by RNA-interference (RNAi) created worms with an increased sensitivity towards several prooxidants.

The eucaryotic elongationfactor of translation CeEF-1g
showed a high homology to the glutathione-bindingsite of GSTs. In this work it was possible to show protein-protein-interaction with the elongation subunit EF-1b. GST-activity could not be detected in CeEF-1g (not in CeEF-1g purified from transgenic C. elegans and not in recombinantly expressed CeEF-1g in E. coli), but it was possible to purify the elongation complex from C. elegans and to obtain low GST-activity in the whole complex.
Furthermore the GST1 from Plasmodium falciparum was crystallized.





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